Determinazione dell'hcg: applicazioni cliniche e requisiti analitici* C.M. STURGEON1, E.I. MCALLISTER2

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1 Determinaione dell'hcg: applicaioni cliniche e requisiti analitici* C.M. STURGEN1, E.I. MCALLISTER2 ldepartment ofclinical Biochemistry, Royal Infirmary, Edinburgh (UK) 2Department ofbiochemistry, Gartnavel Generai Hospital, Glasgow (UK) DETERMINAZINE DELL'hCG: APPLICAZINI CLINICHE E REQUISITI ANALITICI La gonadotropina corionica umana (hcg) è stata descritta iniialmente da Hirose nel 1920 (1) nel corso di studi sulla struttura del corpo luteo nel coniglio e, da quel momento, la sua determinaione è stata accettata universalmente come strumento per la diagnosi ed il monitoraggio della gravidana; inoltre è sicuramente riconosciuta come indicatore del coriocarcinoma (2), va crescendo la sua importana come marcato re tumorale in varie patologie e, più recentemente, è usata come indicatore di malformaioni fetali. È probabile che aumenti l'utilità della determinaione dell'hcg e delle molecole correlate, sia nel siero che nelle urine, con l'aumentare delle conoscene sulla struttura e sulla funione della forma nativa dell'hcg e delle relative subunità e frammenti. Alcune esaurienti rassegne descrivono sia le caratteristiche biologiche della molecola dell'hcg (3) sia i più recenti aggiornamenti sugli aspetti immunochimici delle sue forme molecolari di interesse clinico (4,5) e la loro importana per l'uso clinico delle determinaioni (6). Questi sviluppi sono stati favoriti, in buona parte, dalla disponibilità di nuovi metodi analitici per la determinaione dell'hcg ed, alla 4 a Bergmeyer Conference del 1992, sono state discusse, e successivamente pubblicate, le raccomandaioni da seguire per migliorare ulteriormente questi metodi e per awiarsi verso la loro standardiaione (7). Anche la Società Canadese di Chimica Clinica ha pubblicato delle direttive riguardo le problematiche di standardiaione di molti ormoni polipetidici tra cui l'hcg (8) e più recentemente, negli Stati Uniti, la National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha proposto delle linee guida (9) che sollecitano la conoscena delle problematiche legate alla determinaione dell'hcg con l'obiettivo di migliorare sia i metodi analitici che la cura dei paienti. Questa rassegna affronterà prevalentemente gli aspetti metodologici della determinaione dell'hcg, evideniando i cambiamenti intercorsi dall'ultima rassegna pubblicata (10), e fornendo delle informaioni pratiche utili ai laboratori che eseguono questa determinaione. Quando possibile, si farà riferimento alle raccomandaioni contenute nel documento di Bergmeyer (7). STRUTTURA E NMENCLATURA DELL'hCG E DELLE MLECLE CRRELATE L'hCG appartiene alla famiglia degli ormoni glicoproteici, della quale fanno parte anche l'ormone luteiniante (LH), l'ormone follicolo stimolante (FSH) e la tireotropina (TSH); queste quattro molecole sono degli eterodimeri ed hanno in comune la subunità a ma differiscono per la subunità f3, che conferisce la specificità immunologica e funionale. La subunità f3 dell'hcg presenta una notevole omologia con quella dell'lh, ma nell'estremità carbossiterminale presenta un prolungamento di trentadue aminoacidi. È stata descritta la struttura cristallina dell'hcg (11): entrambe le subunità hanno una topologia simile, con tre ponti disolfuro che formano un residuo di cistina; tale struttura si trova anche in alcuni fattori di crescita, quale il fattore di crescita mutante-f3 (TGF-f3) ed il fattore di crescita f3 derivante dalle piastrine (PDGF-f3). Per stabiliare -Ristampato da: Annals of Clinical Biochemistry, 1998; 35: , con l'autoriaione dell'editore. Copyright (1998) Royal Society of Medicine Press" L'articolo è stato tradotto su licena della Association of Clinical Biochemistry, che non è responsabile per l'accuratea della traduione. Si ringraiano l'autore e l'editore per la gentile concessione Traduione a cura di: Antonio Fortunato Laboratorio di Chimica clinica ed Ematologia - spedale San Bortolo Viale Rodolfi, 37, Vicena - Tel./Fax Giulio Vignati Centro Malattie Endocrine e Metaboliche - spedale G. Fomaroli Via Donatori di Sangue, 50, Magenta (MI) - Tel.: ; Fax: LlGAND ASSAY VL. 5 NUMER 2 ANN 2000

