NUTRIZIONE MICROBICA. Riproduzione ed accrescimento CONDIZIONI AMBIENTALI PER CRESCERE TERRENO COLTURALE DEVONO TROVARE MICRORGANISMI RIPRODURSI

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1 NUTRIZIONE MICROBICA Riproduzione ed accrescimento PER CRESCERE CONDIZIONI AMBIENTALI MICRORGANISMI DEVONO TROVARE TERRENO COLTURALE RIPRODURSI NUTRILITI METABOLISMO NATURA

2 Colture pure e caratteri colturali I batteri o gli altri microrganismi, quando crescono su un terreno di laboratorio, sono chiamati coltura. La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche abitano normalmente varie parti del nostro corpo (orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).

3 Colture pure e caratteri colturali: popolazioni microbiche naturali Colture pure Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tute da un unica cellula madre. Essa rappresenta una condizione artificiale per l accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio.

4 Caratteri colturali Uno dei principali caratteri dei batteri è l aspetto (caratteri di accrescimento) che assumono dopo essere cresciuti su vari terreni. I caratteri colturali forniscono indizi utili per l identificazione. Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio. Per questo scopo si devono conoscere quali esigenze nutrizionali (nutriliti) e quali fattori ambientali (fisico-chimico) essi richiedono. Tali informazioni hanno consentito di sviluppare numerosi terreni o mezzi per la loro coltura.

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6 Esigenze nutrizionali Bisogno di H 2 O (70-80%) Tutte le sostanze nutritizie devono essere in soluzione, per permettere lo svolgimento delle reazioni metaboliche

7 Esigenze nutrizionali Fonti di carbonio: Zuccherine: melassi di scarto, sieri (latte), amido e cellulosa Non zuccherine: lipidi e idrocarburi Le specie microbiche possono utilizzare più fonti di carbonio, influenzando la velocità di riproduzione delle cellule

8 Esigenze nutrizionali Richiesta di azoto: Azoto atmosferico. Composti inorganici dell azoto. NH 4+ NO 2- NO 3 - Composti organici dell azoto. Urea, amminoacidi, peptoni, proteine, basi azotate

9 Esigenze nutrizionali Richiesta di zolfo e fosforo Zolfo: amminoacidi, proteine Composti organici dello zolfo Composti inorganici dello zolfo Zolfo elementare Fosforo: controllo del ph, costituente acidi nucleici, ATP Fosfati.

10 Esigenze nutrizionali FATTORI DI CRESCITA: Vitamine del gruppo B, alcuni amminoacidi, basi azotate Tiamina (B1) Riboflavina (B2) Niacina (B3) Piridossina (B6) Biotina (B8) Acido pantotenico (B5) Acido folico (B9) Cobalamina (B12) Vitamina K

11 Fattori che influenzano la crescita microbica: osmolarità ph temperatura concentrazione di ossigeno L'osmolarità è un'unità di misura della concentrazione delle soluzioni usata in chimica, ed in particolare è il numero totale di molecole e ioni presenti in un litro di soluzione L'osmolarità è una misura del potenziale osmotico che controlla il movimento dell'acqua che tenderà ad andare dalle regioni con meno particelle a quelle con più particelle (a concentrazione, meglio, ad osmolarità maggiore). Il movimento dell'acqua porta dunque a parlare di pressione osmotica.

12 LE OSMOSI Diffusione di acqua attraverso una membrana a permeabilita selettiva

13 Non alofili Alotolleranti Alofili moderati ed estremi Alofili estremi (Halobacterium) isolato nel mar Nero richiede concentrazioni saline vicine alla saturazione (elevato K+ intracellulare)

14 ph ph: influenza le reazioni enzimatiche in quanto modifica il grado di dissociazione dei gruppi carichi delle proteine ph citoplasmatico mantenuto neutro attraverso dei sistemi tampone fosfato e bicarbonato

15 TEMPERATURA Effetto della T sulla crescita microbica Alte temperature: Aumenta l attività enzimatica e la crescita Causa denaturazione degli enzimi e morte Basse temperature: Attività enzimatica ridotta Il congelamento blocca la crescita microbica Le membrane cellulari sono meno fluide Ogni organismo ha un Min. un Max e un Optimum di t.crescita

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17 Vita al di sopra dei 100 C Fino ad ora, la temperatura più elevata per la crescita batterica veniva considerata 105 C. In questi ultimi anni, tuttavia, sono stati individuati nuovi batteri che crescono in fumarole di zolfo, localizzate lungo le spaccature ed i crinali del fondo dell oceano, dalle cui bocche fuoriescono getti d acqua ricca di zolfo con temperature superiori ai 350 C. Si è osservato che questi batteri sono capaci di crescere e riprodursi a 115 C. Ciò conferma la possibilità di crescita batterica a temperature elevatissime.

18 La pressione presente nel loro habitat è sufficiente a mantenere l acqua allo stato liquido (a 265 atm). Le proteine, le membrane e gli acidi nucleici di questi batteri rimangono eccezionalmente stabili a queste temperature, tanto da rappresentare soggetti ideali per studiare le modalità necessarie alle macromolecole ed alle membrane per mantenersi stabili.

