Quaderni di Bioinformatica

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1 PROTEOMICA Cristian Piras Alessio Soggiu Paola Roncada Gian Franco Greppi Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani Milano Dipartimento di Scienze Zootecniche, Università di Sassari INTRODUZIONE L era post-genomica ha assistito al rapido sviluppo di nuovi metodi per lo studio di complessi profili proteici e per l espressione genica in tessuti e cellule. Questo nuovo campo di ricerca, comunemente denominato genomica funzionale, focalizza l attenzione sulla dissezione delle reti molecolari che sono alla base delle funzioni cellulari e dei processi fisiologici. L analisi del proteoma, definito come la caratterizzazione del contenuto proteico di cellule, tessuti, organi o fluidi biologici espresso da un genoma, mira allo studio dei complessi schemi di espressione e di trasformazione delle proteine prodotte da un organismo vivente. Diversamente dal genoma, il termine proteoma definisce uno stato dinamico soggetto ad una moltitudine di cambiamenti di natura molto differente come la crescita, il differenziamento, il trattamento con farmaci, la malattia e così via. Negli anni 70, O Farrel riportò che gli strumenti proteomici avrebbero incluso tecnologie basate su metodi elettroforetici e cromatografici. Recentemente, nuove tecniche basate sulla spettrometria di massa (MS) e tecnologie bioinformatiche hanno ampliato lo spettro degli strumenti proteomici. Inoltre, le procedure di separazione proteica classiche come l elettroforesi bidimensionale vengono rimpiazzate gradualmente da altre tecnologie innovative, come l elettroforesi zonale capillare accoppiata a metodologie MS e più recentemente dai microarrays e da tecnologie basate sui chip proteici. Proteomica studia tutti i complementi proteici, i proteomi, che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari. Esiste così un Proteoma Completo (riferito ad uno specifico organismo), un Proteoma cellulare (riferito ad un particolare tipo di cellula) e perfino un Proteoma Sub-cellulare (solitamente riferito ai virus). Dobbiamo immaginare il proteoma come un qualcosa di dinamico, la sua composizione varia in risposta a diversi fattori esterni ed è sostanzialmente differente nei diversi tipi cellulari di uno stesso organismo. Il Proteoma è molto più grande del Genoma e mostra almeno due livelli di complessità in più: 1

2 -La conoscenza delle proteine presenti in un sistema biologico, in termini di sequenze aminoacidiche non basta. La maggior parte delle proteine mostrano, in condizioni fisiologiche, una struttura tridimensionale stabile ed è pertanto necessario risalire alla loro struttura per poterne ben comprendere anche il loro funzionamento. Questo livello di complessità aumenta notevolmente se consideriamo anche l'esistenza di modificazioni posttraduzionali ed isoforme. -Le proteine possono interagire funzionalmente tra loro, con gli acidi nucleici e con piccole molecole di varia natura. Lo studio a più livelli del Proteoma è affidato alla Proteomica, moderna area altamente multidisciplinare che richiede l integrazione di conoscenze biochimiche, bioanalitiche, bioinformatiche e biomolecolari. Al giorno d oggi, la proteomica può essere divisa in proteomica classica e proteomica funzionale. La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi, mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine. In maggior dettaglio la proteomica si sviluppa su tre diversi livelli: proteomica sistematica, che mira all'identificazione ed alla caratterizzazione del proteoma; proteomica differenziale, che punta sull'espressione differenziale delle proteine in cellule diverse di uno stesso organismo ed in momenti di vita diversi di una stessa cellula; proteomica funzionale, che a sua volta comprende lo studio delle interazioni tra proteine (interattomica), lo studio delle interazioni tra una proteina ed i suoi substrati (metabolomica) e lo studio delle funzioni specifiche delle proteine (genomica enzimatica, genomica biochimica). Le tre domande più importanti della proteomica sono: 1) Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto? 2) Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse (network)? 3) Come appare una particolare proteina (struttura)? La proteomica rappresenta l approccio globale per l analisi comparativa e su larga scala dell intero corredo proteico espresso da una cellula, tessuto o organismo in determinate condizioni ambientali. Si avvale della combinazione di tecnologie di analisi diverse, biochimiche ed informatiche, che consentono di studiare simultaneamente migliaia di proteine e che, nel loro insieme, permettono di decifrarne la struttura, comprenderne le interazioni ed analizzarne la funzione. La proteomica costituisce l imprescindibile complemento alla genomica e, nel tentativo di superarne i limiti intrinseci legati alla staticità del genoma, affronta le difficoltà correlate alla enorme varietà e variabilità di un corredo proteico che muta continuamente in risposta ad ogni tipo di evento intra- ed extra-cellulare. Le tecnologie d elezione per l analisi proteomica sono inevitabilmente dotate della capacità di separare ed identificare un elevato numero di proteine. 2

