Tecniche di Immunoistochimica e Biologia Molecolare. istopatologica

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1 Tecniche di Immunoistochimica e Biologia Molecolare applicate alla diagnostica istopatologica

2 Immunoistochimica Metodiche utilizzate per identificare costituenti cellulari e tissutali come antigeni in situ, utilizzando anticorpi Le tecniche di IIC possono essere applicate su cellule isolate su preparati istologici e citologici

3 Immunoistochimica Alcuni tumori possono essere diagnosticati con un semplice esame istologico, mentre altri per una corretta definizione richiedono l ausilio di ulteriori indagini: Istochimiche Immunoistochimiche Biologia molecolare

4 L immunoistochimica al microscopio

5 Immunoistochimica Il principio dell IIC prevede il riconoscimento di un antigene mediante l utilizzo di un anticorpo specifico.

6 Antigene L antigene è una molecola proteica, glicoproteica o lipoproteica capace di di evocare una risposta immune da parte del sistema immunitario. Ogni antigene è costituito da uno o più siti antigenici. Disponendo dell anticorpo specifico qualunque antigene può essere evidenziato mediante reazioni di IIC.

7 DEFINIZIONE DI ANTIGENE Ogni singolo Ag è costituito da una o più porzioni chiamate epitopi o determinanti antigenici differenti tra loro ANTICORPO EPITOPO 1 Ag EPITOPO 2 EPITOPO 3

8 DEFINIZIONE DI ANTIGENE L antigenicità di una molecola dipende dalla sua composizione e conformazione strutturale ed è modificata da tutti i trattamenti fisici e chimici attuati durante la processazione dei campioni

9 Anticorpi Gli ac sono molecole proteiche (Ig) prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi ad un determinante antigenico. Possono essere: Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e diretti contro lo stesso determinante antigenico Policlonali: costituiti da anticorpi diversi fra loro e diretti contro differenti determinanti antigenici Ibridi: immunoglobuline modificate in modo tale che ciascun frammento abbia specificità per un differente determinante antigenico

10 Struttura dell anticorpo Frammento Fc porzione costante specie-specifica Frammento Fab porzione dell Ig in grado di legare l Ag, è costituito da domini ipervariabili che consentono grande versatilità nel riconoscimento e nel legame con l Ag (specificità e affinità)

11 STRUTTURA DI UN ANTICORPO

12 REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Il complesso tra l antigene e l anticorpo che si forma nella reazione immune non è di per sé visibile. E necessario quindi servirsi di marcatori che direttamente o indirettamente possano evidenziarne la formazione

13 Markers della reazione immunoistochimica Attualmente sono impiegati due differenti tipi di tracciante: Fluorescente Enzimatico

14 Tecniche Immunoistochimiche Tecniche di Immunofluorescenza utilizzano fluorocromi come marcatori della reazione antigeneanticorpo Tecniche Immunoenzimatiche utilizzano enzimi per evidenziare la reazione antigene-anticorpo

15 Tecniche di immunofluorescenza Le sostanze fluorescenti maggiormente utilizzate sono: Isotiocianato di fluoresceina Tetrametil rodamina Ficoeritrina Cianina Rosso Texas

16 Immunofluorescenza Carcinoma lobulare della mammella CK Fitc CK Rodamina

17 Immunofluorescenza Metodi di indagine Metodi indiretti Metodi diretti

18 Immunofluorescenza Metodo indiretto

19 Immunofluorescenza Metodo diretto

20 Immunofluorescenza Metodo diretto Tessuto nervoso Doppia colorazione

21 Immunofluorescenza Limiti dell immunofluorescenza -Scarsa possibilità di diluizione degli Ac -Mancanza di informazioni topografiche -Naturale estinzione della fluorescenza -Necessità di osservazione in microscopia particolare Non conservabilità dei preparati

22 Campi di applicazione dell immunofluorescenza Diagnostica nefropatologica Diagnostica dermatologica Indagini citoflussimetriche

23 Immunofluorescenza Nella diagnosi delle patologie renali l IF diretta permette di identificare Ag e altri fattori presenti nelle strutture glomerulari. La evidenziazione di depositi di immunocomplessi, di frazioni del complemento, di fibrinogeno e la loro distribuzione a livello glomerulare è un fondamentale supporto nella diagnosi differenziale tra le varie glomerulonefriti.

