LA DIAGNOSI IN VITRO S.NASI

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1 LE INTOLLERANZE ALIMENTARI ED IL LABORATORIO LA DIAGNOSI IN VITRO S.NASI

2 ALLERGIA GASTROINTESTINALE. Il tratto GI per varie ragioni, sembra rappresentare un luogo di elezione per le reazioni allergiche: in primo luogo il tratto GI costituisce una delle più vaste superfici dell organismo (circa 44 m²), ed è stimolato quotidianamente da migliaia di antigeni esogeni quali proteine, additivi alimentari, pollini ed altri agenti inalanti deglutiti inconsciamente. La mucosa intestinale è però dotata di un esteso sistema immunitario (GALT), che comprende circa i due terzi di tutti i linfociti e contiene importanti cellule effettrici della flogosi allergica, che peraltro si trovano fisiologicamente nel tratto gastroenterico normale. Si può sospettare un allergia gastrointestinale in presenza di vomito, dolore addominale, meteorismo, diarrea, malassorbimento, sanguinamento intestinale occulto, enteropatia proteinodisperdente.

3 DIAGNOSI IN VITRO 22

4 ACCURATA ANAMNESI CLINICA SUGLI ALIMENTI ED I TEMPI DI REAZIONE DOPO IL CONSUMO (IgE-NON IgE) DIAGNOSI TEST IN VIVO TEST IN VITRO IgE specifiche IMM.BLOTTING DOPO SDS.PAGE RAST INIBIZIONE RICERCA MEDIAT. CHIMICI

5 DIAGNOSI IN VITRO

6 Importanza del laboratorio come fornitore del dato al clinico DIAGNOSI IN VITRO SCELTA DEL SISTEMA ANALITICO SCELTA DEI CONTROLLI DI QUALITA SCELTA DEL TIPO DI REFERTAZIONE 44 Responsabile delle qualità delle informazioni su cui si basa il clinico per una corretta diagnosi

7 Sensibile Specifico Vero (Risultati corretti) Riproducibile Quantitativo Alta efficienza clinica

8 Test vero Alta precisione Test poco vero Alta precisione Test vero Bassa precisione

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10 > Concentrazione=>Sintomi! " # " # #

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12 Eccesso di allergene Linearità delle diluizioni Precisione Riferimento a WHO Target CV non oltre il 15%

13 CONTROLLI DI QUALITA INTERNI CONTROLLI TRA LABORATORI ESTERNI VERIFICA COSTANTE DEL DATO FORNITO DIALOGO CON I MEDICI RICHIEDENTI

14 E QUINDI: CONOSCENZA DELLE PERFORMANCES DEL METODO A DISPOSIZIONE,CON ANALISI CRITICA DEI LIMITI CHE ESSO INEVITABILMENTE POSSIEDE,PER CONCORRERE AD UNA DIAGNOSI CLINICA PRECOCE,MIRATA, ED UTILIZZABILE NEL MONITORAGGIO TERAPEUTICO. (Ig G ALIMENTARI,VELENI IMENOTTERI)

15 REAZIONI AVVERSE AGLI ALIMENTI: 1ALLERGIE IgE MEDIATE OAS GASTRITI ENTERITI 2INTOLLERANZE ALIMENTARI (NON IgE) 3 DA ALIMENTI ISTAMINA-LIBERATORI 1 IN PZ.CON POLLINOSI ( CIRCA IL 40%) 2 SENZA POLLINOSI (PANALLERGENI)

16 PROFILINE PATHOGENESIS RELATED PROTEINS ALLERGENI CROSS-REATTIVI SINDROME ORALE ALLERGICA LIPID TRANSFER PROTEINS CHITINASI CROSS-REACTIVE CARBOHDRATE ALTRI

17 PROFILINE:MOLECOLE UBIQUITARIE CON P.M. TRA 12 E 16 kda,presenti SIA NEI POLLINI SIA NEGLI ALIMENTI VEGETALI,ANCHE IN SPECIE FILOGENETICAMENTE DISTANTI(BET V1,MAL d2,) FUNZIONE:INIBISCONO LA POLIMERIZZAZIONE DELLA G-ACTINA,AGENDO COSI SULLA MOBILITA VITALE. MEDIATORI DI CROSS-REATTIVITA TRA POLLINI E FRUTTI ESOTICI(BANANA,ANANAS,LATEX)

18 PATHOGENESIS RELATED PROTEINS PROTEINE CON Pm TRA 16 E 18 kda,molto COMUNI NEL REGNO VEGETALE,DOVE SVOLGONO FUNZIONI BIOLOGICHE DI DIFESA, SOPRATTUTTO CONTRO AGENTI MICROBICI E FUNGINI. POSSONO ESSERE SOVRAESPRESSE DALLE PIANTE IN CONDIZIONI DI STRESS,INFLUENZANDO IL TASSO DI SENSIBILIZZAZIONE AGLI ALLERGENI MAGGIORI.SONO STABILI ANCHE A BASSI Ph E RESISTONO ALLE PROTEASI. SI POSSONO SUDDIVIDERE IN 14 FAMIGLIE.

19 LIPID TRANSFER PROTEINS SONO POLIPEPTIDI DI CIRCA 90 AA,A BASSO P.M. E SI TROVANO NEGLI STRATI EPITELIALI ESTERNI DEGLI ORGANI DELLE PIANTE,DETERMINANDO UNA MAGGIORE ALLERGENICITA DELLA BUCCIA DEI FRUTTI,RISPETTO ALLA POLPA. SONO ALLERGENI MOLTO STABILI. SONO COINVOLTE NEL SISTEMA DI DIFESA DELLE PIANTE CONTRO GLI ATTACCHI MICROBICI. ALTA IDENTITA TRA LTP DI PESCA,PRUGNA,ALBICOCCA E CILIEGIA. POSSONO SENSIBILIZZARE DIRETTAMENTE ATTRAVERSO LA VIA GASTROINTESTINALE.