19 concentrazione di ossigeno: Aerobi obbligati Microaerofili Anaerobi obbligati Anaerobi facoltativi Anaerobi aerotolleranti La tolleranza o meno all O 2 è determinata dalla presenza di un particolare sistema enzimatico nella cellula: superossido dismutasi, catalasi e perossidasi

20 ROS: SPECIE REATTIVE ALL OSSIGENO:. O 2 - H 2 O 2. OH Alcune reazioni ossidative della demolizione di amminoacidi e dei lipidi, producono tali specie reattive All interno di piccole vescicole (perossisomi: catalasi) o nel citoplasma avviene la degradazione di tali specie reattive ad opera di enzimi antiossidanti SOD, SOR, catalasi, perossidasi oppure tramite CoQ e vitamina E (membrana cellulare) O 2 + e - O -* 2 radicale superossido O -* 2 + e - +2H + H 2 O 2 H 2 O 2 + e - +H + H 2 O + OH. superossido SOD 2O -* 2 + 2H + O 2 +H 2 O dismutasi 2 catalasi 2 H 2 O 2H 2 2 O + O 2 H 2 O 2 perossidasi 2H 2 O 2SH 2S.

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22 CRESCITA MICROBICA Per sfruttare nel modo migliore i microrganismi bisogna conoscere come varia nel tempo il numero di cellule che si riproducono Numero delle cellule: misura della concentrazione cellulare (conta del numero di cellule) attraverso: Microscopio (conta totale) Conta colonie UFC (conta vitale) misura della massa cellulare attraverso: Spettrofotometro (torbidità)

23 La divisione batterica per scissione binaria determina la moltiplicazione del microrganismo in maniera esponenziale, così che, dopo tre divisioni, da una cellula batterica se ne formano otto

24 L intervallo di tempo necessario al batterio per riprodursi è detto tempo di generazione (o tempo di duplicazione) e varia tra i differenti microrganismi e a seconda delle condizioni di crescita. Escherichia coli e la maggior parte dei batteri ha, in condizioni ambientali ottimali (create in laboratorio), un tempo di generazione di minuti; in questi casi bastano 12 ore (35 generazioni) per ottenere da una singola cellula miliardi di batteri. MICRORGANISMI TEMP t GEN (min) Escherichia coli Bacillus mycoides Streptococcus lactis Spirochete sifilitica h Nitrobacter agilis h Bacillus Thermophilus Mycobacterium tubercolosis h In condizioni naturali, ad esempio nell intestino umano, Escherichia coli impiega ben 12 ore per effettuare una divisione cellulare. Staphylococcus aureus 37 30

25 Crescita batterica In fase esponenziale ogni microrganismo si duplica a intervalli di tempo costanti, quindi la popolazione raddoppia nell arco di un certo tempo detto tempo di generazione: t gen N cellule: n N o = numero di cellule nella popolazione iniziale N= numero di cellule al tempo t n= numero di generazioni (numero di divisioni cellulari) t gen = tempo di generazione (tempo occorrente per una duplicazione cellulare N = N o 2 n (aumento di tipo esponenziale o logaritmico) log N = log N o + nlog2 n = log N - log N o = log N - log N o log2 0,301

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27 Il tempo necessario perché la popolazione raddoppi è il tempo di generazione. Si può calcolare facendo il rapporto tra il tempo di crescita e il numero di generazioni t gen = t/n = t*0,301/ logn - logn o ESERCIZIO: N o = 10 2 UFC/g N = 10 9 UFC/g t = 7 h Calcoliamo il numero di generazioni e il tempo di generazione n = 9-2/0,301= 23,2 generazioni t gen = 7/23,2 = 0,3 h/gen oppure 18 min/gen La popolazione compie una generazione ogni 18 minuti Si definisce velocità costante di crescita (k) il numero di generazioni nell unità di tempo (min o h) k = n/t k = logn - logn o /t*0,301 ESERCIZIO: Calcoliamo la velocità di crescita costante: k= 9-2/7*0,301= 3,33 gen/h La popolazione cresce con una velocità costante di 3,33 gen/h

28 CURVA DI CRESCITA Se durante il periodo di crescita di una coltura (cellule batteriche unicellulari procariote /eucariote) eseguiamo a vari intervalli di tempo in condizioni ottimali una conta totale o vitale, possiamo costruire un grafico della popolazione microbica in funzione del tempo ottenendo delle curve caratteristiche

29 FASE DI LATENZA Fase di adattamento alle condizioni di crescita (temperatura, terreno di coltura) N di cellule costante nel tempo Durata variabile

30 FASE ESPONENZIALE (o LOGARITMICA) fase di duplicazione cellulare in cui la velocità di crescita è costante e dipendente dalle condizioni di crescita N di cellule aumenta nel tempo e tutte le cellule impiegano lo stesso tempo per duplicarsi tempo di generazione è variabile e dipendente dalla specie batterica e/o condizioni di crescita)

31 FASE STAZIONARIA Interruzione della crescita, N di cellule costante nel tempo equlibrio tra divisione cellulare e morte accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti

32 FASE DI MORTE diminuzione del numero di cellule vive nel tempo percentuale costante di andamento in molti casi logaritmico (ogni ora muore una cellule) accumulo di metaboliti tossici, scarsità di nutrienti

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