24 Patologia renale Immunofluorescenza Glomerulonefrite granulare Pattern granulare IgG

25 Immunofluorescenza Patologia cutanea Depositi lineari anti-c3 Depositi lineari anti-igg

26 Immunofluorescenza Analisi Citofluorimetria Sospensione cellulare

27 Immunofluorescenza Tessuto fresco Campionamento Congelamento rapido in azoto liquido Sezioni di 4-5 µ al Conservazione a microtomo congelatore -80 Asciugare le sezioni all aria Fissare in acetone per 10 Sezioni non utilizzate Lavare con PBS Colorazione

28 Congelamento Il congelamento permette di conferire al campione di tessuto una rigidità tale da consentire l allestimento di sezioni sottili (2-5 µ) permette inoltre di: Stabilizzare le strutture cellulari Mantenere inalterate le caratteristiche di antigenicità del tessuto Non interferire nella reazione Ag-Ac.

29 Congelamento La biopsia chirurgica viene inglobata in una particolare resina chiamata OCT che ha la proprietà: - Solidificare a basse temperature - Preservare il tessuto - Formare un supporto rigido necessario per il taglio delle sezioni.

30 Congelamento Il metodo maggiormente utilizzato è quello di immergere il tessuto per alcuni secondi in azoto liquido che essendo alla temperatura di 196 C consente un rapido congelamento senza provocare danni alla struttura antigenica e all architettura morfologica

31 Tecnica per If diretta Tessuto fresco Campionare Congelare Tagliare al criostato Sezioni di 4 µ su vetrini con adesivo o polarizzati Asciugare le sezioni all aria Fissare con acetone a 4 C Lavare con tampone Incubare con Ac primario fluorescinato 1 ora Lavare con tampone Montare con un sistema acquoso e conservare al buio Osservare al microscopio a fluorescenza

32 Immunoistochimica tecniche e metodi La tecnica Immunoenzimatica prevede l uso di enzimi legati direttamente o indirettamente all Ac I per evidenziare la formazione del complesso immune. L enzima catalizza la formazione di un precipitato colorato e insolubile visibile al microscopio, nel sito in cui è avvenuta la reazione Ag-Ac

33 EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE A seconda del tracciante enzimatico: IMMUNOPEROSSIDASI IMMUNOFOSFATASI IMMUNOGLUCOSIDASI IMMUNOβ GALATTOSIDASI

34 Perossidasi E ottenuta dal rafano ma è presente anche nei tessuti umani Può formare legami covalenti con le immunoglobuline Suo substrato è il perossido di idrogeno 2 H2O2 2H2O+O2 elemento ossidante per il cromogeno

35 Immunoperossidasi Il cromogeno più utilizzato è la DAB che da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno. L insolubilità e la stabilita del prodotto di ossidazione della DAB consentono il montaggio e l archiviazione dei preparati dei preparati secondo le tecniche di routine.

36 Immunoperossidasi Altri substrati come ad es. l AEC fornisce un prodotto di osssidazione rosso, è liposolubile e fotosensibile rendendo necessaria la conservazione al buio nonché la documentazione fotografica

37 I metodi immunoenzimatici possono essere: Diretti Indiretti Metodi immunoenzimatici Il metodo diretto scarsamente sensibile non viene utilizzato nei laboratori di Anatomia Patologica

38 Metodi Immunoenzimatici Il metodo indiretto: E estremamente sensibile e ha il vantaggio che un solo anticorpo II marcato può essere utilizzato per riconoscere diversi anticorpi I appartenenti alla stessa specie.

39 Perossidasi La scelta del cromogeno si pone tra DAB - Cancerogena - Origina un precipitato marrone insolubile nei solventi organici AEC - Non cancerogeno - Origina un precipitato rossiccio solubile nei solventi organici

40 Fosfatasi alcalina Si ottiene dall intestino di bue Substrati sono gli esteri fosforici alfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR fosfato Cromogeno è un sale di tetrazolio Conferisce una colorazione rossa

41 Immunoistochimica Tecniche e metodi Enzima + substrato cromogeno Prodotto colorato

42 Metodi Immunoenzimatici Diretto Ac I marcato Semplice e rapido Indiretto Ac I non marcato Ac II

43 Storia dell immunoistochimica 1941 Coons: Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di tessuto 1966 Nakane: Anticorpi marcati con enzimi 1970 Sternberger: Perossidasi erossidasi-anti Perossidasi (PAP) 1981 Hsu: Avidin Biotin Complex (ABC) 1984 Cordell: Alkaline Phosphatase Anti Alkaline Phosphatase (APAAP) 1989 Bobrow: Catalysed Reporter Deposition (CARD CSA-TSA) 1993 Bisgaard Polimeri del destrano

