STAYFRESH, RICERCA SU IV GAMMA

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1 STAYFRESH, RICERCA SU IV GAMMA Antimicrobici naturali e colture di biocontrollo per l estensione della shelf-life della valerianella di IV gamma Rosalba Lanciotti Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari Università degli Studi di Bologna Centro Interdipartimentale di Ricerca Industriale Agroalimentare

2 Miglioramento della aumento della sicurezza, della shelf-life, della qualità e della funzionalità dei prodotti Messa a punto di metodi alternativi di sanificazione Problematiche dei prodotti alternativi in uso problematiche connesse con disinfettanti a base di cloro Bassa efficacia antimicrobica; corrosivi; irritanti; formazione di composti pericolosi; patogeni emergenti resistenti; banditi da alcuni paesi europei Utilizzo di antimicrobici naturali e colture di biocontrollo PRODOTTI VEGETALI DI IV GAMMA Shelf-life e sicurezza : basate su riduzione del carico microbico mediante lavaggio e mantenimento della catena del freddo Componenti essenziali di una dieta sana ed equilibrata Mercato con enormi opportunità di crescita Shelf-life ridotta; frequenti contaminazioni con microrganismi patogeni

3 Unità operativa UNIBO: obiettivo generale Riduzione della concentrazione di cloro nelle acque di lavaggio e prolungamento della shelf life di mele (Malus communis, var. Golden Delicious) e Valerianella locusta Laterr. mediante l impiego oli essenziali o loro componenti in combinazione o meno con colture di biocontrollo specificatamente selezionate

4 Oli essenziali e loro costituenti Attività antimicrobica Ampio spettro d azione GRAS secondo FDA, ammessi come additivi alimentari nel 2011 da EFSA, consentiti anche dalla legislazione giapponese Azione antiossidante Basso costo Green consumerism Nel settore alimentare vengono usati come aromatizzanti, antiossidanti e antimicrobici Ma impiego subordinato a: Compatibilità organolettica Standardizzazione della composizione in termini di molecole attive Comprensione dei meccanismi d azione Valutazione delle possibilità di applicazione nel prodotto (interazione con i componenti dell alimento, attività durante la conservazione ) e nelle condizioni reali di processo e di conservazione letteratura evidenzia ottime potenzialità applicative in prodotti di IV gamma

5 Colture protettive: selezionate soprattutto nell ambito dei batteri lattici AGENTI DI BIOCONTROLLO Inibizione di microrganismi patogeni e degraditivi Competizione Produzione di sostanze antimicrobiche Ma Limitatissimo effetto sulle caratteristiche sensoriali; GRAS; lunga storia d uso Acidi organici, batteriocine, diacetile, acetoino, idrossiacidi

6 Obiettivi specifici per la valerianella di IV gamma Valutazione degli effetti di diversi antimicrobici naturali addizionati in fase lavaggio sulla sicurezza e sulla shelf life di Valerianella locusta Laterr. in rapporto all atmosfera di confezionamento e alle condizioni di processo adottate Isolamento, identificazione e caratterizzazione tecnologica di batteri lattici da usare come agenti di biocontrollo in combinazione o meno con antimicrobici naturali Individuazione delle soluzioni bio-tecnologiche ottimali (agenti antimicrobici più efficaci, colture di biocontrollo più attive e condizioni di processo più appropriate) sulla base delle prove di laboratorio Scaling up a livello aziendale (in collaborazione con SIPO srl) Studio dei meccanismi d azione delle sostanze utilizzate su microrganismi patogeni, degradativi e agenti di biocontrollo

7 Protocollo di lavorazione valeriana Valerianella locusta Laterr reperita sul mercato locale Oli essenziali e loro miscele utilizzate Olio di origano (250ppm) Olio di timo (250ppm) Olio di origano + Olio di timo ( ppm) Olio di origano + Carvacrolo ( ppm) Prove di Laboratorio oli essenziali Lavaggio 2 min con acqua di rete con 120 ppm cloro Agitazione manuale, 8 C (Valeriana:acqua, 1:10 p/v) Sgrondatura prelevando la valeriana con il cestello di una centrifuga domestica Centrifugazione (30 s) Movimentazione manuale della valeriana posta nel cestello della centrifuga domestica Centrifugazione (30 s) Confezionamento in buste a media permeabilità (valeriana: spazio di testa, 1:1) Conservazione, 4-6 C Analisi effettuate valutazione della microflora naturalmente presente (degradativa e patogena) Analisi del profilo in molecole volatili Analisi dell indice di appassimento e di colore