2 l'eterodimero, una parte della catena ~ avvolge la catena a. e forma, con legami covalenti, una specie di cintura di sicurea. Questa struttura tridimensionale sembra fondamentale non solo per mantenere l'associaione delle subunità a. e ~, ma anche per il legame della glicoproteina con i relativi recettori. La conoscena approfondita della struttura molecolare, che consente di identificare correttamente le differenti regioni sulla superficie della proteina, dovrebbe facilitare la mappatura degli epitopi e consentire, nel futuro, la messa a punto di metodi sempre migliori per la determinaione dell'hcg (12). Le molecole correlate con l'hcg sono presenti nei liquidi biologici nella forma di eterodimero sia intatto (hcg) sia modificato (per esempio la forma intaccata o "nicked", hcgn), o come subunità libere (a. e ~), o ancora come prodotti di degradaione (per esempio frammento ~-core, ~hcgcf) (13). (II ~hcgcf talvolta è utiliato, ma in maniera fuorviante, per indicare il peptide gonodotropo urinario (UGP); tuttavia la denominaione UGP può essere utiliata per indicare una porione di molecola più diffusa del ~hcgcf, che ha una struttura chimica ben definita). Nella letteratura si riscontra una certa confusione dovuta alla mancana di una nomenclatura universalmente accettata. Nel tentativo di fare chiarea, le relaioni tra queste forme molecolari sono riportate nella Tabella 1, utiliando la nomenclatura già auspicata (7) che verrà adottata in questa rassegna (14, 15, 16). Quando si descrivono i metodi per la determinaione dell'hcg è consigliabile raggrupparli a seconda delle forme molecolari che essi rilevano, nella misura in cui si dispone di questa informaione. I metodi commerciali disponibili possono essere classificati a seconda se misurano prevalentemente l'hcg (metodi "intatti"), hcg+~hcg (metodi "totali"), o.hcg, ~hcg o ~hcgcf e le caratteristiche di questi metodi sono descritte nella Figura 1. Questa classificaione schemati- ca non tiene conto delle modifiche strutturali che possono intercorrere (per esempio: clivaggio di una parte della catena polipeptidica, o eterogeneità delle parti aminoacidiche o carboidratiche) in quanto sono disponibili scarse informaioni riguardo a come i metodi commerciali riconoscono queste varianti oppure al loro significato clinico. Nella "Guida ai dosaggi immunometrici" edita da Kluwer (17) è riportata una lista dei principali metodi commerciali disponibili per la determinaione dell'hcg con l'indicaione di informaioni utili che sono state ricavate dagli inserti contenuti nelle confeioni. MTIVAZINI CLINICHE PER LA RICHIESTA DI DETERMINAZINE DELL'hCG Nelle Tabelle 2 e 3 sono riassunte le motivaioni cliniche per la richiesta di determinaione dell'hcg e vengono discusse in dettaglio qui di seguito. Determinaione dell'hcg in uomini sani ed in donne non in gravidana Se si utiliano dei metodi ad elevata sensibilità, è possibile misurare la concentraione dell'hcg in uomini sani ed in donne non in gravidana. La funione delle gonadi influena la concentraione dell'hcg: è stato descritto, utiliando un unico metodo, un aumento del limite superiore dei valori di riferimento per l'hcg in donne in menopausa da 3 a 5 U/L (siero) e da 3 a 4 U/L (urine) (18). Analogamente, il limite superiore descritto per gli uomini sotto i cinquanta anni di 0,7 U/L (siero) ed 1 U/L (urine) aumenta negli uomini più aniani rispettivamente a 2 e 3 U/L. È importante sapere che, occasionai mente, si possono riscontrare concentraioni di hcg fino a 8-10 U/L in donne sane e fino a 3-4 U/L in uomini sani (18). Total hcg assays a S F(]ree :x a{d II-subunit assays / "" I \ I \ \ ~ a Free a ~ \... F!:-ee ~ Free a-a Free~-~ II-core fragment assay ~B~d Figura 1 Rappresentaione schematica delle combinaioni di anticorpi utiliabili per la misura di: gonadotropina corionica intatta (hcg), hcg totale, subunità a. e ~, frammento centrale (~cj). e_ == anticorpo di cattura; ~ anticorpo tracciante; CTP == peptide C terminale (Riproduione autoriata da riferimento bibliografico 4) LlGAND ASSAY VL. 5 NUMER 2 ANN 2000

3 r Gi o fn ~ -< ( : '" c ;:: m JJ '" ~&1 Nomenclotura e strutture della gonadotropina corionica umana (hcg) e delle molecole co"elote a Molecola hcg intatta hcg intaccata o "nicked" Eterogeneità N-terminale Eterogeneità della parte carboidratica Subunità alfa libera ahcg mutante ahcg grande Subunità beta libera (3hCG intaccata Frammento centrale o core di (3hcd Peptide C-terminale di (3hCG Simbolo hcg hcgn ahcg (3hCG (3hCGn (3hCGcf (3hCGCTP Peso molecolare Struttura approssimato (kda) 36,7 Dimero di due unità non identiche (a e (3) legate in modo covalente 36,7 Mancana di legami nella regione b Uno o più clivaggi, più frequentemente tra gli aminoacidi 47 e 48 Variabile Da 1 a 4 residui di aminoacidi mancanti dalla subunità