44 Perossidasi Anti-Perossidasi Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario Enzima Complesso PAP

45 Metodi Immunoenzimatici Il sistema Avidina Biotina (ABC) si basa sulla straordinaria affinità fra l avidina, una glicoproteina con p.m D presente nell albume d uovo e la biotina piccola molecola vitaminica. In particolare la biotina si lega ai gruppi aminici -NH2 degli Ac e della Pr di modo che più molecole di biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig

46 Metodo ABC LSAB Labelled Streptavidin Biotin (Peroxidase) Press left mousebutton

47 Metodo ABC Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario biotinilato Complesso ABC-Pr

48 Sistemi avidina-biotina: vantaggi Alta affinità dell avidina per la biotina E possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromo/enzima /enzima-proteina Elevata amplificazione L avidina coniugata è molto stabile Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici metodiche Basso costo

49 Sistemi avidina-biotina: svantaggi Biotina endogena Reazione con multipli passaggi

50 Polimeri del destrano Polymer Detection Press Press left left mousebutton mousebutton

51 Metodi Immunoenzimatici Polimeri del destrano Antigene Anticorpo primario Anticorpo secondario- polimero-enzimaenzima

52 Polimeri del destrano: vantaggi Ottima sensibilità Nessuna interferenza legata alla biotina Tempi di reazione ridotti

53 Catalyzed Signal Amplification

54 Catalyzed Signal Amplification Tiramide biotinilata acqua ossigenata

55 Catalyzed Signal Amplification

56 Catalyzed Signal Amplification

57 CARD: vantaggi Altissima sensibilità Aumenta la diluizione di anticorpi primari 05 Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi Possibilità di utilizzo in svariate metodiche (ibridazione in situ, FISH, etc) Numerosi apteni utilizzabili

58 Metodi Immunoenzimatici Doppie colorazioni Permettono di evidenziare contemporaneamente nella stessa cellula due o più antigeni diversi utilizzando differenti substrati cromogeni e differenti enzimi

59 Colorazioni doppie TCRBCL: CD20/CD54R0

60 Doppia colorazione

61 Inibizione di enzimi endogeni Applicando metodiche di immunoistochimica enzimatica è necessario ricordare che alcuni enzimi utilizzati come traccianti possono essere presenti nel tessuto da analizzare, è necessario perciò inibire l enzima endogeno senza danneggiare le proprietà antigeniche.

62 Trattamento del materiale istologico e citologico da sottoporre ad indagini di IIC Dall effettuazione del prelievo bioptico o citologico al momento dell esame microscopico dei preparati colorati con reazioni immunoistochimiche intervengono diversi fattori che possono influenzare i risultati e portare a false interpretazioni dei quadri patologici

63 Trattamento del materiale I campioni bioptici da sottoporre ad indagini di IIC vengono trattati secondo le normali procedure per l allestimento delle sezioni per la diagnostica istomorfologica e cioè Fissazione Disidratazione e chiarificazione Inclusione in paraffina Taglio al microtomo

64 Fissazione Gli scopi principali della fissazione sono: Preservare la morfologia cellulare e l architettura tissutale Permettere al campione di tollerare gli stress della processazione Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni tradizionali Preservare l integrità antigenica Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originale

65 Fissazione Tra i fissativi quello maggiormente impiegato è la formalina neutra tamponata (10%), che permette il miglior compromesso tra stabilità, costo, preservazione di molti antigeni, buona morfologia.

66 Azione della formalina La fissazione con formalina determina legami crociati tra il liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con mascheramento di molti siti antigenici.

67 Trattamento del materiale istologico Azione della formalina sulle proteine del tessuto Proteina naturale Proteina denaturata Reticolazione

68 Trattamento del materiale istologico Azione della formalina sulle proteine del tessuto Prima della fissazione Dopo fissazione

69 Tempi e modalità di fissazione variabili preanalitiche Primo obiettivo di standardizzazione Fissare immediatamente il campione Un ritardo determina degradazione proteolitica con diffusione dell antigene e ridotta o assente immunocolorazione Evitare una fissazione prolungata Tempi non superiori alle 24 ore Condizionano l immunoreattività tissutale

70 Tempi e modalità di fissazione variabili preanalitiche Ritardo della fissazione Er

71 Procedure di ripristino dell antigenicità I processi a cui sono sottoposti i tessuti o le cellule dal momento del prelievo all effettuazione della reazione di IIC possono danneggiare l antigenicità rendendo: Inaccessibile l Ag all Ac Modificando parzialmente l antigenicità Modificandola in modo irreversibile

