Esposizione ai Tricoteceni dei bambini in età prescolare e scolare

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1 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Veterinarie per la Sicurezza Alimentare VSA Via Celoria, Milano Fracchiolla M.L., Arioli F., Vallone L. Dragoni I., Pompa G. Esposizione ai Tricoteceni dei bambini in età prescolare e scolare INTRODUZIONE I tricoteceni sono un gruppo di micotossine con una struttura chimica comune costituita da un sesquiterpene tetraciclico e sono classificati, in base alla presenza o all assenza di gruppi funzionali caratteristici, come Tipo A (tossina T-2, tossina HT-2, diacetossiscirpenolo (DAS) e monoacetossiscirpenolo) e Tipo B (deossinivalenolo (), nivalenolo (NIV), 3- acetildeossinivalenolo (3-A), 15-acetildeossinivalenolo (15-A) e fusarenone X) (1,2). Queste micotossine sono prodotte da funghi del genere Fusarium, Cefalosporium, Myrothecium, Trichothecium e Stachybotris che sono ubiquitari e si sviluppano su tutti i cereali destinati sia all alimentazione umana che animale ed in particolare su mais, orzo e grano raccolti in stadi precoci di maturazione (umidi) ed immagazzinati senza adeguato essiccamento (3). I tricoteceni, prodotti da funghi del genere Fusarium, più frequenti nei cereali sono la tossina T-2, l HT-2, il ed il NIV. Il meccanismo d azione comune a tutte queste tossine consiste essenzialmente in una inibizione delle sintesi proteiche e del DNA (4). Si comportano quindi come potenti agenti citotossici soprattutto in tessuti caratterizzati da rapido turnover cellulare (epiteli germinativi, midollo osseo, tessuti linfopoietici). La diminuzione delle difese immunitarie oltre alla tossicità generale è quindi uno degli effetti più pericolosi conseguenti all esposizione a questo tipo di tossine. Infatti nell episodio di avvelenamento collettivo nell uomo denominato alimentary toxic aleukia è stata verificata una significativa correlazione tra esposizione alla tossina T-2 e a DAS per via alimentare (mais ammuffito) e l insorgenza di una patologia caratterizzata appunto dalla scomparsa nel sangue degli elementi della serie bianca (5). Un particolare aspetto della tossicità del consiste nella sua capacità di produrre rifiuto del cibo e vomito (il è chiamato anche vomitossina), effetti osservati soprattutto nel suino e dovuti ad effetti centrali (alterazione dell attività serotoninergica nel sistema nervoso centrale) e periferici (azione sui recettori periferici della serotonina) Recentemente (2002) il Comitato Scientifico Europeo (Scientific Committee on Food - SCF) (6), che si occupa di sicurezza degli alimenti ha definito, sulla scorta delle conoscenze scientifiche oggi disponibili una Dose Giornaliera Tollerata (TDI) per il (1 g/kg peso corporeo/giorno) e TDI provvisori (t-tdi) per il Nivalenolo (0,7 g/kg peso corporeo/giorno) e per la somma di T-2 e HT-2 (0,06 g/kg peso corporeo/giorno) (7, 8). Come abbiamo detto molti cereali destinati all alimentazione umana sono contaminati da tricoteceni. e, pertanto, rappresentano la via più importante di esposizione a queste micotossine per l uomo. Sotto il profilo del rischio sanitario, i bambini, a partire dallo svezzamento (baby food a base di cereali) sono però considerati la fascia di popolazione più a rischio sia perché i cereali hanno una notevole importanza nella loro dieta sia perché hanno, in proporzione al peso corporeo, un consumo di cereali più elevato rispetto agli adulti. Il rilevamento dell entità di esposizione dei bambini tramite gli alimenti a base di cereali rappresenta quindi un obiettivo di primaria importanza per la caratterizzazione del rischio relativo ai tricoteceni. L obiettivo del presente lavoro è appunto quello di caratterizzare il rischio da tricoteceni (, Nivalenolo, T-2, HT-2) nei bambini degli asili e delle scuole di Milano, rilevando la loro esposizione tramite i pasti preparati da Milano Ristorazione, società pubblica del Comune di Milano.