8 Risultati: Nessuna differenza significativa per il carico di microrganismi degradativi (mesofili aerobi totali, batteri lattici, lieviti, batteri sporigeni) in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata Nessuna differenza significativa per presenza di microorganismi patogeni in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata. Nessuna differenza significativa degli indici colorimetrici dopo 8 giorni di conservazione in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata Prove di Laboratorio oli essenziali Fre sh Withe red Ma perdita di turgidità dopo 3 giorni di conservazione nei campioni lavati con timo/origano e dopo 5 giorni nei campioni lavati con origanocarvacrolo.

9 Prove di Laboratorio oli essenziali Analisi dei dati GC-MS-SPME mediante PCA

10 Ottimizzazione del protocollo di lavorazione della valeriana O 13 C Olio essenziale di timo o olio essenziale di origano Prove di Laboratorio oli essenziali Analisi effettuate valutazione della microflora naturalmente presente Analisi del profilo in molecole volatili e naso elettronico Analisi dell indice di appassimento e di colore

11 Prove di Laboratorio oli essenziali Risultati dopo ottimizzazione

12 C map T0 C map T3 C map T8 C map T10 Prove di Laboratorio oli essenziali Oregano T0 Oregano T3 Oregano T8 Oregano T10 Thyme T0 Thyme T3 Thyme T8 Thyme T10

13 L analisi PCA dei profili rilevati mediante naso elettronico ha raggruppato i campioni sulla base del tempo di stoccaggio e non in relazione all olio essenziale impiegato Prove di Laboratorio oli essenziali

14 AGENTI DI BIOCONTROLLO Isolamento, identificazione e caratterizzazione in vitro, di potenziali agenti di biocontrollo Isolamento di batteri lattici da prodotti commerciali, durante lo stoccaggio e alla fine della shelf life Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo 15 isolati da valeriana

15 a Symbols: -No inhibition zone; +small inhibition zone (0.5 to 1 mm); ++medium inhibition zone (1 to 2 mm); +++large inhibition zone (>2mm) Temperature NaCl a ph b Strain Identification 30 C 15 C 8 C 4 C 2% 4% 6% 4,5 4 3,5 V9 L. plantarum / L. pentosus V4B6 Lactobacillus plantarum/acidophilus V7 Lactobacillus plantarum V7B3 Lactobacillus plantarum V4B5 Lactobacillus plantarum V4B4 Lactobacillus casei Inhibition of indicator strains a Strain Identification E.coli Salmonella Listeria V 7 Lactobacillus plantarum V4B4 Lactobacillus casei V4B5 Lactobacillus plantarum V4B6 Lactobacillus plantarum/acidophilus V7B3 Lactobacillus plantarum V9 L. plantarum / L. pentosus a simboli: -No alone di inibizione; +piccolo alone di inibizione (da 0.5 a 1 mm); ++alone di inibizione medio (da 1 a 2 mm) +++ampio alone di inibizione (>2mm) Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo 6 ceppi identificati (sequenziamento regione 16S rrna) Lactobacillus casei/paracasei/rhamnosus (1 ceppo) e Lactobacillus plantarum (5 ceppi). Nessuno dei ceppi produceva batteriocine ma alcuni erano capaci di inibire S. enteritidis E5, L. monocytogenes Scott A and E. coli 555. Le migliori performances: L. casei (V4B4); L. plantarum V7B3 e V4B5

16 Uso dei batteri lattici selezionati V7B3 (Lb. plantarum) V4B4 (Lb. casei/paracasei) Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo Inoculo del LAB (7 log UFC/ml) e/o dei batteri patogeni (Listeria monocytogenes e Escherichia coli, 3-4 log UFC/ml) nella fase di lavaggio Analisi effettuate Shelf-life Sicurezza Colore texture Selezione dell agente di biocontrollo migliore

17 Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo Agenti di biocontrollo L. casei V4B4 e L. plantarum V7B3 hanno mostrato una eccellente adattabilità alle condizioni stringenti del sistema (carico costante durante tutto il periodo di conservazione) Dopo 9 giorni il carico in mesofili aerobi totali era compreso tra 6.5 and 7.5 log CFU/g. I più bassi livelli sono stati rilevati nei campioni di controllo ed in quelli trattati con L. plantarum V7B3 L inoculo degli agenti di biocontrollo selezionati non influenza in maniera significativa colore e texture