72 Ripristino dell antigenicità La reattività immunologica può essere ripristinata rompendo questi legami crociati o con un trattamento Enzimatico Alte temperature

73 Trattamento enzimatico Gli enzimi proteolitici rompono i legami aldeidici rendendo i siti antigenici disponibili per il relativo Ac. Quelli maggiormente utilizzati sono: Pepsina Proteasi XXIV Tripsina Proteinasi K

74 Trattamento enzimatico L incubazione con uno di questi enzimi può avvenire a temperatura ambiente o a 37 C per un periodo di tempo variabile (5-30 ) e dipende: concentrazione durata della fissazione spessore della sezione tipo di enzima

75 Ripristino dell antigenicità A partire dagli anni 90 l uso del calore ha largamente sostituito i metodi enzimatici. Le alte temperature sono in grado di ristabilire l originale struttura proteica dopo che questa è stata modificata dalla fissazione in formalina

76 Metodi di recupero dell antigenicità Come effettuare lo smascheramento Recupero a caldo Forno a microonde Pentola a pressione Bagno termostatato Autoclave

77 Efficienza dei metodi di recupero dell antigenicità Fattori che condizionano lo smascheramento antigenico in mezzo liquido Tempo di riscaldamento T ( C) x t (min.) ph -Ag indifferenti al ph della soluzione -Ag buoni risultati a ph acido -Ag buoni risultati a ph basico

78 Smascheramento Intensità di colorazione aumenta aumentando i tempi Recettore per estrogeni 10

79 Smascheramento Recettore estrogeni 20

80 Smascheramento Recettore per estrogeni 30

81 Efficienza dei metodi di recupero dell antigenicità Tempo/Temperatura A parità di trattamento il tempo e la temperatura alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un ruolo fondamentale per il raggiungimento di un risultato ottimale Casi con reattività debole o incerta possono diventare chiaramente positivi se esposti al calore per un periodo più lungo Viceversa casi sicuramente negativi restano tali anche dopo esposizione prolungata al calore

82 Metodi di recupero dell antigenicità Soluzioni utilizzate Tampone citrato 0.01 M ph6 Tampone EDTA ph 8-9 Tampone glicina Acqua distillata

83 FASI DELLA COLORAZIONE IIC SPARAFFINARE Ac I CROMOGENO REIDRATARE Ac II CONTRASTO PRETRATTAMENTO ABC-ENZIMA MONTAGGIO INIBIZIONE OSSERVAZIONE

84 Interpretazione dei risultati Una delle maggiori difficoltà dell immunoistochimica sta nell interpretazione dei risultati. La presenza di deposizione di substrato cromogeno in corrispondenza di una cellula o di un tessuto, spesso, dovrebbe significare che in quella sede è avvenuta una reazione tra l anticorpo e l antigene tissutale. Questo è vero nella maggior parte dei casi, tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono essere responsabili della colorazione

85 Interpretazione dei risultati Le cause più comuni di colorazioni dovute ad artefatti sono: Presenza di perossidasi o fosfatasi (già presenti nel tessuto ) non adeguatamente inibite. Cross-reattività reattività dell anticorpo I con un antigene diverso da quello in studio. Legame aspecifico dell anticorpo alla cellula o tessuto (attraverso il frammento Fc o per carica elettrica) Inadeguata fissazione del tessuto. Scarsa fissazione provoca un eccesso di fondo ; eccesso di fissazione provoca una ridotta sensibilità

86 Pattern di colorazione Esistono alcune strategie che possono aiutare a distinguere una colorazione immunoistochimica specifica da una non specicifica o legata ad artefatti L interpretazione dei risultati in IIC deve tenere conto del tipo di positività attesa per un determinato Ab che può essere di quattro tipi: Nucleare Citoplasmatica Di membrana Extracellulare

87 Pattern di colorazione NUCLEARE CITOPLASMATICO DI MEMBRANA

88 Campi di applicazione L approccio diagnostico immunoistochimico deve essere condotto con razionalità scegliendo, sia il tipo di materiale più idoneo, sia gli anticorpi da utilizzare, secondo un algoritmo appropriato

89 Campi di applicazione Si definisce algoritmo immunoistochimico la successione logica nella selezione degli anticorpi da utilizzare al fine di giungere alla diagnosi. Esiste un algoritmo primario che consiste nell utilizzo di un pannello di anticorpi che consente di identificare la neoplasia

