È una grossa famiglia, di grossi virus, che hanno qualche caratteristica in comune:

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1 Lezione di virologia del 17/05/2012 Docente: Aldo Manzin Parte I (Piredda Anna) [NB: (mie integrazioni); (digressioni)] [Tralascio un iniziale digressione inerente la valutazione del corso da parte di noi studenti e la richiesta di spunti e proposte da parte del docente per poter eventualmente migliorare l insegnamento.] Introduzione Cercheremo di essere concordi con quanto abbiamo stabilito quando abbiamo proposto il programma: infatti nel programma di virologia, come avete visto, non ci sono tutti i virus del mondo possibili, c è né un bel gruppetto che ne comprende anche alcuni, di cui non faremo in tempo a parlare per esteso; mi riferisco agli herpesvirus, ai paramixovirus e ai picornavirus. Altri proprio li tralasciamo non perché non siano importanti ma perché insomma chi ha la curiosità è invitato ad approfondire certi aspetti, ma diciamo che, ai fini della valutazione (ciò che interessa a voi), non mi permetterò mai di chiedervi argomenti che non siano stati trattati a lezione: per questo stiate assolutamente tranquilli!!! Allora, visto che ci è rimasto poco tempo, io vi do su questi tre capitoletti, cioè herpesvirus, paramixovirus e picornavirus, tutto il materiale, ma discuteremo assieme solo degli aspetti generali. HERPESVIRIDAE Quindi? Siamo in che ambito? DNA o RNA? Si tratta di virus a DNA. Doppia elica o singola elica? A doppia elica. Lineare o circolare? Lineare. È una grossa famiglia, di grossi virus, che hanno qualche caratteristica in comune: Sono diffusi ampiamente in natura. Hanno spettri d ospite animali diversi. I virus umani possiedono una specie-specificità abbastanza ristretta, anche se l uomo ad esempio può essere infettato da alcuni virus erpetici animali. Hanno caratteristiche biologiche comuni. Ci limitiamo ovviamente adesso a parlare dei virus erpetici di interesse umano: quindi oltre alla diffusione ubiquitaria e al fatto di interessare individui di ogni età, hanno come caratteristica fondamentale dal punto di vista biologico, quella di poter stabilire una latenza nell ospite infettato. Il concetto di latenza differisce da quello di persistenza: infatti i virus persistenti (propriamente detti) sono quelli che hanno la possibilità di dare infezioni croniche, ma possono anche essere eliminati dall organismo con le eccezioni e con le ~ 1 ~

2 frequenze di cui abbiamo parlato le volte precedenti; invece i virus erpetici obbligatoriamente dopo l infezione primaria non vengono più eliminati dall organismo, ma vanno ad insediarsi in siti di latenza, ove rimangono allo stato prevalentemente inattivo, da cui però possono riemergere in seguito agli stimoli appropriati, molto frequentemente associati a una riduzione delle difese immunitarie dell ospite. In realtà, possono essere anche stimoli fisiologici e parafisiologici: ad esempio, per quel che riguarda gli herpes simplex è sufficiente l esposizione ai raggi solari per determinare una riattivazione dell infezione latente. Quindi in situazioni critiche, possono dare origine nel paziente a delle riattivazioni, associate a patologie importanti ( trapiantati, negli HIV positivi e quant altro). Perciò il problema dei virus persistenti riattivati, dei virus latenti, è sempre più importante: infatti, nonostante le possibilità di sopravvivenza e di cura di quei pazienti, che sono critici per patologie di base diverse da quelle infettive, siano in continua crescita, il problema derivato dall infezione può divenire il principale, dopo aver risolto (seppur anche temporaneamente) la patologia di base. È un concetto di cui abbiamo parlato anche in riferimento ai soggetti affetti da epatite B: potremmo definire il soggetto che ha incontrato il virus dell epatite B come un individuo guarito, ma noi sappiamo che guarito non lo sarà mai, perché è comunque possibile che il virus si riattivi proprio in quelle situazioni in cui le difese immunitarie si riducono, si sopprimono. Quindi, riprendendo il discorso delle caratteristiche comuni: Capacità di riattivazione. Struttura e morfologia simile, poiché ovviamente siamo nell ambito della stessa famiglia. Proprietà biologiche. Si tratta di virus che: replicano nel nucleo; conducono a morte per lisi la cellula infettata; possiedono lo stato di episoma del DNA nelle forme di latenza; hanno un grosso genoma che codifica per un numero importante di proteine, soprattutto ad attività enzimatica, vantaggiose per il virus ma per fortuna anche per noi. Infatti, la disponibilità messa da parte del virus di questo corredo enzimatico abbastanza ampio (enzimi per altro importanti per la trascrizione e la replicazione del virus), costituiscono un buon bersaglio per terapie antivirali su cui agire cercando di essere i più selettivi possibile. Anche se per i virus, diversamente che dai procarioti, questo discorso di tossicità selettiva è più limitato. La famiglia degli Herpesvirinae comprende tre sottofamiglie: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Il genere lo vedete (2 a colonna della tabella a lato); le specie sono le seguenti: 1. Alphaherpesvirus: Virus dell Herpes simplex di tipo 1, Virus dell Herpes simplex di tipo 2, Virus Varicella Zooster; 2. Betaherpesvirus: Cytomegalovirus, Herpes Virus umani di tipo 6 e di tipo 7; ~ 2 ~