18 Effetto degli agenti di biocontrollo su E. coli (a) L. monocytogenes (b) A log cfu/g pathogens V4B4+pathogens V7B3+pathogens chlorine+pathogens VRB7 stesso effetto del cloro su cinetica di morte di E. coli ma maggiore efficacia nei confronti di L. monocytogenes time (d) B Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo log cfu/g time (d) pathogens V4B4+pathogens V7B3+pathogens chlorine+pathogens

19 Impiego dell agente di biocontrollo selezionato e di olio di timo V7B3 (Lb. plantarum) o olio di timo 250 ppm Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo Inoculo del LAB (7 log UFC/ml) e/o dei batteri patogeni (Listeria monocytogenes e Escherichia coli, 3-4 log UFC/ml) nella fase di lavaggio Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi degradativi e patogeni); colore; profili in molecole volatili; naso elettronico; panel test Prove di Laboratorio oli essenziali

20 Mesofili aerobi totali Agente di biocontrollo e olio essenziale di timo di timo Mesofili aerobi totali : soglia di 7 log UFCg dopo 7 giorni nei campioni di controllo e nei campioni addizionati di agente di biocontrollo e dopo 15 gg in presenza dell olio essenziale di timo. Analisi sensoriale dopo 5 gg di stoccaggio: nessuna differenza significativa per odore, colore, texture..) V7B3+ timo stessa efficacia del cloro nei confronti di E. coli e L.monocytogenes A B Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo log cfu/g Chlorine+pathogens V7B3+thyme EO+pathogens Thyme EO+pathogens pathogens time (d) log cfu/g time (d) E. coli L. monocytogenes Chlorine+pathogens V7B3+thyme EO+pathogens Thyme EO+pathogens pathogens Prove di Laboratorio oli essenziali

21 Uso combinato di antimicrobici naturali con un ceppo di Lactococcus lactis produttore di nisina per migliorare la sicurezza e la shelf life delle mele di IV gamma Screening per la selezione di un ceppo di Lc. lactis produttore di nisina Z Caratterizzazione tecnologica e valutazione dell attività antimicrobica del ceppo Lc. lactis CBM21 Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo Effetti della combinazione Lc. lactis CBM21 + olio essenziale di timo sulla qualità di valerianella di IV gamma Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi degradativi e patogeni inoculati); colore; profili in molecole volatili; naso elettronico Prove di Laboratorio oli essenziali

22 Risultati più significativi: Riduzione del carico dell agente di biocontrollo durante la conservazione (circa 1 ciclo log dopo 10gg) Ma effetto significativo sul carico dei mesofili aerobi totali: questi non superavano 7 log UFC/g dopo 15 gg di conservazione in presenza dell agente di biocontrollo Anche la presenza di olio essenziale di timo incrementava la shelf-life (soglia di alterazione superata dopo 14 gg) Nei controlli la soglia di alterazione veniva superata dopo 7 gg Stessa efficacia del cloro nei confronti di E. coli e L. monocytogenes deliberatamente inoculati Prove di Laboratorio- Agenti di Biocontrollo la presenza della coltura di biocontrollo e dell olio essenziale di timo non influiscono significativamente sul colore del prodotto e sulle caratteristiche organolettiche del prodotto Prove di Laboratorio oli essenziali

23 SCALING UP presso SIPO Condizioni adottate nella fase di lavaggio: 1) LAVAGGIO CON 120 PPM DI CLORO 2) USO COMBINATO LC. LACTIS CBM21 (7 log ufc/ml ) E OLIO ESSENZIALE DI TIMO 3) OLIO ESSENZIALE DI TIMO UTILIZZATO SINGOLARMENTE 4)LC. LACTIS CBM21 UTILIZZATO SINGOLARMENTE Scaling up- Agenti di Biocontrollo Valutazione comparativa tra i diversi campioni Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi degradativi e patogeni naturalmente); colore; profili in molecole volatili; naso elettronico; panel test Scaling up oli essenziali

24 Colore e indice di appassimento Nessuna differenza significativa neppure per a* e b*, tra i diversi campioni durante l intero periodo di stoccaggio a 6 C Nessuna differenza per indice di appassimento

25 Carico dei lattici durante la conservazione refrigerata Lieviti e coliformi totali: nessuna differenza significativa: carico sempre minore di 3 e 2 log ufc/g rispettivamente Scaling up- Agenti di Biocontrollo Mesofili aerobi totali: nessuna differenza significativa nel CARICO durante la conservazione in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata Scaling up oli essenziali