a Caratteristiche Biologicamente attiva Fonna parialmente degradata di hcg: attività biologica ridotta o assente, ridotta affinità per alcuni anticorpi anti-hcg Fonnaione di dimeri a-(3; attività biologica non modificata Variabile Non ben caratteriata Documentate differene nel contenuto carboidratico tra la gravidana iniiale ed avanata (J 5) 14,5 Catena polipetidica singola, glicòsilata, Non.biologicamente attiva comune a hcg,lh,fsh,tsh Sostituione, in psiione 56, di acido glutammico con alanina 16,0 Incapace di legarsi con bhc 22,2 22,2 12,0 Catena polipeptica singola, glicosilata Mancana di legami nella regione ( Ponte disolfuro ( legato alla posiione ( Frammento C-terminale, di 32 aminoacidi, di (3hCG Non biologicamente attiva Dimero intaccato, instabile Incapace di legarsi con ahcg Peptide non presente in altri ormoni glicoproteici Emi vita in Riscontro nei fluidi biologici circolo (approssimata) 40 h Plasma, siero, urine (in gravidana), neoplasie <Il h Plasma, siero, in particolare di paienti neoplastici 1,5 h 1,5 h 4,0 h Non nota <l' Componente più importante della immunoreattività di hcg nelle urine Riscontrate differene tra siero ed urina (16). Forma di hcg tipicamente prodotta dalle neoplasie (coriocarcinoma) Plasma, siero, urine (in gravidana), neoplasie A volte presente nei coriocarcinomi Possibile presena nella ahcg Di derivaione neoplastica Plasma, siero,in particolare di paienti neoplastici Forma comune nelle urine, possibile presena nel plasma Forma più importante nelle urine, concentraione plasmatica molto bassa Urine di paienti con malattia trofoblastica Il "Adattata, in parte, da Stenman et al. (7) e Gambino (14). alla nomenclatura utiliata è ampiamente in accordo con quanto raccomandato nel documento del National Committee for Clinicallaboratory Standards (NCCLS) (9), sebbene gli autori raccomandino l'uso del termine "GC dimero" quando ci si riferisce alla molecola intatta di hcg e di tener conto che il termine hcg "intatta" può essere male interpretato, in quanto intende non solo la forma dimerica ma anche la assena di qualsiasi frammento peptidico o di modificaioni della parte glucidica. n documento NCCLS raccomanda la dicitura ormone glicoproteico alfa (GPHa) come terminologia generale per le subunità a di hcg, ormone tireostimolante (TSH), ormone luteiniante (LH), ed ormone follicolostimolante (FSH) ma commenta che l'utilio di abcg, come raccomandato dalla IFCC, può essere preferibile in alcune situaioni in quanto le modificaioni post-traslaionali probabilmente sono diverse a seconda dell'ormone di cui la subunità fa parte. b) A volte riferito al peptide gonadotropinico urinario (UGP), ma UCP è spesso usato per indicare una entità più estesa di f\hcgcf.

4 Tabella 2 Prestaioni dei metodi per gonadotropina corionica umana (hcg) in gravidana r Gl o l; (f) -< Ci! '" c s: m :Il I\) I\) 8 o Applicaione clinica Metodo di eleione Tipo di Specificit4 richiesta Limite di Temporiaione, frequena, Commenti campione sensibilità rapidità richieste desiderabile" Diagnosi routinaria di Metodi in agglutinaione o Urina hcg o hcg + t3hcg SUIL Positivo al momento della I test di gravidana eseguibili dal paiente a gravidana ELISA qualitativi mancata mestruaione domicilio devono risultare positivi 7-9 giorni dopo il concepimento Conferma o esclusione urgente Immunodosaggio qualitativo Urina o siero hcg o hcg + t3hcg 2S-S0 UlL Positivo 7-9 giorni dopo il Paienti con dolori addominali, emorragie, di gravidana (ottimale 2UIL concepimento; ottimale la ecc. Verificare.se l'impiego di urine diluite per siero) possibilità di esecuione o concentrate possa influenare come analisi decentrata l'interpretaione del test Esclusione di gravidana Immunodosaggio quantitativo Siero hcg o hcg + t3hcg 2 UlL Entro le 24 ore Livelli di hcg sino a l U/L possono essere presenti in donne in menopausa Monitoraggio di gravidane Immunodosaggio quantitativo Siero hcg o hcg + t3hcg 2 UlL Misuraioni seriate ogni Usato in associaione con ecografia iniiali ore; risultati transvaginale o pelvica, ecc. disponibili entro 24 ore Gravidana ectopica Immunodosaggio quantitativo Siero o urina hcg o hcg + t3hcg 2 U/L Misuraioni seriate ad L'uso di appropriati livelli di cut-off intervalli di ore sino al (tra I ()()() e 2000 UIL) e la velocità di rientro dei valori entro i limiti di normalità decremento di hcg può aiutare nella scelta decisionale tra il reintervento chirurgico ed il trattamento conservativo Screening per sindrome di Immunodosaggio quantitativo Siero hcg o hcg + t3hcg o