90 Campi di applicazione Le positività riscontrate con l algoritmo primario consentono di applicare un algoritmo secondario al fine di classificare adeguatamente la neoplasia. Raramente si rende necessario l utilizzo di un ulteriore algoritmo

91 Campi di applicazione IHC Marcatori di differenziazione Colorazione speciale Marcatori di neoplasia Marcatori di agenti infettivi Fattori prognostici

92 Marcatori di differenziazione Natura della popolazione cellulare Linfomi B/T Epiteliale vs. mesenchimale DD melanoma amelanotico Mesotelioma vs adenocarcinoma

93 Marcatori di differenziazione Sottoclassificazione linfomi Sottoclassificazione neoplasie mesenchimali Differenziazione endocrina

94 Colorazione speciale Individuazione tipi cellulari specifici: cellule sustentacolari, cellule follicolari dendritiche ecc.

95 CD21 - cellule FD

96 Marcatori prognostici Ag regolatori del ciclo cellulare (Mib-1, cicline) Recettori ormonali (Er, Pr) Prodotti di oncogeni e geni oncosoppressori (Erb-B2, Myc) Ag legati all invasività (E-caderina)

97 Marcatori immunoistochimici di riconosciuta validità clinica ER, PR Proliferazione Ki67 HER-2 KIT EGFR

98 CARCINOMA DELLA MAMMELLA Fattori prognostici/predittivi Il carcinoma della mammella, viene caratterizzato con lo studio di: Parametri morfologici Grandezza del tumore,istotipo,infiltrazione, grado di differenziazione, presenza o meno di linfonodi metastatici Parametri biologici (non puramente morfologici) Attività proliferativa (MIB1) Assetto ormonale (ER,PR) Prodotti di oncogeni (HER2)

99 Carcinoma della mammella Fattori pronostici Per caratterizzare i parametri biologici si impiegano metodiche: Immunoistochimica che permettono di evidenziare sostanze di natura proteica presenti nei tessuti Ibridazione in situ (FISH e CISH) identificazione di una sequenza di acido nucleico in tessuti o cellule

100 Marcatori prognostici/predittivi Validità clinica Estrogeni-Progesterone Mib1 Cerb-2 Queste indagini sono svolte su tutte le neoplasie perché complementari non solo all interpretazione istopatologica ma anche per le relative implicazioni terapeutiche

101 Scelta degli anticorpi Estrogeni

102 Scelta degli anticorpi Progesterone

103 Scelta degli anticorpi KI67 (Mib1) Valutazione dell attività proliferativa delle cellule neoplastiche e normali. Si utilizza un Ac monoclonale ki67 (clone MIB1) che riconosce un antigene nucleare presente in tutte le fasi attive del ciclo cellulare

104 Mib1 Scelta degli anticorpi

105 Scelta degli anticorpi C-erb-B2 L anticorpo reagisce con l oncoproteina C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. La colorazione è localizzata nelle membrane cellulari delle cellule neoplastiche

106 Her-2 Kit standardizzati Devono essere eseguiti accuratamente

107 Valutazione dello stato di HER2/neu Attualmente sono disponibili numerosi sistemi per valutare lo stato di HER2/neu (Southern Blot, Dot Blot, PCR quantitativa). I più frequentemente utilizzati sono la dimostrazione dell iperespressione di HER2 mediante indagine immunoistochimica (IHC) e dell amplificazione mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).

108 Carcinoma della mammella: valutazione dello stato di HER-2/Neu Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia dei recettori per i fattori di crescita. E un componente della via di trasduzione del segnale coinvolto nella crescita cellulare. La sua localizzazione extra-cellulare lo rende un possibile bersaglio farmacologico.

109 Valutazione dello stato di HER2/neu I campioni con intensa positività per Her-2 (IHC 3+) sono elegibili per la terapia con Herceptin. I campioni IHC 2+ devono essere ritestati con altro metodo, preferibilmente con indagine FISH. I campioni sono inizialmente testati mediante IHC.