3 3. Gammaherpesvirus: Virus di Epstein Barr e Herpes Virus 8. Nella 4 a colonna, vedete l acronimo che viene utilizzato e, nella 5 a, i siti principali di latenza. Per quel che riguarda gli Alphaherpesvirinae, i siti di latenza sono prevalentemente cellule neuronali, presenti nei gangli sensitivi; per quanto concerne i Betaherpesvirinae e Gammaherpsevirinae, fra i siti di latenza troviamo cellule linfocitarie di tipo B e di tipo T e monociti. Inoltre, il cytomegalovirus presenta anche altri distretti di latenza, come cellule del rene e cellule delle ghiandole salivari. Questo giustifica la loro diffusione anche ampia attraverso secrezioni (orali e genitali) e il rischio relativo alla trasmissione sessuale; per altro il cytomegalovirus, presenta anche il rischio dovuto alla possibile trasmissione materno-fetale dell infezione. Vi dicevo prima che alcuni Herpesvirus, in animali diversi dall uomo come l Herpesvirus simiae B della scimmia, può occasionalmente infettare anche l uomo. ALPHA HERPESVIRUS Specie: Herpes simplex di tipo 1, di tipo 2, Varicella-Zoster. Hanno come caratteristiche comuni quelle che abbiamo definito, ma nell ambito delle differenti sottofamiglie, si rilevano alcune peculiarità distintive. Ad esempio: Un breve ciclo re plicativo per gli Alpha Herpes virus. Un tropismo tissutale ampio, che riguarda la possibilità di poter infettare cellule epiteliali in vivo o anche in vitro insieme a fibroblasti. Un marcato effetto citopatico, che si traduce in vivo in una capacità litica importante delle cellule. (Chi di voi ha sperimentato lesioni erpetiche a livello cutaneo nella propria vita? Nessuno, siete fortunati, ma avete comunque magari avuto occasione di vedere amici, parenti o conoscenti con l herpes labiale, che spesso è deturpante; ci sono situazioni anche in soggetti diversamente sani in cui l herpes labiale, soprattutto nelle forme di riattivazione, ha delle estensioni importanti). Il sito di latenza sono i gangli nervosi. La trasmissione avviene per stretto contatto, per via sessuale o per via aerogena, quindi mediante la saliva. Il virus della varicella-zoster, nella sua forma di riattivazione, produce l herpes zoster o il cosiddetto fuoco di sant Antonio, che viene trasmesso facilmente quando un soggetto presenta lesioni cutanee della varicella o dello zoster: le vescicole si trasformano poi in pustole e croste e si esauriscono; in realtà, questa è la fase di contagiosità più evidente, ma c è una fase di contagiosità meno evidente e altrettanto importante (forse più importante), collocabile nel periodo antecedente la comparsa delle lesioni cutanee, attraverso la trasmissione con la saliva ( Quindi, quando in un asilo, in una scuola, ci sono uno o due casi di varicella, provvedere a chiudere la scuola non ha utilità, poiché intanto i bambini si saranno già infettati). Il periodo di incubazione è intorno ai venti giorni, la eliminazione massima del ~ 3 ~