Legato alla Misuraione, con AFP, tra la Non ancora definita la miglior associaione Down (trisomia 21 fetale) t3hcg diluiione del IS" e la 18" settimana di di marcatori; il trattamento del campione campione: più gravidana con possibilità nella fase preanalitica può essere importante importante la futura di screening nel l se viene misurata la sola t3hcg riproducibilità del trimestre metodo Malattie benigne gestaionali Immunodosaggio quantitativo Siero, urina hcg +t3hcg 2UIL Misuraioni seriate possono Se hcg è inferiore a 2 UIL 62 giorni dopo del trofoblasto (mola idonea nel essere di aiuto nella l' asportaione, monitoraggio mensile sino al idatiforme) monitoraggio differeniaione dalle 6 mese. Se hcg a 62 giorni è più elevato, post trattamento gravidane normali. monitoraggio mensile per 12 mesi, indi Valutaioni seri che trimestrale sino al 2 anno b quindicinali dopo asportaione sino alla discesa dei li velli al di sotto di 2 UlL Valutaione della permanena Immunodosaggio quantitati vo Siero hcg + t3hcg 2UIL Misuraioni seriate Possibile riscontro di hcg nel siero per di residui del trofoblasto di verse settimane '~iflettono i linùti attualmente raggiungi bili, sensibilità più elevate sono auspicabili per alcune applicaioni cliniche b)richieste ulteriori valutaioni di hcg in 6a e la settimana ad ogni gravidana successiva a causa di un modesto aumento del rischio di sviluppare coriocarcinoma in tali paienti. Ulteriori informaioni disponibili presso il Trophoblastic Tumor Screening & Treatment Centre, Department of Medical ncology, Charing Cross Hospital, London W6 8RF, UK (telefono +44(0) ). ELISA = enime-linked immunosorbent assay; AFP = alfafetoproteina Il

5 r Cl UJ UJ -< C! '" c ~ m ]l '" o '" 8 Tabelln 3 Prestaioni dei metodi per gonadotropina corionica umana (hcg) neue neoplnsie maligne Applicaione clinica Metodo di eleione Tipo di campione Specificità richiesta Limite di sensibilità desiderabile a Temporiaione, frequena, rapidità richieste Commenti Coriocarcinoma Neoplasia testicolare Neopalsia a cellule germinali dell'ovaio Neoplasie non trofoblastiche Immunodosaggio quantitativo Immunodosaggio quantitativo Immunodosaggio quantitativo Immunodosaggio quantitativo Siero Siero Siero Siero o urina hc + j3hc hc + j3hc hc +j3hc j3hc (siero) o hccf (urine) 2UIL (ideale l UIL) 2UIL 5UIL Non ancora determinato Dosaggi bisettimanali durante la chemioterapia, indi misuraione settimanale di hc urinaria per un anno, ogni 4 settimane nel secondo anno, ogni 8 settimane nel tero anno, trimestrale nel quarto anno, quadrimestrale nel quinto anno, indi ogni 6 mesi per tutta la vita Valutaione, con AFP, al momento della diagnosi. Valutaione settimanale dopo chirurgia o chemioterapia sino alla normaliaione Come per le neoplasie testicolari Non ancora determinato Richiesto monitoraggio a lungo termine (la reaione crociata con LH non è generalmente un problema ma aumenti temporanei di LH dopo il trattamento possono determinare transitori incrementi di hc sino a 5 UIL)b Un incremento dei valori dovrebbe essere confermato da una ripetiione dell' analisi. U n risultato normale non esclude in maniera assoluta una recidiva Importante per meno del 5% di tutte le neoplasie maligne dell' ovaio. Per le altre forme il marcatore di scelta è il CA 125 Il valore clinico deve ancora essre stabilito. La determinaione deve essere migliorata sia nella metodologia di dosaggio che nella standardiaione. Probabilmente necessaria una correione per la concentraione urinaria El ' %flettono i limiti attualmente raggiungibili, sensibilità più elevate sono auspicabili per alcune applicaioni cliniche bulteriori informaioni disponibili presso il Trophoblastic Tumor Screening & Treatment Centre, Department ofmedical ncology, Charing Cross Hospital, London W6 8RF, UK (telefono +44(0) ). LH = ormone luteiniante AFP = alfafetoproteina