3 Alcuni degli obiettivi della proteomica Identificazione di nuovi bersagli proteici per farmaci Validazione dei bersagli Profilo d azione dei farmaci (tossicologia in vitro ) Farmaco-proteomica (tossicologia in vivo) Comparazione tra tessuti malati e normali Comparazione tra tessuti malati e trattati farmacologicamente Studio delle modificazioni post-trascrizionali Strategie integrate con la genomica Applicazioni nel campo bio-medico Determinazione di markers di patologie nei fluidi corporei Studi farmacologici Studi tossicologici Analisi dei tessuti nelle patologie tumorali Cenni storici Le PROTeine espresse dal genoma sono state così definite PROTEOMA, termine che venne utilizzato per la prima volta in pubblico da Marc Wilkins (Wilkins et al., 1996) al primo congresso di proteomica di Siena nel Il campo di ricerca, invece, ha preso il nome di proteomica ed è stato definito come l impiego dell analisi quantitativa nella determinazione dei livelli di proteine per la caratterizzazione dei processi biologici e per la comprensione dei meccanismi di controllo dell espressione genica. il termine era già apparso nella biologia moderna 13 anni prima, quando Anderson e Anderson (1981) proposero la costituzione di un atlante delle proteine umane. Ma esistono altre definizioni che di seguito riportiamo. "The ensemble of various technologies necessary to identify and ascribe biology to proteins in vivo" (DM&D proteomics report). "Part of the functional analysis of gene products including large-scale identification and interaction studies of proteins" (Nature Biotech). "The complete profile of proteins present in the cell, in the tissue, and the body as a whole" (Leroy Hood). "The large scale study of proteins, usually by biochemical methods" (Matthias Mann). Nel gennaio del 1970 apparve sulla rivista Analytical Biochemistry il primo lavoro in cui veniva descritta una tecnica che combinava l isoelettrofocalizzazione in condizioni native all SDS-PAGE su gradiente di 3

4 poliacrilammide per la separazione di proteine del siero. Gli autori, nelle conclusioni, affermarono che la tecnica impiegata aveva: evidenti applicazioni nella caratterizzazione del materiale genetico polimorfico, nella verifica dell'eterogeneità delle proteine e nella risoluzione delle miscele complesse di proteine (Kenrick e Margolis, 1970). Cinque anni dopo, nel 1975, O Farrell (O Farrell, 1975), Klose (Klose, 1975) e Scheele (Scheele, 1975) descrissero, per la prima volta e contemporaneamente, un sistema di elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-E) che impiegava, in prima dimensione, una IEF in condizioni denaturanti. Il lavoro di O Farrell, sebbene pionieristico e realizzato in condizioni estremamente complicate e laboriose, permise di individuare, in un solo gel 2D, ben 1100 spot distinti, corrispondenti ad altrettante proteine di Escherichia coli. Figura 1. Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione. Nonostante i clamorosi risultati però, la 2D-E, per molti anni dopo la sua ideazione, non entrò a far parte delle tecniche di largo impiego nei laboratori di ricerca a causa degli elevati limiti dei sistemi per l identificazione delle proteine ma, soprattutto, per la carenza di protocolli e reagenti adeguati che conducevano a risultati eccessivamente variabili. In particolare, l impiego di anfoliti carrier per la produzione di gradienti di ph nell isoelettrofocalizzazione rendeva estremamente difficile ottenere un soddisfacente grado di riproducibilità 4

5 delle mappe 2D e, dunque, la comparazione dei dati inter- ed intra-laboratorio appariva pressoché impossibile. Inoltre, tali anfoliti erano inidonei alla separazione di campioni contenenti quantità preparative di proteine (Herbert et al., 1997). L introduzione dei gradienti immobilizzati di ph (IPG) co-polimerizzati in strisce di gel di poliacrilammide eliminò il problema dell instabilità dei gradienti e della ridotta capacità di carico dei campioni (Bjellqvist et al., 1982; Gorg et al., 1988; Righetti, 1990). Tale innovazione, unita ai progressi nella spettrometria massa e allo sviluppo di strumentazioni e metodi di processamento automatizzati, facilitò l approccio all elettroforesi bidimensionale e rese l'analisi proteomica estremamente agevole, affidabile ed efficace consentendone la diffusione. A partire dagli anni 90, la proteomica ha conquistato uno spazio sempre più ampio nella ricerca biochimica fino a diventare un campo di ricerca a sé stante e perfino a determinare l esigenza dell impiego di una nuova terminologia. L improvviso e rapido sviluppo dell analisi proteomica è facilmente deducibile anche dal considerevole incremento che, nella banca dati PubMed, ha subito la citazione di termini ad essa riferiti. La prima pubblicazione scientifica che menziona tali tecniche è apparsa nel Luglio del 1995 (Wasinger et al., 1995) e nel 2004, dopo soli nove anni, gli articoli pubblicati, correlati a questo campo di ricerca erano ben Figura 2. Tipico workflow di un analisi proteomica. Le proteine vengono estratte dal campione (costituito da cellule, tessuti o fluidi biologici), separate mediante elettroforesi bidimensionale. Le risultanti macchie proteiche ( spot ) vengono escisse dal gel e sottoposte a digestione enzimatica o chimica. I peptidi in miscela vengono 5