26 Test di preferenza I campioni addizionati con timo e/o lattico risultavano preferiti dagli assaggiatori indipendentemente dal tempo di stoccaggio considerato rispetto ai controlli trattati con cloro

27 MECCANISMI DI RISPOSTA DEI PATOGENI E DEGLI AGENTI DI BIOCONTROLLO RISPETTO AGLI ANTIMICROBICI NATURALI Importanza applicativa evitare meccanismi di resistenza individuazione dei meccanismi di risposta uso consapevole degli antimicrobici naturali a livello industriale Determinazione dei cambiamenti nelle membrane citoplasmatiche Determinazione delle molecole volatili rilasciate Espressione genica Effetto di concentrazioni subletali di olio essenziale di timo, olio essenziale di origano, carvacrolo e timolo su composizione degli acidi grassi di membrana e sul rilascio di molecole volatili da parte di L. monocytogenes, E. coli e S. enteritidis Studio dei cambiamenti nell espressione genica di E. coli e Lc. lactis esposti a concentrazioni subletali di olio essenziale di timo e carvacrolo.

28 Determinazione dei cambiamenti nelle membrane citoplasmatiche Determinazione delle molecole volatili rilasciate Le molecole testate inducono chiare modificazioni sia al profilo degli acidi grassi di membrana che al rilascio di specifiche molecole volatili. I cambiamenti avvengono durante la crescita microbica e dipendono dalla molecola testata, dalla sua concentrazione e dal microrganismo testato Risposta comune: incremento degli acidi insaturi e di specifici acidi grassi liberi

29 Espressione genica Studio dei cambiamenti nell espressione genica di E. coli e Lc. lactis esposti a concentrazioni subletali di olio essenziale di timo e carvacrolo. I cambiamenti nell espressione genica di Lc. lactis e E. coli sono stati studiati tramite microarray. Stress applicato: ½ del valore della MIC Principali classi dei geni up regolati o down regolati in E. coli e Lc. lactis : Ribosomi Sintesi degli acidi grassi Metabolismo energetico Metabolismo e trascrizione di purine e pirimidine Proteine ipotetiche Proteine associate agli stress (termico e acido), detossificazione e protezione delle cellule Proteine di trasporto Metabolismo degli amminoacidi Metabolismo secondario

30 CONCLUSIONI Prove di laboratorio L olio essenziale di timo ha dimostrato un attività antimicrobica assolutamente comparabile con quella del cloro senza significativi peggioramenti dei parametri di colore e dell indice di appassimento. L ottimizzazione delle condizioni di processo e l inclusione di colture di bio controllo hanno consentito di migliorare ulteriormente la qualità dei prodotti in termini di shelf-life e di sicurezza. L associazione dell olio essenziale di timo con batteri lattici è risultata quella migliore accelerando le cinetiche di morte di L. monocytogenes e E. coli quando deliberatamente inoculati nei prodotti e dimostrando un efficacia analoga a quella del cloro. Prove in azienda Olio essenziale di timo e coltura di biocontrollo: effetti non significativamente diversi dal cloro su microrganismi patogeni e degradativi ma prodotti più apprezzati dagli assaggiatori!!!!!

31 Conclusioni Nell ambito del progetto Stayfresh sono state individuate soluzioni biotecnologiche di lavaggio di valerianella idonee alla sostituzione del cloro Ma le condizioni di lavaggio individuate possono essere migliorate con ulteriori studi: Per ottimizzare le modalità di inoculo degli agenti di biocontrollo per comprendere appieno interazioni tra agente di biocontrollo e/o olio essenziale di timo e microbiota (pirosequenziamento) Per comprendere i meccanismi di azione nei confronti di altri microrganismi patogeni e degradativi

32 Ringraziamenti Dr M. Ceccarini e L. Alessandrini Sipo srl Gruppo della prof.ssa S. Torriani (Departmento di Biotecnologia dell Università di Verona) Gruppo del prof. J. KoK (Department of Genetics of Groningen University) Gruppo di Dr L. Putignani (Bambin Gesù, Roma) Gruppo del prof. M. Dalla Rosa (Campus di Scienze degli Alimenti - Università di Bologna)

33 Gruppo di Microbiologia degli Alimenti Campus di Scienze degli Alimenti, Università di Bologna Grazie per l attenzione