microrna Cinzia Di Pietro Dipartimento GF Ingrassia Biologia, Genetica e Bioinformatica G. Sichel Università degli Studi di Catania dipietro@unict.

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1 microrna Cinzia Di Pietro Dipartimento GF Ingrassia Biologia, Genetica e Bioinformatica G. Sichel Università degli Studi di Catania dipietro@unict.it

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3 I MicroRNAs (mirnas) sono dei piccoli RNAs non codificanti (21 25 nucleotidi) che regolano negativamente l espressione genica a livello post-trascrizionale.

4 Regolazione dell espressione genica mirna

5 DIFFERENZE TRA TRASCRITTOMA E PROTEOMA elettroforesi bidimensionale di proteine Microarray di cdna Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

6 Riconoscono e si legano a sequenze localizzate nelle regioni 3 non tradotte (3 UTR) di specifici mrnas ed effettuano un meccanismo di hetero-silencing degradando il messagero target o bloccando la traduzione.

7 Lo stesso mirna può avere come bersaglio differenti mrnas; Differenti mirnas possono avere come bersaglio lo stesso mrna.

8 WHAT IS A microrna? MicroRNAs (mirnas) are endogenous ~22 nt long RNAs that can play important regulatory roles in animals and plants by targeting mrnas for cleavage or translational repression. By this way they can influence the output of many protein-coding genes. [David P. Bartel, Cell, Vol. 116, , January 23, 2004]

9 La regolazione dell espressione genica è alla base della complessità cellulare La complessità di un organismo non correla necessariamente con il numero di geni

10 Create cellular complexity by differential genes expression This form of combinatorial coding endows an organism with n genes to create, in theory, 2 n different cell-specific gene batteries. This rationalization provides an easy explanation for the fact that the absolute number of genes in a genome does not correlate with organismal complexity Hobert (2004) TIBS

11 Hobert (2004) TIBS

12 La loro scoperta risale al 1993; Il primo mi-rna (lin-4) fu identificato in C.elegans. Regola l espressione di mrnas coinvolti nello sviluppo embrionale del nematode; Successivamente furono ritrovati sia nelle piante che negli animali Oggi si ritiene che il numero complessivo di geni codificanti per mi-rna rappresenti circa lo 0.5-1% del numero di geni codificanti per proteine

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16 Le sequenze nucleotidiche dei mirna si sono conservate nel corso dell evoluzione; I loro geni possono essere localizzati sia in regioni intergeniche che all interno di geni di seconda classe (di solito in introni o in esoni non tradotti; Molte volte troviamo cluster di geni; Vengono trascritti (RNA pol II) quindi in modo indipendente o contemporaneamente al gene che li ospita; Subiscono un processo di maturazione sia nucleare che citoplasmatico.

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18 mirna GENOMICS: INTERGENIC; INTRONIC; EXONIC AND Zhao Y and Srivastava D, 2007

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20 microrna BIOGENESIS Il processo di maturazione dei mirna è estremamente complesso TRASCRIZIONE Pri-miRNA MATURAZIONE NUCLEARE Pre-miRNA TRASPORTO NEL CITOPLASMA MATURAZIONE CITOPLASMATICA mirna maturo

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22 Generalmente i geni codificanti per mirna sono trascritti nel nucleo dalla RNA-polimerasi II che dà vita a lunghi trascritti, i pri-mirna, che presentano il cap e la poliadenilazione. Questi ultimi vengono processati da un RNasi III, Drosha,e dal suo cofattore, Pasha. Si ottengono così trascritti di circa 70 nucleotidi, detti pre-mirna Successivamente le proteine RAN-GTP ed exportin 5 trasportano i pre-mirna dal nucleo al citoplasma. Un altra RNasi III, Dicer, li processa per generare molecole di RNA duplex di circa 22 nucleotidi. Queste molecole vengono caricate nel complesso mirisc(mirna-associated multiprotein RNA-induced silencing complex). I mirna maturi a singolo filamento vengono poi mantenuti all interno del complesso. I mirna possono avere due modi diversi d agire a seconda della complementarietà che vi è tra il mirna e il suo target. Complementarità perfetta: degradazione dell mrna. Complementarità imperfetta: blocco della traduzione.