6 successivamente analizzati mediante spettrometria di massa. La ricerca in banche dati permette infine di identificare le proteine (Peptide Mass Fingerprinting). Il crescente interesse del mondo scientifico per le potenzialità dell analisi proteomica, unito alla elevata riproducibilità dei risultati, ha indotto molti gruppi di ricerca a rendere disponibili le proprie mappe 2D sulla rete informatica mondiale (World-Wide Web), mediante l allestimento di banche dati dedicate. Attualmente sono accessibili in rete molti server che, oltre a contenere un database di gel 2D, offrono una vasta gamma di servizi e software gratuiti per l analisi proteomica. Uno tra i più noti e completi server di proteomica, denominato ExPASy (Expert Protein Analysis System), è gestito dall Istituto Svizzero di Bioinformatica (SIB); dalla pagina principale del sito (http://www.expasy.ch/) è possibile accedere, tramite un collegamento, alla banca dati di mappe bidimensionali SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/ch2d/) (Appel et al., 1994; Wilkins et al., 1999; Hoogland et al., 1999; Gasteiger et al., 2003). Le fasi dell analisi proteomica L analisi del proteoma prevede, generalmente, le seguenti fasi: estrazione delle proteine da una matrice organica, separazione delle proteine contenute nell estratto cellulare, analisi d immagine dei pattern di separazione ed identificazione delle proteine. Elettroforesi bidimensionale L'analisi 2D-E è una tecnica che sfrutta la duplice separazione di miscele complesse di proteine in funzione del punto isoelettrico (pi) e, successivamente, del peso molecolare (Mr) mediante SDS-PAGE. La preparazione del campione, che consiste nella solubilizzazione della componente proteica di interesse con detergenti non ionici e zwitterionici, è seguita dalla focalizzazione isoelettrica (isoelettrofocalizzazione, IEF), effettuata su supporti di gel di poliacrilammide contenenti un gradiente di ph immobilizzato (IPG). Durante l IEF, le proteine migrano nel gradiente fino a raggiungere una posizione fissa dove la loro carica netta è nulla. Le bande proteiche focalizzate in prima dimensione vengono poi risolte ortogonalmente in funzione del peso molecolare tramite la tradizionale elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE). Il risultato è una mappa di "spot" che possono essere ulteriormente separati, identificati e caratterizzati. Preparazione del campione Una adeguata preparazione del campione è assolutamente essenziale per ottenere buoni risultati. A causa della enorme diversità di tipi e fonti di proteine, la procedura ottimale di preparazione deve essere determinata 6

7 empiricamente per ciascun campione. Idealmente, il processo dovrà provocare la solubilizzazione, la disgregazione, la denaturazione e la riduzione completa di tutte le proteine contenute nel campione. Per caratterizzare specifiche proteine di una miscela complessa, le proteine di interesse devono trovarsi, nelle condizioni elettroforetiche, in uno stato completamente solubile. La solubilizzazione può essere definita come il processo che distrugge le forze di aggregazione (Tab. 1) tra gli analiti (nel caso specifico, le proteine) ed altri componenti (sia proteine che composti non proteici); tale processo elimina pertanto le sostanze interferenti e previene una secondaria riaggregazione degli analiti durante il processo di separazione (elettroforesi). Natura dell interazione Energia di interazione (Kcal/mol) Agenti impiegati per la disgregazione Ponti disolfuro 40 Riducenti (alchilanti facoltativi) Legami ad idrogeno 3 8 Caotropi Interazioni elettrostatiche 2 5 Sali, Detergenti polari, Caotropi, Molecole con dipolo netto (meno efficienti) Ione-Dipolo 1 Sali, Molecole dipolari, Caotropi Dipolo-Dipolo 0.3 Sali, Molecole dipolari, Caotropi Van der Waals Interazioni idrofobiche? Caotropi, Detergenti Tabella 1. Principali forze implicate nella coesione proteica e interazione con altre molecole (Rabilloud, 1996) In definitiva, il protocollo di solubilizzazione dipenderà dalle richieste del metodo di purificazione (in questo caso, l elettroforesi), dalla scelta delle condizioni (native o denaturanti), e dall eventuale necessità di rimuovere sostanze interferenti (sali, lipidi, acidi nucleici, polisaccaridi, ecc.) (Tab. 2). I sali non interferiscono perchè danno un forte legame con le proteine, ma disturbano l elettroforesi: quindi è necessario dializzare, meglio se contro un agente denaturante, in modo che si limitino le perdite di proteine. Tipicamente, la massima concentrazione salina tollerabile in un campione da caricare in prima dimensione dovrebbe essere 50 mm. I lipidi danno due tipi di problema dipendenti dalla loro struttura supramolecolare: se sono monomeri o se si presentano assemblati. Se sono presenti come monomeri, essi possono legare alcune proteine, di solito carrier di lipidi. Questo può quindi portare ad uno sfalsamento del peso molecolare. Tale problema è facilmente risolvibile utilizzando un detergente. Se sono presenti in forma assemblata si può denaturare o precipitare con etanolo o acetone che spesso forniscono una utile seppur parziale delipidizzazione (Menke, 1980; Penefsky, 1971). 7