2 MATERIALI E METODI ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI DI PASTO Per l allestimento dei campioni sono stati utilizzati i pasti giornalieri destinati ai bambini degli asili nido e delle scuole elementari di Milano nel periodo primavera-estate Per l asilo nido sono stati analizzati i pasti offerti giornalmente ai bambini di età compresa tra 12 e 24 mesi mentre per le scuole quelli destinati a bambini delle elementari (6-10 anni). Gli alimenti utilizzati per la preparazione dei pasti destinati ai bambini dell asilo nido provenivano tutti da agricoltura biologica, mentre quelli delle scuole elementari provenivano sia da agricoltura biologica che convenzionale. Per ciascuna tipologia di pasto (asilo, scuola) giornalmente sono stati prelevati da un centro di cottura della ristorazione collettiva, gli alimenti a base di cereali (pasta, riso, pane, pizza) preparati per il consumo. Nel campionamento è stata considerata anche la merenda se questa era costituita da prodotti a base di cereali (focacce, torte, biscotti, crackers). Questo campione giornaliero veniva pesato omogeneizzato e liofilizzato. La raccolta dei campioni giornalieri si è protratta per 5 settimane. Con i campioni settimanali (5 campioni per settimana) sono stati allestiti dei pool rappresentativi dei pasti offerti settimanalmente ai bambini e su questi pool (5 per gli asili e 5 per la scuola) sono state eseguite le analisi per la ricerca dei Tricoteceni. ANALISI DEI TRICOTECENI Un aliquota di 25 grammi di campione, precedentemente macinato con griglia da 1 mm, è stata estratta con 100 ml di una soluzione Acetonitrile:Acqua (84:16) ed agitata per 90 minuti. Dopo filtrazione con filtro di carta, 10 ml dell estratto sono stati purificati con il kit Mycosep 227 (9). L eluato (2 ml) è stato purificato ed evaporato in corrente di azoto. Il residuo è stato derivatizzato con 0,2 ml di una miscela di Trimetilsilimidazolo e Trimetilclorosilano (1+ 0,2) per 15 minuti a temperatura ambiente ed al buio. Dopo l aggiunta di 0,8 ml di esano e 1 ml di acqua bidistillata, il campione è stato centrifugato per 3 minuti ed infine analizzato in GC-MS (Termoquest-Finnigan modello Polaris Q) con rivelatore a trappola ionica, con tecnica SIM (selected ion monitor) utilizzando una colonna capillare DB-5 (30m, diametro interno 0,25 mm) e un sistema di iniezione PTV solvent split con rapporto di splittaggio 1:30. I limiti di rilevabilità erano di 2 µg/kg per il ed il NIV e di 10 µg/kg per la T-2 e l HT-2, mentre quelli quantificazione erano rispettivamente di 10 µg/kg e 40 µg/kg. RISULTATI E DISCUSSIONE Dall esame dei risultati riportati nelle tabelle 1 e 2 emerge che nel 100% dei campioni esaminati era presente il con una concentrazione media (peso umido) di 45 µg/kg nei campioni del nido e di 82 µg/kg in quelli delle elementari, mentre gli altri Tricoteceni (tossina T-2, HT-2, NIV) non sono mai stati riscontrati.

3 Tabella 1: Concentrazione dei Tricoteceni (valori espressi in µg/kg peso umido) nel pasto a base di cereali destinato agli asili NIV Tossina T-2 Tossina HT ,8 n.d. n.d. n.d. 2 52,7 n.d. n.d. n.d. 3 38,1 n.d. n.d. n.d. 4 47,7 n.d. n.d. n.d. 5 39,6 n.d. n.d. n.d. Media 45,0 Tabella 2: Concentrazione dei Tricoteceni (valori espressi in µg/kg peso umido) nel pasto a base di cereali destinato alle scuole elementari NIV Tossina T-2 Tossina HT ,0 n.d. n.d. n.d ,5 n.d. n.d. n.d. 3 87,9 n.d. n.d. n.d. 4 62,6 n.d. n.d. n.d. 5 86,6 n.d. n.d. n.d. Media 82,0 I nostri risultati sono sostanzialmente in accordo con quanto riscontrato da altri autori in merito alla presenza dei diversi Tricoteceni nei prodotti alimentari a base di cereali. Infatti, in un recente lavoro (10) che offre una panoramica europea sulla contaminazione da