20 CROSS - REATTIVITA

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22 CROSS REATTIVITA CROSTACEI TROPOMIOSINA ACARI

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24 PROBLEMATICHE INERENTI LE IgE SPECIFICHE IN VITRO LABILITA DEGLI ESTRATTI (FALSI NEG.) ACCENTUAZIONE CROSS-REACTION, DOVUTA ALLE ALTERAZIONI CHIMICHE NELLA FASE DI ESTRAZIONE E PURIFICA- ZIONE DEGLI ALIMENTI: AC.FENOLICI COME SUPERARLE? (O2/POLIF.OX.) CHINONI E POLI- FENOLI REATTIVI IN VITRO.

25 NUOVE OPPORTUNITA CON GLI ALLERGENI RICOMBINANTI Con l utilizzo delle proteine allergeniche prodotte con tecnologia ricombinante,si aprono nuove opportunita :migliori test e nuovi strumenti per la gestione delle problematiche cliniche ed immunologiche. Si possono raccogliere informazioni sui sintomi evidenziati,a livello molecolare.

26 Si preparano nuovi dosaggi in vitro per studiare fenomeni complessi come la diversa reattivita clinica in dipendenza dell area geografica,o per giustificare le cross reattivita tra allergeni tassonomicamente non correlati,o per meglio definire profili di sensibilizzazione e determinare il trattamento piu efficace.

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31 ALLERGENI RICOMBINANTI ED ESTRATTIVI G6

32 Allergeni: antigeni ricombinanti Allergeni: antigeni ricombinanti

33 Tecnologia ricombinante eucariota Baculovirus - Cellule di Insetto Spodoptera Frugiperda Baculovirus Autographa californica Multi Nuclear Polyhedrosis Virus Ospite specifico Elevata virulenza Lisi delle cellule intestinali Virus DNA circolare (135 kb) Capside di poliedrina Promotori della poliedrina Cellule eucariote Il sistema EliA per i dosaggi in autoimmunità Diapo n 1

34 Costruzione del segmento DNA ricombinante (esempio transglutaminasi) Sequenza genica proteina umana (transglutaminasi) Segmento His-Tag Sequenza aminoacidica ( aa) 6-His Il sistema EliA per i dosaggi in autoimmunità Diapo n 2

35 Costruzione del Baculovirus ricombinante Inserimento del segmento genico nel genoma virale tramite ricombinazione omologa Il sistema EliA per i dosaggi in autoimmunità Diapo n 3

36 ttg umana ricombinante da baculovirus/cellule di insetto LMW Standard ttg umana ricombinante da E.Coli LMW Standard 97 kda 66 kda 45 kda 30 kda 20.1 kda 97 kda 66 kda 45 kda 30 kda 20.1 kda 14.4 kda Il sistema EliA per i dosaggi in autoimmunità Diapo n 9

37 Benefici Proteina omologa (umana) Bassi costi allestimento colture Buona induzione della sintesi proteica Elevato rapporto di espressione Purificazione con sistemi Tag Limiti Transglutaminasi ricombinante da E.Coli Creazione struttura tridimensionale Modificazioni post-traslazionali Formazione di corpi di inclusione Necessaria una forte purificazione (contaminazioni sono cross-reattive) Problemi nella purificazione IMAC Il sistema EliA per i dosaggi in autoimmunità Diapo n 8

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39 UN IMPORTANTE ASPETTO: QUALITA ED ECONOMICITA

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42 BAMBINI 0-4 ANNI Phadiatop Infant NEGATIVO POSITIVO Principali allergeni Alimentari Albume f1 Latte f2 lattoalbumina f76 β lattoglobulina f77 Caseina f78 Pesce f3 Grano f4 Arachidi f13 Soia f14 Pomodoro f25 Principali allergeni Inalanti Dermatofagoide pt. d1 Dermatofagoide fa. d2 Forfora gatto e1 Forfora cane e5 ParIetaria w19 Erba canina g2 Coda di topo g6 Aspergillus m3 Alternaria m6 Betulla t3 nocciolo t4

43 BAMBINI 5-14 ANNI Phadiatop NEGATIVO POSITIVO Dermatofagoide pt. d1 Betulla t3 Dermatofagoide fa. d2 Nocciolo t4 Forfora gatto e1 Olivo t9 Forfora cane e5 Cipresso t23 Aspergillus m3 Erba canina g2 Alternaria m6 Logliarella g5 Ambrosia w1 Coda di topo g6 Assenzio w5 Gramigna g8 ParIetaria w19

44 ! !2 2 3 " &*&0# 4:7 &"8"# "*(#"0*"# ;47

45 E,PER CONCLUDERE,UNA PROPOSTA OPERATIVA SEMPLICE ED UTILE!

46 ... DATA DI NASCITA:... SESSO:... INDIRIZZO/REPARTO:... DATA:... rinite stagionale rinite perenne asma stagionale asma perenne malassorbime nto orticaria eczema congiunti vite tosse stizzosa edema cute/mucose DOSAGGIO DELLE IgE TOTALI DOSAGGIO DELLE IgE SPECIFICHE : annerire il quadrato degli allergeni richiesti DOSAGGIO DELLA PROTEINA CATIONICA DEGLI EOSINOFILI PHADIATOP INFANT inalanti ed alimenti ( 0 4 anni) PHADIATOP inalanti ( da 5 anni)