8 Per quanto concerne gli acidi nucleici e i polisaccaridi, essi vanno eliminati perché incrementano la viscosità e compromettono la separazione elettroforetica: basta rimuoverli centrifugando il campione a g. Un altro modo è digerire gli acidi nucleici con DNAsi o RNAsi; l ovvio inconveniente è che tali enzimi aggiunti verranno poi visualizzati nel gel. Un elenco dei metodi maggiormente impiegati per la rimozione di composti interferenti è riportato in Tabella 3. Metodi Sali Lipidi Acidi Nucleici Polisaccaridi Pigmenti Recupero Proteina Detergenti - S/Lc S b V b - S Ultracentrifugazione - ± c S V L - S Precipitazione con ioni complessi - - S V - V TCA S L - V V S TCA/solvente S S - V S V Solfato d ammonio + d S e S f V g V g S Solvente (h) - S - - S V Tabella 2. Esempi di metodi di rimozione di sostante interferenti (da Rabilloud, 1996) LEGENDA: S soddisfacente; V variabile; VL variabile con la taglia del composto; L limitata; Lc limitata, dipendente dalla concentrazione del composto; - inefficiente. a) Pigmenti, terpeni, polifenoli ed altri composti correlati b) Efficiente solo con detergenti cationici (che inducono precipitazione), abbinata a centrifugazione per rimuovere il precipitato. c) Alcuni lipidi possono formare uno strato superficiale durante la centrifugazione, nei casi favorevoli, questo strato può essere rimosso. d) I sali sono rimossi, ma rimpiazzati con solfato d ammonio residuo, che si può eliminare con etanolo al 70%. e) Spesso si induce il galleggiamento dei lipidi. f) Efficiente con una procedura in due tempi: dissociazione delle proteine dagli acidi nucleici in solfato d ammonio M, ultracentrifugazione per rimuoverli, dopodiché si arriva quasi alla saturazione in solfato d ammonio per precipitare le proteine. g) Variabile, la solubilità in solfato d ammonio concentrato non è prevedibile. Includendo la precipitazione acetato d ammonio/ fenolo. 8

9 Da quanto detto finora appare evidente che per solubilizzare proteine presenti in campioni diversi sono richiesti trattamenti e condizioni differenti. L'efficacia della solubilizzazione dipende dalla scelta del metodo di lisi delle cellule, dai metodi di concentrazione e dissoluzione delle proteine e dal tipo di detergenti usati e dalla composizione del campione. Se qualcuno di questi punti non viene ottimizzato per il particolare tipo di campione da analizzare, le separazioni possono risultare incomplete o distorte e molte informazioni possono andare perse. Nonostante, però, non sia possibile trovare un unico protocollo capace di solubilizzare tutte le proteine di un campione, esistono attualmente molti protocolli di solubilizzazione applicabili alla maggior parte dei campioni biologici e studiati per avere la minima manualità, la massima attenuazione dell interferenza nella migrazione, la solubilizzazione di proteine sia idrofobiche che idrofiliche nonché di polipeptidi ricchi in cisteine ed, infine, la riduzione della degradazione proteolitica (Tab. 3). Tipo di campione Tampone di solubilizzazione Cellule eucariotiche urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2%, TX-100 2%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM, PMSF 3mM Membrane cellulari, urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2%, TX-100 2%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM membrane globulo rosso Tessuto muscolare tal urea 9.5M, CHAPS 2%, DTT 1%, Anfoline 2%, PMSF 3mM quale Tessuti già estratti ad Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM esempio con guanidinio cloruro (es. muscolo, fegato, rene, ghiandola mammaria, cervello) Urine Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6% Estratto da microrganismi Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 10mM Siero, plasma, liquido Urea 8M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM sinoviale Latte urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, DTT 1%, Anfoline 1.6%, TRIS 15mM Tabella 3. Linee guida per la solubilizzazione di alcuni campioni campioni biologici Nota: L importanza della quantificazione proteica nel campione non dovrebbe essere sottovalutata. Ad esempio, nel caso dei campioni sierici, un problema tipico è l alta abbondanza relativa di due classi di proteine, l albumina e le immunoglobuline, che spesso mascherano le componenti minori ovvero le proteine che, nella mappa bidimensionale, si trovano nelle immediate vicinanze del medesimo intervallo di separazione di quelle maggiormente rappresentate. 9

10 Prima dimensione: Focalizzazione Isoelettrica (IEF) I gradienti di ph immobilizzato si basano sul principio che il gradiente di ph, preformato rispetto alla corsa elettroforetica, è copolimerizzato, e quindi reso insolubile, entro le fibre della matrice di poliacrilammide. Ciò è possibile utilizzando, come tamponi, dei derivati poliacrilammidici aventi dei valori di pk ben distribuiti nell intervallo Questi composti sono derivati acrilammidici con la struttura generale: CH2 = CH CO-NH-R dove R può contenere o un gruppo carbossilico o un gruppo amminico terziario o gruppi solfato o ammonico quaternario. Tali derivati acrilammidici prendono il nome di Immobiline. Durante la polimerizzazione del gel, i tamponi e i titolanti sono efficientemente incorporati nel gel, il che assicura in ogni punto un dato valore di ph di illimitata stabilità. La distanza tra il doppio legame ed il gruppo che prende parte all equilibrio proteolitico deve essere scelto sufficientemente lungo da influenzare il doppio legame per trascurare la relativa costante di dissociazione. Come risultato, la differenza di pk tra le Immobiline libere e legate è principalmente dovuta alla presenza della matrice poliacrilammidica e alle variazioni di temperatura durante la corsa elettroforetica. I gradienti di ph immobilizzati possono essere creati nello stesso modo di un gel in gradiente di poliacrilammide convenzionale, utilizzando un gradiente di densità per stabilizzare il gradiente di concentrazione delle immobiline con l ausilio di un classico gradientatore bicamere. Questi tamponi non sono molto anfoteri, ma piuttosto bifunzionali: ad un estremità della molecola si colloca il gruppo tamponante mentre all altra estremità è presente il doppio legame acrilico che si consumerà durante il processo di polimerizzazione. L IEF su IPG è una tecnica elettroforetica nella quale i composti anfoteri sono frazionati in accordo con i loro punti isoelettrici lungo un gradiente di ph continuo (Bjellqvist et al., 1982). Contrariamente all elettroforesi zonale, dove il ph costante (tamponato) del mezzo di separazione stabilisce una densità di carica costante sulla superficie della molecola e la fa migrare con mobilità costante (in assenza di setacci molecolari), la carica superficiale di un composto anfotero nell isoelettrofocalizzazione cambia e diminuisce, in accordo con la sua curva di titolazione, così come si muove lungo un gradiente di ph fino a che raggiunge la sua posizione di equilibrio (la regione dove il suo ph eguaglia il punto isoelettrico): perciò la sua mobilità è uguale a zero e la molecola si ferma (Fig. 3). Contrariamente al focusing convenzionale in tamponi anfoteri, dove il gradiente è creato e mantenuto dal passaggio di una corrente elettrica attraverso una soluzione di composti anfoteri che 10