Tricoteceni (, NIV, T-2, HT-2) in questi alimenti risulta che il era la micotossina riscontrata con maggiore frequenza (57%) mentre le altre micotossine erano presenti con una frequenza di gran lunga inferiore (NIV 16%; T-2 20%, HT-2 14%). Anche in uno studio condotto in Inghilterra per rilevare l incidenza dei vari processi di trasformazione (fermentazione, cottura ecc.) dei cereali sui livelli di Tricoteceni, è risultato che la presenza di raggiungeva nella maggior parte dei prodotti analizzati (pane, biscotti, farina di grano, polenta ecc) valori percentuali compresi tra l 80% ed il 95% Percentuali di frequenza analoghe sono state riscontrate anche in Germania in vari tipi di pane a base di grano ( 100%, NIV 5%, HT-2 0%, T-2 0%) a base di riso ( 79%, NIV 14%, HT-2, 0%, T-2 0%) e in pasta fresca ( 93%, NIV 3%, HT-2 28% T-2 0%) (10) (11). Risultati sovrapponibili per il sono stati riscontrati anche in uno studio condotto in Italia nel 2003 (12) nei baby-food (77% di campioni positivi) e in prodotti dietetici a base di crusca (96% di positività ). Da quanto sopra riportato si può affermare che il è il tricotecene riscontrato con maggiore frequenza negli alimenti a base di cereali e che, quindi, l esposizione continua a questa micotossina può costituire un rischio sanitario. CALCOLO DELL ESPOSIZIONE

4 Dai dati sulla composizione dei pasti preparati da Milano Ristorazione, è emerso che i cereali costituiscono il 42% del pasto totale offerto giornalmente ai bambini degli asili nido ed il 44% di quello a disposizione dei bambini delle elementari, corrispondenti, in termini quantitativi medi giornalieri rispettivamente a 0,237 kg e 0,302 kg di prodotto umido. Sulla scorta di questi dati di consumo e delle concentrazioni di rilevate negli alimenti a base di cereali (45 mg/kg e 82 mg/kg rispettivamente per i pasti dell asilo e delle elementari) è stata calcolata (consumo x concentrazione / peso corporeo) la presunta esposizione giornaliera media dei bambini a questa micotossina durante le 5 settimane considerate. Per il calcolo dell esposizione abbiamo considerato, per i bambini dell asilo un peso medio di 14 kg, corrispondente ad un età intermedia di 24 mesi e, per i bambini delle elementari, un peso medio di 28 kg corrispondente ad un età intermedia di 8 anni. I risultati ottenuti sono riassunti nelle tabelle 3 e 4. Tabella 3: Calcolo dell esposizione dei bambini- ASILO (µg/kg peso corporeo/giorno) Pasto giornaliero offerto assunto Peso corporeo bambini Esposizione giornaliera (µg/kg p.c.) 1 46,8 0,237 11,1 14 0, ,7 0,237 12,5 14 0, ,1 0,237 9,0 14 0, ,7 0,237 11,3 14 0, ,6 0,237 9,4 14 0,67 Media 45,0 10,7 0,76 Tabella 4: Calcolo dell esposizione dei bambini- ELEMENTARI (µg/kg peso corporeo/giorno) Pasto giornaliero offerto assunto Peso corporeo bambini Esposizione giornaliera (µg/kg p.c.) 1 70,0 0,302 21,1 28 0, ,5 0,302 31,0 28 1, ,9 0,302 26,5 28 0, ,6 0,302 18,9 28 0, ,6 0,302 26,2 28 0,94 Media 82,0 24,8 0,89 Dai nostri calcoli risulta che l esposizione giornaliera al era pari a 0,76 µg/kg p.c./giorno per i bambini dell asilo e 0,89 µg/kg p.c./giorno per quelli delle elementari. Per caratterizzare il rischio abbiamo confrontato le esposizioni da noi riscontrate con il TDI (1 µg/kg p.c./giorno) stabilito per il dalla UE-SCF(8). Dal confronto emerge che in entrambi i casi l esposizione non superava il valore di TDI ma rappresentava il 76% e l 89% dell esposizione giornaliera tollerata, rispettivamente, per i bambini dell asilo e per quelli delle elementari. I dati della nostra valutazione sono complessivamente rassicuranti ma è importante tuttavia considerare che essa si riferisce al solo pasto offerto dalla ristorazione collettiva (merenda compresa) e non tiene conto dei consumi domestici.