110 HER2/NEU EXPRESSION IHC - HercepTest 2+ 3+

111 Vysis (PathVysion) - Dakocytomation HER-2/DNA probes Permettono di valutare l amplificazione del gene HER-2 mediante FISH. Entrambe le metodiche prevedono l utilizzo di due sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti: HER-2 che identifica l intero gene HER-2 marcato con Spectrum Orange CEP 17 è marcato con Spectrum Green e si ibridizza con il DNA alfa-satellite localizzato in corrispondenza del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1)

112 HER-2/NEU - FISH

113 HER2/NEU AMPLIFICATION Low Level High Level

114 Problemi metodologici Tecniche di smascheramento antigenico Cloni utilizzati Sensibilità dei sistemi di rivelazione Scoring methods Controlli di qualità

115 Marcatori di neoplasia bcl-2 - linfomi follicolari vs iperplasia follicolare Ciclina D1 - linfoma mantellare p53 p80 - ALCL

116 Marcatori di neoplasia Bcl2

117 Marcatori di differenziazione Determinazione della sede primitiva di una neoplasia metastatica Profilo cheratine Marcatori melanocitari TTF1 ecc...

118 Applicazioni microbiologiche Identificazione di virus Identificazione di batteri HPV Helicobacter Pylori

119 HPV e carcinoma della cervice. Tra gli agenti virali un posto di rilievo è assegnato allo Human Papilloma Virus (HPV) Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato un innegabile legame tra infezione da HPV e sviluppo del carcinoma della cervice uterina

120 HPV e oncogenesi cervicale Sono stati identificati 100 genotipi di cui 40 presentano tropismo per il tratto anogenitale Vengono suddivisi in tre categorie che ne identificano il diverso potenziale oncogeno Alto rischio (16, 18 ) Rischio intermedio (31,33,35,51,58) Basso rischio (6, 11, 34,42,61,68)

121 Colorazione IIC per HPV

122 Ibridazione in situ Ibridazione in situ

123 HPV ISH

124 PCR 1) Estrazione del DNA Le sezioni raccolte in un tubo sterile sono state sparaffinate, reidratate e incubate per tutta la notte con proteinasi K a 37 C Inattivazione della proteinasi K a 95 C per 30 2) Reazione di PCR Preparare una miscela di amplificazione contenente: H 2 O, dntp, MgCl 2, Taq-polimerase templato

125 PCR La PCR avviene attraverso una serie di cicli composti da tre fasi: Denaturazione Annealing Allungamento Termociclatore computerizzato opportunamente programmato

126 PCR P.M. Contr- Contr Elettroforesi su gel di agarosio

127 Ibridazione inversa Tipizzazione genotipica di HPV

128 Campi di applicazione Possibilità di individuare i ceppi coinvolti Possibilità di individuare lesioni latenti o preneoplastiche Utilità nello screening preventivo

129 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE Famiglia di proteine che costituiscono la maggior parte dei filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule epiteliali. In base al peso molecolare che varia da 40 a 67 kd sono numerate da 1 a 20 La loro evidenziazione in una cellula normale o neoplastica depone quindi per una origine epiteliale

130 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE Sono espresse in modo caratteristico nei diversi tipi di epiteli normali e/o neoplastici Es: CK7 + ADK polmone CK20 - ADK polmone -ADK colon + ADK colon In IIC vengono utilizzati Ac diretti contro le singole CK o cocktail di Ac variamente allestiti per identificare CK a basso/medio/alto peso molecolare

131 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche CITOCHERATINE

132 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100 L anticorpo reagisce con una proteina presente in numerose linee cellulari (cellule muscolari striate e cardiache, melanociti, elementi gliali) E positiva nei mioepiteli ma non è un marcatore specifico

133 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie S-100

134 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Actina del muscolo liscio E un componente del sistema contrattile cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali ma anche dai miofibroblasti stromali L Ac diretto contro l actina identifica quindi tutti gli elementi normali o neoplastici che presentano una struttura contrattile di tipo muscolare

135 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Actina del muscolo liscio Sono stati identificati sei tipi di actina a seconda del tessuto muscolare di origine riconosciuti da Ac differenti -alfa actina muscolo liscio -alfa actina muscolo scheletrico e cardiaco -alfa actina muscolo liscio, mioepiteli, miofibroblasti

136 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie Actina del muscolo liscio

137 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina E una proteina che regola la contrazione delle cellule muscolari lisce E un marcatore molto sensibile delle cellule mioepiteliali. Mostra moderata crossreattività con i miofibroblasti Positività citoplasmatica

138 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie Calponina

139 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie E-Caderina Le caderine sono una famiglia di proteine di adesione cellulare. Formano complessi con le proteine citoplasmatiche chiamate catenine.questi complessi insieme con altri componenti del citoscheletro,tra cui l actina, sono parte essenziale del sistema di adesione intercellulare e quindi coinvolti nella invasività delle cellule tumorali

140 Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie E-Caderina

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