6 Determinaione dell'hcg in gravidana Le richieste di determinaione di hcg processate in un normale laboratorio sono prevalentemente per la diagnosi ed il monitoraggio della gravidana e sono riconducibili a sei categorie principali (Tab. 2). Diagnosi routinaria di gravidana o esclusione della gravidana Nel corso della gravidana l'hcg è prodotto in grandi quantità dal sinciiotrofoblasto della placenta; in genere si può evideniare un aumento del livello ematico di hcg quando si verifica l'impianto, 7-9 giomi dopo il concepimento (o giomi dopo l'ultima mestruaione in un ciclo normale di 28 giorni). Il livello di hcg cresce in modo esponeniale, con un tempo di raddoppio della concentraione fino a due giorni per le prime 5-6 settimane, fino a raggiungere una concentraione massima di circa U/L tra la 7a e la 1Qa settimana di gestaione (Fig. 2) (19). La concentraione successivamente decresce fino a circa un decimo prima di stabiliarsi e rimanere a livelli relativamente costanti fino in prossimità del momento del parto, quando aumenta leggermente prima di tomare rapidamente entro i livelli di riferimento post-parto. Recentemente è stata studiata la complessa cinetica di scomparsa dei livelli sierici di hcg, o:hcg e I3hCG che segue il parto (20). La prova immunologica di gravidana, in genere, viene eseguita per confermare i segni clinici ed i sintomi della gravidana, per rilevare precocemente l'impianto in seguito a trattamento per infertilità, per valutare inspiegabili amenorree, o per escludere la gravidana quando si stanno per intraprendere procedure che potrebbero danneggiare l'eventuale feto. L'analisi qualitativa basata sulla rilevaione dell'hcg nelle urine è in genere sufficiente: un risultato positivo conferma la gravidana, mentre un risultato negativo (con una concentraione soglia di U/L) in genere esclude le gravidane ectopiche (21). Tuttavia, per confermare che la gravidana procede in modo regolare o meno, può essere necessaria la determinaione quantitativa dell'hcg nel siero e la dimostraione che la velocità di raddoppio della concentraione è adeguata. Recentemente sono state valutate le prestaioni di vari metodi per la prova immunologica di gravidana a lettura colorimetrica (21,22). Monitoraggio delle gravidane iniiali La determinaione quantitativa dell'hcg è di grande utilità quando si valuta una donna con sintomi addominali e/o perdite vaginali, che possono essere associate o meno a gravidana. Se il metodo utiliato ha una buona sensibilità analitica (hcg < 25 U/L), la prova immunologica di gravidana su urine risulta positiva nel 95% delle paienti con gravidana ectopica con riscontro di pochi risultati falsamente negativi (23). Se la prova di gravidana risulta positiva, nelle paienti con anamnesi positiva pe r gravidana ectopica o aborto precoce, è particolarmente utile il successivo monitoraggio quantitativo dell'hcg in associaione con l'ecografia. L'età gestaionale e la concentraione di hcg nel siero a cui si può rilevare la presena di una gravidana vitale intrauterina con l'ecografia dipende sia dal metodo utiliato per la misura dell'hcg che dalla strumentaione disponibile e dall'esperiena di chi esegue l'ecografia. Tuttavia, se la concentraione dell'hcg nel siero è superiore a 1000 U/L, con l'ecografia trans-vaginale si dovrebbe dimostrare la presena di un sacco intrauterino: la sua assena depone per una gravidana ectopica (24). Se il livello di hcg nel siero decresce con un emivita da 12 ore a 2 giorni può essere utiliato per identificare un aborto completo o ritenuto, mentre se l'hcg è rilevabile in modo persistente dopo un aborto o la rimoione laparoscopica dei prodotti del concepimento evidenia una rimoione non completa dei tessuti e depone per la necessità di ulteriori indagini. Si deve tenere presente che, in seguito ad un aborto nel corso del primo trimestre, sono necessari anche fino a 60 giorni per fare tornare la concentraione di hcg entro i livelli di riferimento partendo dai valori molto elevati presenti alla 7a-1 oa settimana (25). Gravidana ectopica La determinaione dell'hcg costituisce un supporto significativo alla diagnosi ed alla gestione delle gravidane ectopiche (26,27). Una serie di studi hanno dimostrato che l'esecuione di determinaioni sequeniali della concentraione di hcg in casi di sospette gravidane ectopiche può ridurre, in modo significativo, il numero di interventi laparoscopici, in quanto alcune di queste possono evolvere in aborti spontanei e quindi non è necessario intervenire chirurgicamente, evitando così anche i rischi di compromissione della fertilità nel futuro. Se il livello di hcg nel siero è relativamente basso (i valori di concentraione suggeriti come cut-off sono <1000 U/L (25-28), <2000 U/L (29) e < 2500 U/L (30, 31) e tendente a decrescere, nella maggior parte dei casi può essere sufficiente un atteggiamento conservativo oppure un trattamento con methotrexate (32,33); diventa quindi fondamentale il monitoraggio della concentraione dell'hcg ad intervalli di circa 2-3 giorni (29). È stato evideniato che può essere terapeuticamente efficace un approccio graduale alla prescriione del methotrexate, basato sulla concentraione iniiale dell'hcg (33). Per le donne che già hanno avuto una gravidana ectopica, e che quindi risultano esposte ad un rischio più elevato che questa si ripeta, è opportuno f :::ì (!J 1000 o.r:: 100 '" DrPD!Ii! f} Il D ~ D ~ ~Di>~g I;J D il DD 8~ ~ Jti~::r~ 10~~~--~~~--~~~--~ o Days alter last menstrual period Figura 2 Andamento della concentraione di gonadotropina corionica umana (hcg) nel corso della gravidana. Campioni ottenuti nel corso di gravidane singole normali in femmine con concepimento successivo a fertiliaioni "in vitro ". Sono inclusi anche campioni da gravidane normali tra la 8"- e la 4rf' settimana (Riproduione autoriata da riferimento bibliografico 6). LlGAND ASSAY Vl. 5 NUMER 2 ANN 2000