5 D altra parte è doveroso considerare che non tutto il pasto offerto dalla ristorazione collettiva viene realmente consumato dai bambini (i residui sono stimati intorno al 30%) Quindi, anche considerando i consumi domestici verosimilmente l esposizione giornaliera dei bambini non dovrebbe superare di molto quella da noi calcolata. Questa ipotesi è anche avvalorata dal fatto che a livello nazionale l assunzione giornaliera complessiva di questi alimenti da parte dei bambini, stimata dall Istituto Nazionale della Nutrizione (13) è di circa 197 e, che utilizzando questo dato statistico di consumo, al posto della quantità di alimento offerto dalla ristorazione collettiva, possiamo calcolare un esposizione a rispettivamente di 0,63 e 0,58 µg/kg p.c./giorno. L entità di esposizione giornaliera calcolata in questo modo lascerebbe anche un cospicuo margine di sicurezza per gli individui con consumi leggermene superiori a quelli medi. Rimane tuttavia da considerare l esposizione della fascia di popolazione definita come forti consumatori ovvero degli individui che a parità di peso corporeo hanno costantemente consumi doppi o tripli rispetto alla media. Sicuramente questa fascia di popolazione risulta maggiormente esposta all assunzione di contaminanti per via alimentare e ciò comporta spesso il superamento dei diversi TDI (8). Questo può avvenire anche per i bambini forti consumatori di cereali che solamente raddoppiando l esposizione media da noi calcolata supererebbero il TDI non solo marginalmente. Un osservazione analoga sulla fascia dei forti consumatori, per quanto riguarda l esposizione al è emersa anche in un recente studio europeo (14) e ciò conferma che la situazione attuale di contaminazione da dei cereali destinati all alimentazione umana non può essere considerata completamente rassicurante CONSIDERAZIONI SULLE CONCENTRAZIONI DI NEI CEREALI I valori massimi di concentrazione proposti a livello europeo per il nei cereali (15) al fine di controllare il rischio sanitario sono riassunti nella tabella 5. Tabella 5: nei cereali: valori limite di concentrazione consigliati in Europa PRODOTTO Limiti g/kg Grano duro e mais non lavorati 2000 Altri cereali non lavorati 1500 Cereali lavorati per il consumo umano diretto e prodotti derivati 500 Cerali per la colazione a base di mais e merendine 500 Farina integrale di grano, crusca e pasta (secca) 750 Cereali per l infanzia (baby food) 100 Questi valori di riferimento sono utili per confrontare le concentrazioni da noi rilevate nei pasti a base di cereali (pasta, pane, riso, pizza, merendine, focaccia, torta, biscotti, crackers). Naturalmente i valori di concentrazione del riportati nelle tabelle 3 e 4 ed utilizzati per il calcolo dell esposizione, si riferiscono al prodotto tal quale, pronto per il consumo, e quindi con una umidità variabile dal 50% al 75%. Calcolando i valori di concentrazione sulla sostanza secca abbiamo ottenuto i seguenti dati (Tabella 6)

6 Tabella 6 Concentrazioni di nei pasti (mg/ kg di sostanza secca) ASILO ELEMENTARI Media 122,4 163,4 Dall esame dei dati riferiti alla sostanza secca è possibile rilevare che tutti i valori sono abbondantemente compresi entro i limiti di riferimento suggeriti in ambito europeo per gli alimenti destinati a questa fascia di età anche se il nostro tipo di campionamento non permette di individuare la concentrazione di nei singoli componenti del pasto. Comunque i valori da noi ottenuti sono sostanzialmente sovrapponibili a quelli medi rilevati in uno studio condotto in Germania su vari tipi di prodotti a base di cereali (pane µg/kg, pasta fresca 158 µg/kg, riso 107 µg/kg) che però ha anche rilevato un estrema variabilità nell entità di contaminazione. In particolare in campioni di pasta fresca l intervallo delle concentrazioni era compreso tra 15 e 1670 µg/kg, ed in campioni di pane tra 15 e 788 µg/kg. (10-11) Gli stessi autori hanno inoltre rilevato una concentrazione di significativamente più bassa (pari a circa un terzo) in pane prodotto con cereali (grano, riso e altri cereali) provenienti da agricoltura biologica rispetto a quello confezionato con prodotti convenzionali. Invece i nostri risultati (tabella 6), anche se hanno evidenziato una minore contaminazione da nei pasti dell asilo (materie prime provenienti da agricoltura biologica) rispetto a quelli delle elementari (materie prime solo in parte