Biologia dei sistemi

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1 Biologia dei sistemi Fino poco tempo fa i ricercatori studiavano l espressione di un singolo gene alla volta Ora è possibile studiare simultaneamente l espressione di tutti i geni di un organismo (questo può aiutare a capire meglio la funzione dei singoli geni nel contesto cellulare) Approccio interdisciplinare attraverso cui comprendere il funzionamento dei sistemi biologici: integrando informazioni di diversa natura, analizzandole con mezzi di calcolo potenti si costruiscono reti di connessioni dinamiche esistenti tra geni, proteine, metaboliti e altre molecole, essa si propone di sviluppare un modello esplicativo dei sistemi viventi. Poiché gli organismi sono sistemi complessi che mutano nel tempo il totale non è semplicemente la somma della parti

2 Tecniche impiegate nella biologia dei sistemi La biologia dei sistemi impiega tecniche di trascrittomica quali i microarray per determinare cambiamenti nell'espressione genica globale o tecniche biochimiche e proteomiche quali la spettrometria di massa o l'analisi robotizzata delle attività enzimatiche, per valutare i cambiamenti dinamici derivati da una perturbazione del sistema. Essa impiega approcci di bioinformatica e statistici con l'obiettivo di arrivare a creare un modello sempre più completo del funzionamento dei sistemi biologici.

3 Bioinformatica e analisi dei genomi Bioinformatica : l analisi tramite strumenti informatici delle informazioni biologiche. Generalmente ci si riferisce all analisi computazionale di grandi set di dati su DNA, proteine e dati strutturali

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6 Perchè analizzare cosi tanti geni? <10% del geni umani sono stati studiati a livello della loro funzione individuale. Ma i geni totali sono circa 25,000 I pannelli di espressione globale forniscono molte più informazioni e soprattutto si ottengono informazioni non attese!

7 Alcune sfide delle omiche Qual è la funzione di ciascun gene (e di ciascuna proteina)? Come viene regolata l espressione dei geni? Come rispondono i geni agli stimoli ambientali? Quali geni sono coinvolti nelle diverse malattie? In che modo le diverse proteine interagiscono tra loro? Obiettivo principale: la comprensione delle interazioni fra ciascuno degli elementi identificati.

8 In ambito biomedico La medicina del futuro si propone di essere predittiva: esaminando ogni individuo nella sua totalità si dovrebbe poter stabilire quale malattia è propenso a contrarre, la probabilità con cui la svilupperà e quando ciò dovrebbe verificarsi. Inoltre dovrebbe poter fare affidamento su metodologie di indagine più sofisticate e accurate per distinguere tra individui e tra forme anche simili della medesima patologia, determinando con precisione il trattamento più adatto.

9 Integrazione dei dati per scoprire interazioni genotipo-fenotipo

10 A che servono tutte queste proteine? Funzioni note Funzioni presunte Funzioni sconosciute

11 DNA Microarray GENOMA Screening genetici Interazioni roteine-ligandi PROTEOMI Struttura delle proteine Interazioni Proteina-Proteina

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13 Microarrays (chips) Miniaturizzazione di migliaia di saggi su una lastrina I microarrays di DNA per l analisi di espressione genica sono delle lastrine di vetro o silice sulla cui superficie sono disposti in modo ordinato migliaia di geni (tra ,000). Possono additrittura contenere l intero genoma di un organismo disposto in modo che ciascun gene sia identificabile. Tramite una convenzionale ibridazione il DNA sui chip (probe) è messo a confronto con il cdna marcato derivante dal medesimo organismo preso in una condizione diversa (es. effetto di un farmaco, geni attiavti nello sviluppo, condizioni patologiche) e viene così comparato il livello di espressione genica. I dati vengono rilevati tramite opportuni lettori

14 Un microarray

15 Yeast genome: 12,800 points Diameter: 120 microns Slide size: 170 mm x 340 mm

16 Preparare un microarray 1 goccia di un nanolitro μm diametro

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18 I diversi passaggi di un esperimento 1 - disegno sperimentale: cosa paragonare a cosa? 2 - ottenere un microarray 3 - preparazione della sonda e ibridazione 4 - acquisizione delle immagini e quantificazione 5 - costruzione di un database 6 - analisi statistica - Risultati

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20 La popolazione di messaggeri (mrna) proveniente dal campione biologico di interesse viene usata come stampo per la retrotrascrizione. Uno dei nucleotidi è marcato con un colorante fluorescente che può essere: Cy3, che emette fluorescenza di colore verde Cy5, che emette fluorescenza di colore rosso. I due diversi fluorocromi vengono usati per marcare cdna provenienti da due campioni diversi. In questo modo su uno stesso vetrino si possono saggiare due diverse popolazioni di mrna e si possono confrontare una con l'altra.

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22 Gene D sovraespresso in tessuti normali Gene E sovraespresso nei tumori

23 Il proteoma: identifica in modo sistematico le proteine le caratterizza rispetto a struttura, funzione, attività, interazioni,

24 Elettroforesi 2D è la tecnica di elezione per le analisi di proteomica

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27 -I microarray di proteine, anche noti come chip di proteine, sono sistemi di saggi miniaturizzati e paralleli che contengono piccolissime quantità di proteine purificate ad alta densità. -Consentono la determinazione simultanea di una grande varietà di analiti provenienti da piccolissime quantità di campione in esame all interno di un singolo esperimento. -I microarray di proteine si preparano immobilizando proteine su un vetrino che può avere uno strato di nitrocellulosa, gel, ammine o metalli, quali il Ni.

28 Microarray di proteine analitici e funzionali I microarray analitici servono per determinare i livelli di espressione di proteine, identificazione di biomarcatori, in un dato contesto (risposta allo stress, ciclo cellulare, apoptosi, infiammazione, ) La proteomica funzionale utilizza diverse tecnologie complementari (utilizzata sia nella ricerca di base, sia nella clinica) Interazioni Proteina-Ligando (DNA, lipidi, farmaci, ) Per scoprire inibitori delle proteine Per scoprirne le funzioni Interazioni Proteina-Proteina Per identificare la rete di interazioni regolative Per scoprirne le funzioni

29 Microarray di proteine analitici (high throughput ELISA)

30 Profiling di biomarcatori della risposta immunitaria

31 Microarray di proteine funzionali Legame di piccole molecole (proprietà di binding) Modificazioni posttraduzionali Interazioni proteina-proteina Interazioni proteina DNA Analisi di interazione patogeno-ospite Saggi enzimatici Profiling della risposta immunitaria

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33 Profiling di piccole molecole La molecola (ligando) di interesse viene marcata (radioattivamente, con biotina o con un fluoroforo) e posta ad incubare con circa proteine disposte sul vetrino. Poichè l identità di ciascuna proteina è nota si può facilmente identificare il target del ligando in esame.

34 Profiling di substrati enzimatici Con questo metodo si può valutare la capacità di un determinato enzima purificato (o anche di un lisato cellulare) di legarsi ad una specifica proteina nativa fissata sul vetrino e saggiare la sua attività enzimatica. Il chip contiene circa proteine purificate. Insieme all enzima purificato si aggiunge rispettivamente ATP, -CH 3, ubiquitina marcati e la presenza della marcatura evidenzierà il substrato specifico. Questo tipo di saggio si può effettuare anche in presenza di inibitori per valutarne l azione.

35 Profiling di interazioni proteina-proteina Con questo metodo si può saggiare l interazione di una proteina purificata di interesse con circa proteine prsenti sul vetrino. Una volta messa ad incubare la proteina sarà sufficiente rilevarla con un anticorpo specifico legato ad un fluoroforo.

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