7 , un monitoraggio serrato nel periodo tra la sa e Ba settimana di gestaione per permettere una eventuale diagnosi precoce, prima della comparsa dei sintomi, ed una efficace e sicura terapia non chirurgica (34). Screening per la sindrome di Down (trisomia 21) La determinaione accurata dell'hcg o della ~hcg costituisce un contributo importante al pannello di parametri utiliati per lo screening biochimico pre-natale per la sindrome di Down (35). La maggior parte dei laboratori, per stabilire l'indice di rischio, elaborano i dati relativi al livello di hcg e di cx-fetoproteina (AFP) e/o estriolo non-coniugato e considerando l'età materna. Recentemente, in molti centri è stato rivisto l'atteggiamento nei confronti dello screening (36). Mentre alcuni operatori propongono che la migliore combinaione di parametri sia ~hcg e AFP (37), ed altri discutono sulla superiorità della ~hcg rispetto all'hcg intatta (38), tutti gli attuali programmi di screening includono uno o più di questi parametri. Recentemente sono stati ottenuti risultati promettenti con l'uso del ~hcgcf: nelle gravidane portatrici di sindrome di Down la concentraione nelle urine di questa molecola aumenta in modo molto più vistoso di quanto aumenti nel sangue la concentraione della ~hcg (39,40). Malattie benigne gestaionali del trofoblasto (mola idatiforme) La presena di una mola idatiforme, una evoluione anomala del prodotto del concepimento a seguito della quale l'embrione non si sviluppa o viene riassorbito precocemente, è normalmente evideniata dall'ecografia e confermata con l'istopatologia. Tuttavia è importante determinare le concentraioni nel siero dell'hcg, che risultano uguali o più elevate di quelle riscontrate nel corso di gravidane simili ad evoluione fisiologica, prima della rimoione della sospetta mola e, successivamente, ogni quindici giorni fino a quando le concentraioni rientrano nell'ambito di normalità. L'esecuione di determinaioni seriate può essere utile per differeniare le gravidane normali da quelle molari, infatti in queste ultime la concentraione non ha un massimo nel primo trimestre, ma continua ad aumentare proporionalmente alla crescita della massa del trofoblasto. Nelle gravidane trofoblastiche si riscontra una maggiore eterogeneità molecolare dell'hcg rispetto alle gravidane normali; infatti i campioni di siero materno delle prime contengono differenti miscele di hcg con molecole dissociate e degradate (per esempio: hcgn, hcgn sena il peptide ~Cterminale, ~hcg) (41). È importante che le determinaioni seriate siano eseguite con lo stesso metodo poiché la diversa tipologia di configuraione dei metodi immunometrici può portare a risultati completamente differenti. Nel Regno Unito tutte le paienti sono registrate nel Registro Naionale Moli Idatiformi (42,43) in quanto ogni anno, fino al 10% delle paienti registrate, può necessitare di chemioterapia per mola invasiva o coriocarcinoma. Valutaione della permanena di residui del trofoblasto Per stabilire se il tessuto trofoblastico è stato eliminato completamente, in seguito al trattamento chirurgico o farmacologico di gravidane ectopiche, alla rimoione chirurgica di una gravidana molare, o ad un aborto spontaneo o indotto, è utile il monitoraggio seriato della concentraione dell'hcg nel siero (44,45). Si deve tenere presente che la velocità di rimoione non è elevata ed è molto variabile tra individui. All'iniio l'eliminaione è probabilmente esponeniale, con un emivita inferiore al giorno, ma successivamente rallenta fino ad un'emivita di parecchi giorni. Poiché attualmente sono impiegati metodi immunometrici ad elevata sensibilità e si possono rilevare concentraioni di hcg per molte settimane si deve fare attenione prima di affermare che si è in presena di residui trofoblastici Determinaione dell'hcg nelle neoplasie Le neoplasie testicolari e germinali in cui