provenienti da agricoltura biologica) non ci permettono di affermare che queste differenze siano imputabili esclusivamente alle tecniche di produzione delle materie prime. CONCLUSIONI I risultati del nostro studio confermano che il per la sua costante presenza negli alimenti a base di cereali è il Tricotecene su cui focalizzare maggiormente l attenzione per salvaguardare la sicurezza alimentare. Anche se le concentrazioni da noi riscontrate nei pasti offerti ai bambini degli asili e delle elementari del Comune di Milano sono sicuramente nei limiti consigliati in ambito UE per queste categorie di alimenti, il calcolo dell esposizione al tramite questi pasti evidenzia che anche una marginale esposizione aggiuntiva (pasti domestici) potrebbe comportare il raggiungimento del valore soglia del TDI e che questa soglia potrebbe essere facilmente superata dalla fascia dei forti consumatori. Ciò suggerisce innanzitutto che la reale esposizione dei bambini a questa micotossina deve essere più attentamente definita considerando anche i consumi domestici ed estendendo gli studi anche a periodi più favorevoli allo sviluppo fungino (autunno-inverno). In secondo luogo che è doveroso perseguire l obiettivo di una riduzione dell esposizione a l in età infantile individuando i mezzi più validi ed applicabili per il controllo del rischio. In questo senso sono auspicabili ulteriori indagini per individuare quali siano alimenti a base di cereali maggiormente responsabili dell esposizione, per rilevare l incidenza dell origine dei prodotti (agricoltura biologica e convenzionale) sull entità della contaminazione e per valutare anche

7 l influenza di alcuni processi di cottura dei cereali in ambiente umido (bollitura) sulle concentrazioni finali (alimenti pronti per il consumo) di questa micotossina fortemente idrosolubile. BIBLIOGRAFIA 1. WORLD HEALTH ORGANIZATON, I.P.C.S. (1990), Trichothecenes. In: Selected Mycotoxins: Ochratoxins, Trichothecenes, Ergot. World Health Organization, Geneva 2. SUDAKIN D.L. (2003) Trichothecenes in the environment: relevance to human health, Toxicology Letters, 143, p LARSEN J.C., HUNT J., PERRIN I., RUCKENBAUER P. (2004), Workshop on trichothecenes with a focus on : summary report, Toxicology Letters, 153, p BENNETT J.W. and KLICH M. (2003), Mycotoxins, Clinical Microbiology Reviews, 16, p PARENT-MASSIN D. (2004), Haematotoxicity of trichothecenes, Toxicology Letters, 153, p EUROPEAN COMMISSION HEALTH & CONSUMER PROTECTION DIRECTORATE- GENERAL, (1999), Opinion on Fusarium Toxins part 1:, Scientific Committee on Food, 19 final, EUROPEAN COMMISSION HEALTH & CONSUMER PROTECTION DIRECTORATE- GENERAL, (2000), Opinion on Fusarium Toxins part 4: nivalenol, Scientific Committee on Food, 26 final, EUROPEAN COMMISSION HEALTH & CONSUMER PROTECTION DIRECTORATE- GENERAL, (2002), Opinion of the Scientific Committee on Food on Fusarium toxins. Part 6: Group evaluation of T-2 toxin, HT-2 toxin, nivalenol and deoxynivalenol, Scientific Committee on Food, 27 final, RADOVÁ Z., HOLADOVÁ K., HAJŠLOVÁ J., (1998), Comparison of two clean-up principles for determination of trichothecenes in grain extract, Journal of Chromatografy A, 829, p SCHOLLENBERGER M., SUCHY S., JARA H.T., DROCHNER W., MULLER H.M. (1999), A survey of Fusarium toxins in cereal-based foods marketed in an area of southwest Germany. Mycopathologia, 147, p SCHOLLENBERGER M., DROCHNER W., RÜFLE M., SUCHY S., TERRY-JARA H., MÜLLER H.-M., (2005), Trichothecene toxins in different groups of conventional and organic bread of the German market. Journal of Food Composition and Analysis, 18, p PIETRI A., BERTUZZI T., ZANETTI M., RASTELLI S. (2004), Presenza dei tricoteceni e di ocratossina A in alimenti per l infanzia e in prodotti dietetici a base di crusca. Riassunti 1 congresso nazionale: le micotossine nella filiera agro-alimentare, p TURRINI A., SABA A., PERRONE D., CIALFA E. and D AMICIS A. (2001), Original Communication Food consumption patterns in Italy: the INN-CA Study European Journal of Clinical Nutrition,55, p SCHOTHORST R.C., VAN Egmond H.P. (2004), Report from SCOOP task collection of occurrence data of Fusarium toxins in food and assessment of dietary intake by the population of EU member states Subtask: trichothecenes. Toxicology Letters, 153, p HAZEL C.M., PATERL S. (2004), Influence of processing on trichothecene levels. Toxicology Letters, 153, p