11 hanno punti isoelettrici spazialmente vicini, nel focusing su gradiente di ph immobilizzato il gradiente preesiste al passaggio della corrente, essendo creato quando si polimerizza il gel. Figura 3. Isoelettrofocalizzazione: le proteine raggiungono la regione del gradiente dove il ph eguaglia il loro pi. Questa innovazione ha permesso di superare tutti i problemi connessi con il focusing convenzionale: il limite di rivelazione, il fatto di poter procedere ad un elettroforesi preparativa, l esatta determinazione del punto isoelettrico. Inoltre la sintesi di Immobiline basiche (Chiari et al., 1989, 1990) ha permesso di coprire intervalli di ph estremamente alcalini, il che costituiva un grosso limite per il focusing convenzionale. Per quanto riguarda la tecnica bidimensionale, è possibile procedere polimerizzando un gel su gradiente di ph immobilizzato dell intervallo voluto; dopo averlo accuratamente lavato ed essiccato si tagliano delle strisce della larghezza di 3 mm (in alternativa si possono utilizzare delle strisce già fatte, in commercio) e si rigonfia per un periodo che va da sei ore a tutta la notte, con agenti denaturanti, detergenti e riducenti (tipicamente urea 7-8M, tiourea 2M, CHAPS 2-4%, DTT 1-2%). A questo punto, dopo aver pretrattato il campione, si può fare avvenire la corsa elettroforetica, sempre rigorosamente sotto olio di paraffina che impedisce all anidride carbonica di essere adsorbita dal gel, e quindi portare ad un acidificazione della matrice con conseguente errata lettura dei punti isoelettrici (Bossi et al., 1994). Una volta effettuata la focalizzazione, con un tempo che va in media dalle 13 alle 20 ore, ad una temperatura di 20 C si passa alla seconda dimensione, previo opportuni passaggi di equilibrazione. 11

12 Equilibrazione delle strisce Le strisce IPG devono essere equilibrate due volte, ciascuna volta per 15 minuti in un opportuno volume di tampone di equilibrazione. Tale tampone contiene una soluzione 6M urea, e 30% glicerolo, per diminuire gli effetti elettroendoosmotici (Görg et al., 1988) responsabili della riduzione delle proteine tra la prima e la seconda dimensione. Nel primo passaggio si aggiunge ditiotreitolo (DTT) all 1% per ridurre completamente le proteine, mentre durante il secondo passaggio viene aggiunta della iodoacetamide (IAA) 260 mm al tampone di equilibrazione per rimuovere l eccesso di DTT (responsabile dei cosiddetti point streaking nei gel colorati con l argento) ma soprattutto per carbammidometilare i residui di cisteina; questo al fine di rompere irreversibilmente i ponti disolfuro e di mantenere le proteine il più lineari possibile. Le strisce di gel così equilibrate sono poi rapidamente sciacquate nel tampone di corsa della seconda dimensione (SDS-tris-glicina) per rimuovere l eccesso di tampone di equilibrazione e quindi applicate sul gel di seconda dimensione (SDS- PAGE). Seconda dimensione: SDS-PAGE L elettroforesi bidimensionale si conclude tecnicamente nella seconda dimensione, che può essere sia verticale che orizzontale. Le proteine separate in base al loro punto isoelettrico, vengono successivamente fatte correre ortogonalmente su di un gel di poliacrilamide in presenza di sodiododecilsofato (SDS). Il surfattante SDS si lega alle proteine, coprendo la loro carica intrinseca e conferendo a tutti i polipeptidi la stessa densità di carica. In queste condizioni le proteine vengono separate solo in base alla loro diversa massa molecolare, tramite l effetto setaccio creato dai pori del gel di poliacrilammide (Herbert, 1997) (Fig. 4). Figura 4. SDS-PAGE: le proteine precedentemente focalizzate migrano verso l anodo e si separano in funzione della loro massa molecolare 12