23 Il ruolo biologico dei mirna è associato al ruolo dei loro mrna target Ligands Cell-surface receptors Intracellular central signaling proteins Nuclear proteins Fraction of mirna target 9.1% (3/33) 31.2% (122/391) 18.8% (15/80) 50.0% (19/38) Cui Q. er al, 2006 modified

24 MAIN FUNCTIONS OF mirnas Cell proliferazion; Cell death; Fat Metabolism In Flies (Brennecke et al., 2003; Xu et al., 2003) Neuronal patterning In Nematodes (Johnston and Hobert, 2003) Modulation of Hematopoietic Lineage differentiation In Mammals (Chen et al., 2004) Control of Leaf and Flower Development In plants (Palatnik et al., 2003)

25 microrna FUNCTIONS: SOME EXAMPLES mir-125b CONTROLS PROLIFERATION OF DIFFERENTIATED CELLS; mir-181 IS INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF MAMMALIAN HAEMATOPOIETIC CELLS TOWARDS THE B-CELL LINEAGE; mir-375 IS INVOLVED IN MAMMALIAN PANCREATIC ISLET-CELL DEVELOPMENT AND IN THE REGULATION OF INSULIN SECRETION; mir-143 IS INVOLVED IN MAMMALIAN ADIPOCYTE DIFFERENTIATION; mir-1 PARTICIPATES IN MAMMALIAN HEART DEVELOPMENT

26 Dal ruolo biologico al coinvolgimento in patologie

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29 Correlation analysis between DNA copy number alteration and mirna expression. Zhang L et al. PNAS 2006;103: Correlation analysis between DNA copy number alteration and mirna expression. (A C) Expression of mature mirna transcripts (by TaqMan mirna assay) and DNA copy number of loci containing the specific mirna (by acgh) in 16 ovarian cancer cell lines. (A) Higher magnification of mir-15a and mir-15b maps. Each spot represents a cell line. Expression levels of mature mirna transcripts are presented in the upper lane as a heat map in 16 cell lines. DNA status is presented in the lower lane (red, DNA copy number loss; green, DNA copy number gain). Cell lines are ranked based on DNA status (leftmost, amplified; middle, normal; rightmost, deleted gene copy). (B) mirna genes (n = 57) showing concordance between DNA copy number alterations and mirna transcript expression. (C) mirna genes (n = 21) showing no concordance. (D) Comparison of mirna acgh data from the present tumor set with expression data of 28 mirnas overexpressed in a different breast cancer set, as reported by Iorio et al. (50). mirna genes with normal DNA copy number are marked in gray; gains are marked in green, and losses in red. mirna transcript overexpression (relative to normal breast) is marked in pink; underexpression (relative to normal breast) is in blue (50) by National Academy of Sciences

30 micrornas CAN FUNCTION AS TS AND OG

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33 I mirna sono presenti in diversi fluidi biologici. La loro espressione correla con specifici fenotipi patologici. Possono essere utilizzati come biomarcatori non invasivi di patologie. Possono essere utilizzati a scopo terapeutico.

34 The MicroRNA Spectrum in 12 Body Fluids, Clinical Chemistry (2010) Jessica A. Weber,1 David H. Baxter,1 Shile Zhang,1 David Y. Huang.

35 Possono essere liberati da una cellula dopo lisi Possono essere secreti mediante: Microvescicole (> 100 nm) Esosomi (<100 nm)

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38 DIAGNOSI Analizzando il loro profilo di espressione nel siero di pazienti e paragonandolo con controlli sono stati trovati mirna up o down regolati specificatamente in determinate patologie. Possibilità di utilizzarli come marcatori precoci, non invasivi di patologie oppure come marcatori di risposta a determinate terapie farmacologiche.

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40 TERAPIA Possibilità di inserire in particolari vettori e veicolarli in cellule bersaglio: mirna sintetici (nel caso di mirna specificatamente down-regolati) Antogomir (nel caso di mirna specificatamente up-regolati)

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43 Tecniche di laboratorio

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