4 virus è di qualche giorno antecedente alla comparsa dell esantema, per cui certe misure di contumacia non hanno alcun senso. (A tal proposito, cito Principi di microbiologia medica di G. Antonelli: La varicella si diffonde per mezzo delle goccioline di aerosol trasportate dall aria e anche mediante il contatto diretto con le vescicole. Un malato di varicella è infettivo dal momento della comparsa delle eruzioni cutanee a circa una settimana dopo. I pazienti affetti da zoster possono trasmettere l infezione a bambini suscettibili e dare inizio a un focolaio pandemico.) BETA HERPESVIRUS Specie: Cytomegalovirus, Herpes Virus 6, Herpes Virus 7 Ciclo replicativo lungo: questo significa che, quando si conducono delle indagini diagnostiche, magari in isolamento diretto in colture cellulari, i tempi di osservazione in presenza di virus citomegalico sono più lunghi, spesso inadatti con i tempi di attesa della risposta del referto ai fini pratici; quindi ecco perché bisogna ricorrere anche ad altre indagini più rapide, di cui parleremo il prossimo anno. Tropismo tissutale ristretto in vitro. Crescono bene solo su cellule fibroblastiche, in cui peraltro determinano un effetto caratteristico, da cui derivano anche il nome (cytomegalovirus): l ingrossamento delle cellule, a formare cellule giganti, che possono assumere degli aspetti o di cellule multigiganti, non con aspetto di sincizi, oppure di veri e propri sincizi. La latenza è più estesa rispetto alle cellule linfocitarie e monocitarie, perché possono essere interessate anche cellule epiteliali, come quelle presenti a livello dell urotelio, del rene, delle ghiandole salivari. Per quanto riguarda Herpes 6 e Herpes 7, il distretto di latenza è più ristretto invece al sito linfocitario, ai linfociti T; Anche in questo caso, la trasmissione avviene: per contatto, quindi per via aerogena, respiratoria, per trafusione, trapianto e congenita (in realtà, tutte le suddette modalità riguardano la trasmissione del cytomegalovirus, poiché HHV-6 e HHV-7 vengono trasmessi principalmente tramite la saliva. A tal proposito, cito Principi di microbiologia medica di G.Antonelli: Il CVM può essere trasmesso sia per via orizzontale sia per via verticale sia nel caso di un infezione primaria che nel caso si tratti di una reinfezione o riattivazione. Il virus è secreto nella saliva, nel sangue, nelle urine, nello sperma e nelle secrezioni lacrimali. In ogni caso, la trasmissione richiede il contatto diretto ). Per quanto riguarda, Herpes virus 7, peraltro, non vi sono evidenti correlazioni tra infezione e patologia: c è qualche sospetto sul fatto che possa intervenire in forme cutanee, ma la loro eziologia rimane comunque ancora incerta; l Herpes Virus 6 è sicuramente associato a una forma abbastanza benigna di esantema, esantema subitum dei bambini piccoli, però ci sono altre forme importanti di patologie associate: meningiti, encefaliti, forme febbrili, forme anche tumorali, nonostante siano sorti dubbi per quel che riguarda l associazione certa. ~ 4 ~