13 Per ciò che riguarda la seconda dimensione verticale, esistono varie taglie del gel, che solitamente sono spessi mm, viene cioè polimerizzato un running gel (Laemmli, 1973) che può essere o omogeneo o in gradiente di porosità. Una volta polimerizzato il gel, anziché creare uno stacking, si crea una matrice con una soluzione bollente di agarosio allo 0.5% p/v in tampone di corsa, e, prima che tale soluzione gelifichi, si posiziona la striscia di prima dimensione in tale fluido a diretto contatto con il gel running. Se si desidera far correre la seconda dimensione orizzontalmente, si possono utilizzare gel precast commerciali oppure crearli su supporto di Gel Bond, come per la prima dimensione. In questo caso (gel orizzontale) il tampone può o riempire la vasca dell elettroforesi o essere ceduto da apposite buffer strip commerciali; la striscia di IPG fatta precedentemente correre ed equilibrata viene posizionata a faccia in giù sul gel, schiacciandola delicatamente in modo da permettere la perfetta aderenza delle due matrici. Sistemi per l elettroforesi bidimensionale Prima dimensione Seconda dimensione IPGphor Multiphor ETTAN Daltsix ProteanII 13

14 Visualizzazione La colorazione al nitrato d argento rimane il metodo analitico di elezione, poiché la sensibilità è circa 10 volte maggiore rispetto ad una colorazione in coomassie colloidale con coomassie brilliant blue (CBB) G-250 e 100 volte maggiore rispetto ad una colorazione in coomassie con CBB R-250. Di conseguenza, il Silver è il metodo di prima scelta qualora si avessero bassissime quantità di campione analizzate in focusing. Sono state pubblicate un cospicuo numero di metodiche al nitrato d argento, basate sulle tecniche di staining di Merril et al., (1981) e successive modificazioni (Blum et al., 1987, Heukeshoven, 1988). Qualora si voglia quantificare l abbondanza relativa esatta delle proteine, le principali colorazioni per gel preparativi sono il tradizionale coomassie colloidale con CBB G-250 oppure le colorazioni tramite coloranti fluorescenti quali ad esempio il SYPRO Ruby (Molecular Pobes) o il Deep Purple (GE Ealthcare). E possibile inoltre colorare selettivamente proteine con determinate modificazioni post-traduzionali sempre con coloranti fluorescenti specifici come il ProQ Diamond (Molecular Probes) per le fosfoproteine o il ProQ Emerald (Molecular Probes) per le glicoproteine. Tutti questi coloranti fluorescenti necessitano di scanner a fluorescenza (laser o a luce bianca) che siano in grado di irradiare i gel con le lunghezze d onda appropriate per eccitare i vari flourofori legati alle proteine. Se invece si desidera identificare una particolare proteina all interno del gel avendo a disposizione un anticorpo specifico non si esegue la colorazione tradizionale ma si fa innanzi tutto un western-blotting (Towbin 1979) e poi eventualmente una reazione antigene-anticorpo colorimetrica. Per ciò che riguarda il blotting, se si ha a disposizione un gel orizzontale SDS, va innanzi tutto rimosso il gel bond, supporto della matrice stessa del gel; ciò ovviamente non è necessario quando il gel che si desidera blottare è un Laemmli classico. Si definisce western-blotting il trasferimento della separazione elettroforetica delle proteine su una membrana di nitrocellulosa o PVDF. Il trasferimento viene effettuato in maniera semi-dry, utilizzando due elettrodi di grafite, tra i quali si crea una specie di sandwich con la carta da filtro 3MM imbevuta di tampone di trasferimento. Una volta effettuato il blotting, si può colorare la membrana con Commassie blue o india ink, oppure si può eseguire una reazione immunologia con lectine specifiche (es. horse radish peroxidases). Analisi d immagine computerizzata. Dopo la separazione delle proteine mediante 2D-E, al fine di procedere all analisi d espressione differenziale, è indispensabile la digitalizzazione delle mappe bidimensionali ed il loro confronto mediante opportuni software d analisi d immagine (Fig. 5). Tali programmi, migliorati periodicamente nel tentativo di raggiungere la completa automatizzazione, consentono di rilevare e misurare gli spot presenti sul gel dopo aver ridotto il rumore di fondo e rimosso gli artefatti della migrazione (strisciate orizzontali e/o verticali). 14

15 Figura 5. Esempio di interfaccia grafica di un software per l analisi d immagine di mappe 2D La maggior parte dei programmi di analisi d immagine in commercio, però, non identifica automaticamente tutti i punti, specialmente quando la qualità generale della separazione elettroforetica è bassa (ad esempio nelle zone di sovrapposizione degli spot), quindi, solitamente, si rende necessaria l individuazione manuale da parte dell operatore degli spot non rilevati. Essendo direttamente correlato al numero di proteine presenti sul gel, alla qualità della separazione e all algoritmo utilizzato, questo processo può essere abbastanza lungo e laborioso. Dopo l individuazione ( detection ), ciascuno spot presente su uno dei gel deve essere abbinato al corrispondente spot presente su tutti gli altri gel ( matching ). Nella maggior parte dei programmi di analisi di immagine, tale operazione prevede, inizialmente, l abbinamento manuale di una serie di spot distribuiti uniformemente sull intera superficie del gel, la cui coincidenza sia facilmente ed inequivocabilmente riconoscibile da parte dell operatore. A partire da questi spot, il programma procede ad abbinare automaticamente tutti gli altri. Al termine del matching, il software genera un prospetto riassuntivo che permette di rilevare le differenze qualitative e/o quantitative esistenti tra gli spot individuati nei diversi gel (Gorg et al., 2004). 15

