IL MICROSCOPIO: apparecchiatura capace di ridurre il limite di risoluzione dell occhio umano (distanza minima di due punti percepiti come separati

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1 IL MICROSCOPIO: apparecchiatura capace di ridurre il limite di risoluzione dell occhio umano (distanza minima di due punti percepiti come separati tra di loro) a seconda della radiazione utilizzata per esplorare il preparato si possono avere: microscopio ottico: utilizza la luce visibile; è il microscopio ottico in senso stretto microscopio a fluorescenza, a raggi ultravioletti, a raggi infrarossi; utilizzano radiazioni non visibili microscopio elettronico: utilizza elettroni accelerati

2 Unità di misura in microscopia Micron (µ) = 1mm/1000 Nanometro (nm) = 1 µ/1000 Angstron (A ) = 1nM/10

3 Il microscopio ottico Consta di : Stativo Lenti (oculare e obiettivo) Apparato di illuminazione

4 Il microscopio ottico Lo stativo si compone: Piede Tavolino Supporto per oculare/i Supporto per obiettivi Vite macro/micrometrica

5 Obiettivi Dalla combinazione delle lenti degli obiettivi e degli oculari dipende l effetto ottico del microscopio L obiettivo è la parte del microscopio che si trova più vicino all oggetto da esaminare Alla estremità dell obiettivo si trova la lente frontale (l obiettivo tanto più ingrandisce quanto più piccolo è il diametro della lente frontale) Si dice distanza frontale di un obiettivo la distanza che intercorre, quando il microscopio è a fuoco, fra la lente frontale e la superficie inferiore del vetrino coprioggetto (spessore 0,16 mm) La distanza frontale è tanto minore quanto più forte è l obiettivo (ottimale >ingrandimenti con distanza > per avere gioco per messa a fuoco)

6 Obiettivi Apertura numerica: funzione che esprime la massima quantità di luce che un obiettivo è capace di accettare e condurre alla formazione dell immagine A.N. = n.sena n = indice di rifrazione del mezzo interposto tra lente frontale e coprioggetto (aria 1, acqua 1,33, olio imm. 1,53) a = metà dell angolo (di apertura) del cono dei raggi che emanano da un punto qualsiasi dell oggetto esaminato e che sono utilmente accettati dalla lente frontale supponendo che l angolo sia 180, il seno della metà angolo è = 1 il valore dell A.N. coinciderà con n (aria 1, acqua 1,33 olio imm. 1,53)

7 Obiettivi Potere di risoluzione: proprietà di un obiettivo di mettere in risalto maggiori o minori dettagli in rapporto all apertura numerica Potere di risoluzione = l 2 A.N. l= lunghezza d onda della luce In luce bianca il potere di risoluzione è di circa 0,2 µm

8 Tipi di obiettivi Obiettivi a secco Obiettivi a immersione (permettono di inserire sostanze* tra lente frontale e vetrino coprioggetto) * olio di legno di cedro Altre tipologie basate su correzioni cromatiche o di curvatura: acromatici (giallo-verde) semiapocromatici (blu-rosso) apocromatici (violetto-rosso) a campo piano o planari (correggono curvatura di campo ->immagine piana)

9 Oculari Ingrandiscono l immagine data dall obiettivo proiettata sul loro piano Possono essere di diversi tipi: A lente frontale regolabile da proiezione fotometrici ecc.

10 Apparato di illuminazione Sorgente luminosa Diaframma di campo Condensatore: sistema di lenti che convoglia sul piano del preparato i raggi luminosi Diaframma ad iride o di apertura, serve a regolare la luce proiettata sul preparato

11 ingrandimento L ingrandimento del microscopio è dato dal prodotto ingrandimento dell obiettivo X ingrandimento dell oculare Per misurare la grandezza degli oggetti esaminati si usa un micrometro oculare

12 Tipi di microscopio Stereomicroscopio Microscopio in campo chiaro Microscopio in campo scuro Microscopio rovesciato Microscopio a contrasto di fase Microscopio interferenziale Microscopio a luce polarizzata Microscopio a fluorescenza Microscopio a luce ultravioletta Microscopio elettronico a trasmissione Microscopio elettronico a scansione Microscopio elettronico ad alto voltaggio Microscopio a forza atomica Microscopio confocale Laser

13 Microscopio a fluorescenza Utilizza radiazioni u.v. con lunghezza d onda di circa 365 nm (u.v. lungo) Rivela fini strutture che assorbono le radiazioni u.v. ed emettono luce visibile Tipi di fluorescenza: Fluorescenza primaria: mette in evidenza sostanze autofluorescenti (vitamina A, porfirina, riboflavine, elastina, clorofilla) Fluorescenza secondaria: evidenzia strutture dopo che sono stati impiegati fluorocromi (acridina, fluoresceina, rodamina come tali o legati ad altre sostanze come ad esempio agli anticorpi)

14 Microscopio a luce ultravioletta Utilizza radiazioni u.v. di circa nm di lunghezza d onda (u.v. corto) Mette in evidenza fini strutture che assorbono le radiazioni u.v. e come conseguenza danno immagine negativa Evidenzia le strutture costituite da acidi nucleici (DNA, RNA)

15 Microscopio confocale laser La luce emessa dai fluorocromi presenti nel campione viene catturata dalle lenti dell'obbiettivo e deviata da uno specchio dicroico (linea nera diagonale) su un fotomoltiplicatore, che trasforma l'intensità luminosa rilevata in un segnale elettrico di intensità proporzionale. Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore, il fascio luminoso attraversa un diaframma (o pinhole), che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco (che, seppure in minima parte vengono illuminate per effetto di fenomeni di rifrazione all'interno del campione) di raggiungere il fotomoltiplicatore. In questo modo solo il segnale luminoso relativo dal piano di fuoco viene registrato e utilizzato nella formazione dell'immagine finale.

16 il segnale elettrico in uscita dal fotomoltiplicatore viene quindi digitalizzato e inviato ad un computer che registra i valori di intensità misurati per ogni punto. Questi valori vengono utilizzati per ricostruire l'immagine a video: ogni punto del campione verrà a corrispondere ad un pixel dello schermo, L'accostamento di tutti i singoli pixel corrispondenti ai punti scanditi dal fascio laser nel campione darà così l'immagina finale.

17 Spostando lungo l'asse verticale il campione dopo ogni scansione, è possibile eseguire serie di scansioni successive corrispondenti a piani focali via via più profondi all'interno del campione. Queste scansioni prendono il nome di sezioni ottiche e la loro sovrapposizione ordinata, eseguita via software, consente di ricostruire un'immagine complessiva dell'intero volume scandito, in cui tutti i piani sono contemporaneamente a fuoco.