l'hcg è efficace come indicatore tumorale (Tab. 3) sono relativamente rare, ma l'elevata specificità clinica del marcatore, associata con la disponibilità di una terapia realmente efficace, rende la sua determinaione (assieme a quella deil'afp) indispensabile per una efficace gestione del paiente (46). E' stato recentemente passato in rassegna l'uso della determinaione dell'hcg e della ~hcg in queste ed altre neoplasie (47). Anche la determinaione dei prodotti di degradaione dell'hcg, quale 1'~hCGcf, nelle urine può avere un'utile applicaione clinica, soprattutto nelle neoplasie ginecologiche e vescicali (48). L'informaione più significativa si ricava, come per tutti gli altri marcatori tumorali, non tanto da una singola determinaione ma dalla valutaione dell'andamento della concentraione nel tempo (e dalla velocità di aumento o di diminuione dal valore di concentraione misurato prima dell'iniio della terapia). Malattia trofoblastica maligna (coriocarcinoma) Le recidive di un tumore trofoblastico, che spesso sono il segnale della ripresa della patologia neoplastica (ad esempio il coriocarcinoma), possono essere evideniate facilmente con la determinaione dell'hcg e della ~hcg. La specificità clinica è elevata, in parte perché l'hcg nelle donne non in gravidana è presente solo a concentraioni molto basse, ed in parte perché la produione di hcg da parte del tessuto trofoblastico è particolarmente elevata: 10 7 cellule di coriocarcinoma producono una quantità di hcg sufficiente a far aumentare la concentraione riscontrata nel siero (49). La determinaione simultanea di hcg e di ~hcg consente la diagnosi differeniale tra neoplasia benigna e maligna, infatti un rapporto ~hcg/hcg (calcolato con concentraioni molari) superiore al S% è indicativo in modo specifico di neoplasia corionica maligna (50); in genere questo rapporto ha valori più bassi nella mola idatiforme, intermedi nella mola invasiva e più alti nel coriocarcinoma. Sono stati rivisti i vantaggi di questo approccio alla diagnosi, prognosi e monitoraggio ed è probabile che esso venga utiliato più diffusamente soprattutto in relaione alla maggiore standardiaione e alla maggiore disponibilità di metodi per la determinaione della ~hcg. Il monitoraggio a lungo termine dei paienti che hanno avuto una neoplasia trofoblastica maligna è molto importante e può essere ben organiato, eventualmente su base naionale, come è stato fatto nel Regno Unito (42). Tumore testicolare L'hCG e l'afp sono dei marcatori tumorali importanti nelle neoplasie testicolari, utiliabili nella diagnosi, nella LlGAND ASSAY VL. 5 NUMER 2 ANN 2000

8 , prognosi e nel monitoraggio a lungo termine dei paienti con questo tipo di patologie, inoltre sono degli efficaci indicatori del successo della terapia. Entrambi i marcatori sono elevati nel 40-60% di tutti i tumori testicolari non seminomatosi, ma possono risultare elevati anche nel 90% dei casi (7). Questi tumori possono produrre hcg, hcg e ~hcg, o, in qualche caso, solo ~hcg (51); la ~hcg è prodotta anche dai seminomi, meno del 20% dei quali produce l'hcg. (46). In circa il 10-20% dei paienti con neoplasia testicolare si riscontrano valori elevati di ahcg (52). Attualmente si stanno preparando le Linee Guida Scoesi sulla gestione dei tumori germinali testicolari comprendenti le raccomandaioni sul corretto uso dei marcatori tumorali (53) e probabilmente altri documenti simili si stanno preparando altrove. Tumori germinali dell'ovaio In questi tumori, che rappresentano meno del 5% di tutte le patologie maligne dell'ovaio, sono molto utili come marcatori l'hcg e l'afp. La determinaione dell'hcg e della ~hcg è molto importante nella maggior parte di questi tumori (inclusi i disgerminomi e i coriocarcinomi), sebbene i teratomi possano produrre anche l'afp. Le neoplasie del sacco vitellino (cavità endodermica) producono solo AFP. Le indicaioni per l'utilio clinico corretto sono simili a quelle descritte per i tumori testicolari. Tumori non trofob/astici L'hCG può risultare saltuariamente elevata in vari tumori non trofoblastici, ma l'utilità è limitata dalla mancana di specificità clinica e dalla bassa frequena dei casi in cui le concentraioni risultano elevate. Tuttavia, recenti studi dimostrano che la determinaione dell'hcg nel siero (47) e del ~ hcgcf nelle urine (54) può essere un marcato re utile in molte altre neoplasie non trofoblastiche; tra queste sono compresi i tumori della vescica, del polmone, del pancreas, dei tratti epatobiliare e gastrointestinale (52, 55, 56) ed è importante