16 SPETTROMETRIA DI MASSA Negli ultimi decenni del secolo scorso i notevoli progressi tecnologici della spettrometria di massa hanno contribuito notevolmente allo sviluppo della proteomica. L enorme diffusione della spettrometria di massa come tecnica analitica è legata alla sua capacità di misurare una proprietà intrinseca delle molecole: la loro massa. Per l analisi delle molecole con queste tecniche, in passato era necessario che esse fossero in fase gassosa oltre che ionizzate, per questo motivo risultava abbastanza complesso applicare questi metodi di analisi a molecole grandi come le proteine. Enormi passi avanti sono stati compiuti negli ultimi anni grazie all introduzione degli spettrometri di massa con sorgente MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionizzation) o Electrospray che hanno rivoluzionato lo studio delle macromolecole poiché con questi strumenti l analisi parte da campioni solidi o liquidi che solo successivamente passano allo stato gassoso. A queste innovazioni si deve il successo della spettrometria di massa negli studi di proteomica. Uno spettrometro di massa è costituito da tre parti fondamentali: sorgente; analizzatore; rivelatore di ioni. All interno della sorgente i campioni vengono ionizzati e passano in fase gassosa; gli ioni cosi formati raggiungono l analizzatore e vengono discriminati in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Tutti gli analizzatori necessitano di un vuoto particolarmente spinto per il loro funzionamento, fondamentale per permettere agli ioni di raggiungere il rivelatore senza collidere con altre molecole, poiché questo potrebbe abbassare notevolmente la risoluzione e la sensibilità dello strumento, provocando la frammentazione non desiderata degli ioni stessi. Gli analizzatori a tempo di volo (TOF) sono comunemente utilizzati con le sorgenti MALDI, mentre analizzatori a quadrupolo e a trappola ionica sono i più comuni analizzatori accoppiati a sorgenti del tipo electrospray. Il concomitante sviluppo dell elettronica e dell informatica, inoltre, ha consentito la creazione di database di sequenze nucleotidiche e amminoacidiche e di opportuni software da usare per l interrogazione degli stessi. Tutto questo ha reso molto più semplice e rapida l interpretazione dei risultati ottenuti dalle analisi di spettrometria di massa. Oggi la spettrometria di massa applicata alla proteomica è usata per l identificazione delle proteine e per il controllo di qualità delle proteine ricombinanti (strumento fondamentale per le biotecnologie). Inoltre è possibile l individuazione e la caratterizzazione di modifiche post-traduzionali e potenzialmente di tutte le modifiche covalenti che alterano la massa della proteina. i. Ionizzazione MALDI Con la spettrometria di massa MALDI si possono analizzare vari tipi di biomolecole. In una sorgente MALDI gli analiti passano direttamente dalla fase solida alla fase gassosa e contemporaneamente vengono ionizzati 16

17 (Karas & Hillekamp 1988). Per consentire l analisi, le molecole sono miscelate ad un grosso eccesso di matrice che serve ad assorbire le radiazioni irradiate da un raggio laser. Le matrici utilizzate sono piccole molecole organiche aromatiche che hanno elettroni delocalizzati in un sistema di orbitali coniugati; inoltre queste molecole sono acidi organici deboli che quando eccitate trasferiscono un protone alle molecole di analita convertendole in specie del tipo MH + (fig. 1.1). Viene utilizzato un raggio di laser pulsato che emette luce con lunghezza d onda nell ultravioletto anche se il meccanismo con cui le molecole ionizzino in una sorgente di questo tipo non è ancora completamente chiaro. Figura 1.1 Sorgente MALDI La ionizzazione MALDI viene considerata una tecnica di ionizzazione soft poiché difficilmente causa frammentazione delle molecole di analita. Ad una sorgente di tipo MALDI viene comunemente accoppiato un analizzatore a tempo di volo (TOF) anche se altre combinazioni sono possibili. ii. Analizzatore a tempo di volo (TOF) per sorgente MALDI Un analizzatore a tempo di volo è costituito da un tubo di lunghezza nota all interno del quale c è un vuoto molto spinto (fig. 1.2). Dopo la ionizzazione in sorgente gli ioni prodotti vengono ugualmente accelerati da una opportuna differenza di potenziale e passano nel tubo di volo. 17

18 Al momento dell ingresso nel tubo di volo gli ioni hanno tutti la stessa energia cinetica, quindi la velocità con cui viaggiano all interno dell analizzatore dipende solo dal loro rapporto m/z; in particolare minore è il rapporto m/z maggiore è la loro velocità. I tempi che ioni con diversi rapporti m/z impiegano per raggiungere il rivelatore sono differenti; lo strumento va quindi ad analizzare gli ioni in base al tempo che impiegano a percorrere il tubo di volo. Gli analizzatori TOF di tipo lineare garantiscono una elevata sensibilità, ma una risoluzione abbastanza scarsa che diminuisce all aumentare delle dimensioni dell analita. La risoluzione è stata migliorata con l introduzione di analizzatori TOF reflector, nei quali gli ioni devono compiere una traiettoria più lunga, rispetto al TOF classico ( lineare ), prima di raggiungere il rivelatore. La risoluzione risulta migliore sia perché gli ioni possono essere meglio separati, sia perché si possono allontanare eventuali ioni frammento. Questi strumenti consentono di ottenere risoluzione isotopiche. Figura 1.2 MALDI-TOF iii. Ionizzazione electrospray Nella spettrometria di massa ad electrospray (ESI/MS) (Fenn et al. 1989; Chait & Kent 1992) l analita viene sciolto in una soluzione acquosa costituita da un solvente organico (solitamente si utilizzano acetonitrile, metanolo oppure isopropanolo), acqua ed in presenza di acido acetico o formico; questa soluzione viene pompata con flussi di pochi l al minuto attraverso un cono con un orifizio dal diametro di pochi mm, al quale è applicata una differenza di potenziale di alcune migliaia di volt ( V). Dall orifizio fuoriesce uno micro spray disperso, le cui goccioline sono costituite dall analita ionizzato circondato da molecole di solvente (fig 1.3). All uscita dal cono un flusso di gas colpisce le goccioline facilitando l evaporazione del solvente; quando le forze di repulsione tra le molecole di analita tutte cariche positivamente supera la tensione superficiale dovuta al solvente, la gocciolina esplode e vengono liberate le molecole di 18

19 campione cariche in fase gassosa; le molecole vengono poi accelerate da una differenza di potenziale e si dirigono verso l analizzatore. Figura 1.3 Sorgente electrospray Questa tecnica di ionizzazione ha la capacità di creare specie multicarica (M+nH) n+ se le specie che stiamo analizzando hanno più siti di ionizzazione; ciò causerà la formazione di varie popolazioni di ioni con un diverso numero di cariche (z); l abbondanza delle varie popolazioni seguirà una distribuzione statistica. Ciò comporta che dall analisi di una singola specie si otterranno spettri costituiti da numerosi segnali con diversi rapporti m/z, che si distribuiranno su una gaussiana. Questa particolarità consente l analisi anche di molecole molto grandi poiché le specie multicarica che si formeranno rientreranno un in intervallo ristretto di valori m/z che rende ideale l accoppiamento di questo tipo di sorgente con analizzatori in grado di esplorare un ristretto intervallo di valori m/z (ad esempio analizzatori a trappola ionica o a quadrupolo). Inoltre la possibilità di generare più segnali da una stessa specie consente di eseguire una misurazione molto accurata della massa molecolare dell analita poiché i valori ottenuti dai singoli m/z possono essere mediati. Solitamente per la generazione di specie multicarica la ionizzazione ESI si presta preferenzialmente all analisi di singole proteine o miscele semplici per evitare di avere dati troppo complessi da interpretare. I sistemi di analisi ESI-MS possono essere utilizzati in serie con sistemi di separazione del tipo RP-HPLC che possono separare gli analiti di una miscela prima dell analisi allo spettrometro. Anche la ionizzazione electrospray è catalogata come tecnica di ionizzazione soft poiché l energia fornita alle molecole per la ionizzazione è insufficiente a causarne la frammentazione in sorgente. 19

20 iv. Analizzatori per sorgente electrospray Gli analizzatori tipicamente associati ad una sorgente electrospray sono il quadrupolo e la trappola ionica. Un analizzatore a quadrupolo (fig. 1.4) è costituito da quattro barre metalliche a cui è applicato un campo elettrico oscillante; all interno del quadrupolo per l effetto del campo elettrico oscillante, gli ioni compiono una traiettoria elicoidale che li porta ad avvicinarsi ed allontanarsi dalle barre. Oltre al campo elettrico, alle barre vengono applicate anche delle radiofrequenze che consentono la separazione degli ioni, poiché solo quelli con un determinato rapporto m/z saranno in risonanza con la radiofrequenza e quindi si muoveranno su traiettorie stabili che consentiranno loro di attraversare l analizzatore; gli altri ioni si muoveranno su traiettorie che li porteranno ad uscire dall analizzatore e di conseguenza non arriveranno al rivelatore. Come l analizzatore a tempo di volo, anche all interno del quadrupolo è mantenuto un vuoto molto spinto; tipicamente questo tipo di analizzatore funziona per un intervallo di valori m/z compreso tra 100 e Figura 1.4 Quadrupolo L analizzatore di massa a trappola ionica è costituito da un elettrodo ad anello e da due elettrodi, uno superiore e l altro inferiore, detti end caps, che chiudono la trappola (fig. 1.5). Il principio di funzionamento della trappola ionica è simile a quello del quadrupolo, in quanto agli elettrodo vengono applicati sia un campo elettrico che una radiofrequenza. La combinazione di RF e DC genera all interno della trappola un campo elettrico tridimensionale che serve a mantenere gli ioni intrappolati tra gli elettrodi; gli ioni si muoveranno all interno della trappola seguendo traiettorie circolari concentriche con raggi che dipendono dal rapporto m/z e dai voltaggi applicati. 20

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