sapere che tale produione ectopica può essere responsabile di aumenti inattesi della concentraione di hcg. L'utilità clinica definitiva della determinaione dell'hcg nel siero e del ~ hcgcf nelle urine deve essere ancora stabilita, ma prima sono necessari dei miglioramenti sia delle tecnologie che della standardiaione dei metodi di determinaione (48,57,58); tuttavia l'uso di questi marcatori può essere utile nella gestione dei paienti, soprattutto nel caso dei tumori della vescica per i quali non sono disponibili altri marcatori sierici validi. Altre applicaioni della determinaione dell'hcg Si è diffuso l'abuso di assunione di hcg negli sportivi in quanto questo stimola la secreione, da parte dei testicoli, sia di testosterone che di epitestosterone; la produione di quest'ultimo nasconde il testosterone e rende più difficoltosa la rilevaione dell'eccesso di testosterone nei controlli antidoping (59); per informaioni più dettagliate su questo complesso argomento, di carattere molto specialistico, si rimanda il lettore ad alcune recenti rassegne (60,61). La conferma della presena di hcg, per motivi legali, nei casi di sospetto abuso per migliorare le prestaioni, ha reso necessario ricorrere alle potenialità della tecnica di cromatografia liquida ad alta risoluione, associata alla spettrometria di massa, per caratteriare l'hcg ed i suoi metaboliti (62). Queste tecniche possono essere utiliate anche per la caratteriaione dei materiali di riferimento. Conseguene nelle applicaioni cliniche delle caratteristiche analitiche dei metodi per la determinaione dell'hcg Le diverse applicaioni cliniche dell'hcg (Tabb. 2 e 3) spiegano i numerosi requisiti che deve avere un serviio diagnostico che effettua questa determinaione. Per lo screening materno è necessario un metodo rapido con un ampio intervallo di misura: ancora più vantaggiosa è la possibilità di determinare contemporaneamente anche l'afp; per l'applicaione come marcatore tumorale è importante una buona precisione alle concentraioni vicine al limite superiore dell'intervallo di misura (ad esempio una buona affidabilità dei valori iniiali) in quanto anche piccoli incrementi possono essere significativi; inoltre la precisione tra le serie nel tempo deve essere sufficientemente affidabile per permettere di identificare con certea le piccole variaioni nelle concentraioni di hcg nei paienti sottoposti a follow-up per lunghi periodi (vedere di seguito la seione "Requisiti di qualità dei metodi per la determinaione dell'hcg"). Non sono ancora stati intrapresi studi sulla variabilità biologica inter-individuo, probabilmente perché il livello di hcg non è rilevabile con la maggior parte dei metodi attualmente disponibili per la determinaione quotidiana dell'hcg (63). STANDARDIZZAZINE DEI METDI PER LA DETERMINAZINE DELL'hCG I problemi inerenti alla standardiaione degli ormoni etereogenei, come le gonadotropine, sono stati ampiamente valutati (64-67). Premesso che spesso non è possibile definire il valore "vero" per questi analiti e che attualmente è limitata la conoscena della loro stuttura e della loro funione biologica, esistono tuttavia dei passaggi che possono essere utiliati per migliorare la confrontabilità dei metodi. Un ottimo punto di partena sarebbe il chiarimento di quali forme molecolari sono identificate dai vari metodi in riferimento a standard appropriati ed universali. Presso il "National Institute for Biological Standards and Control" (NIBSC, South Mimms, UK) sono disponibili gli standard per hcg, ahcg e ~hcg, elencati nella Tabella 4, la cui validità è riconosciuta a livello internaionale. Lo standard per l'hcg attualmente distribuito dall'rganiaione Mondiale della Sanità (MS), il 3 Standard Internaionale, IS 75/537 (69) (già noto come 1 a Preparaione Internaionale di Riferimento, IRP) è una preparaione ad elevato grado di purificaione ottenuta da urine di donne in gravidana con un sistema di unità basato su standard di hcg precedenti calibrati con dosaggi biologici. Poiché né l'ahcg (IRP 75/569) né la ~hcg (IRP 75/551) hanno una attività biologica nota, le concentraioni assegnate sono espresse in unità arbitrarie; questo rende difficile il confronto delle concentraioni di ahcg, ~ hcg e hcg, anche perché le unità utiliate per esprimere la concentraione delle prime due molecole non hanno alcuna relaione con quelle utiliate per l'hcg. Come è mostrato nella Tabella 5, facendo alcune supposiioni, è possibile LlGAND ASSAY VL 5 NUMER 2 ANN 2000

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