5 GAMMA HERPESVIRUS Specie: Virus di Epstein-Barr (responsabile della mononucleosi infettiva, di sindromi linfoproliferative benigne e maligne, del linfoma di Burkitt e del carcinoma nasofaringeo), Herpes 8 (responsabile del sarcoma di Kaposi, in particolare in soggetti HIV positivi). Sono anche essi dotati di un ciclo replicativo molto lungo. Possono dare infezioni non produttive. Non lo abbiamo detto, ma è evidente il ruolo potenziale di tutti i virus erpetici nel determinare la trasformazione neoplastica delle cellule latentemente infettate: per alcune le associazioni sono certe, come quelle fra sarcoma di Kaposi ed Herpes 8, linfoma di Burkitt e carcinoma nasofaringeo associati al virus di Epstein-Barr; per altre, tipo associazione tra tumori genitali e virus erpetici, si presume che questi ultimi possano agire da cofattori importanti nella trasformazione neoplastica (ne abbiamo parlato anche in occasione del tumore della cervice uterina, determinato dal Papilloma virus). Sono questi virus più difficili da coltivare; Hanno come sito di latenza le cellule linfoidi, di tipo B o T; Si trasmettono anch essi più facilmente per via areogena. Le malattie determinate dal virus di Epstein-Barr, come la mononucleosi, sono proprio paradigmatiche di questa modalità di diffusione molto ampia già dall età giovanile o pediatrica perché si trasmette facilmente per questa via. Tutto questo rende ragione della diffusione ubiquitaria di questi virus e del fatto che entriamo in contatto con essi molto precocemente nel corso della vita. Morfologia e struttura del genoma Come sono fatti questi virus? Dall immagine (a lato), sembrerebbero un uovo fritto, un uovo sfritellato, ma in realtà è un artefatto della microscopia elettronica, che deriva dal fatto che comunque questi virus sono dotati di un envelope evidentemente, ma anche di una componente di matrice o tegumento, interposto tra envelope e il capside; il capside è di natura icosaedrica, costituito da 162 capsomeri. Il DNA è a doppia elica, lineare, abbastanza grande anche se le dimensioni rientrano in un range da 100 a 250, quasi 300 kb, con una caratterizzazione strutturale, funzionale anche importante: ci sono sequenze uniche, sequenze ripetute che intervengono nella fase di replicazione del virus. L envelope contiene almeno dieci o undici glicoproteine importanti, soprattutto per quello che riguarda il riconoscimento di recettori e la capacità di fondere gli involucri; il tegumento, come tutti gli elementi di matrice dei virus, contribuisce all architettura, alla neoformazione, alla morfogenesi delle particelle virali e al loro trasporto intracellulare. Il genoma contiene un numero importante di open reading frame di geni, che codificano più di cento proteine; presenta delle sequenze uniche lunghe, delle sequenze uniche corte, cioè il genoma è proprio ~ 5 ~

6 suddiviso in questi due tratti e ci sono sequenze terminali o interne ripetute e in qualche caso invertite: l inversione di queste sequenze e l orientamento rispetto ai terminali 5 e 3 rende ragione del fatto che i genomi possono presentarsi (alcuni genomi, in particolare citomegalo e gli alpha-herpes virus, cioè herpes simplex e varicella) o in quattro isoforme o in due isoforme. Citomegalo e virus erpetici simplex possono presentare quattro isoforme, la varicella due isoforme; tutti gli altri presentano invece un unica tipologia di conformazione. Ciclo replicativo Questo è quanto può fare un virus: c è un virus che replica, il quale può dare un infezione litica, che porta a morte la cellula e poi di conseguenza al completamento del ciclo riproduttivo virale, oppure il virus può entrare in latenza; la differenza è dovuta al fatto che nel primo caso, vengono espressi tutti i geni codificanti e non codificanti del virus, che danno origine poi a una progenie virale. Nel secondo caso, c è una scarsa o assente espressione di messaggeri: vengono espressi solo degli mrna, guarda caso riferiti come trascritti della latenza (latency associated transcripts, LAT), che mantengono uno stato di inattività nel genoma, il quale si pone in rapporto di episoma con la cellula. Le cellule della latenza non sono permissive per la replicazione, ma da lì il virus può ripercorrere vie diverse verso cellule che consentono invece il completamento del ciclo vitale del virus. Assorbimento e penetrazione È presente in superficie un repertorio abbastanza importante di glicoproteine, alcune delle quali hanno una specificità particolare per quello che riguarda il riconoscimento di recettori cellulari oppure specificità per altre funzioni come la fusione degli involucri. Il virus entra per fusione tra envelope e membrana cellulare. I recettori sono tanti, prevalentemente glicosaminoglicani riconosciuti dalla glicoproteina gc, in particolare l eparansolfato, oppure recettori che vengono detti per l appunto molecole per l ingresso dei virus erpetici (HVEM), che vengono riconosciuti dalle glicoproteine gb e gd, diversamente espressi in cellule che presentano tali recettori; come vedete, un repertorio abbastanza ampio e anche a volte specifico per quel tipo di glicoproteina presente in ciascun virus. Sicuramente, il ruolo delle glicoproteine gh e gl è quello di favorire il processo di fusione indipendentemente dal tipo di cellule e di virus che si sono incontrati. Espressione genica Una volta che il genoma ha raggiunto il nucleo, ovvero il compartimento dove avviene non solo l espressione, la replicazione, ma anche l assemblaggio dei componenti virali, (diversamente da altri virus dotati di envelope), acquisisce il rivestimento attraversando ~ 6 ~

7 la membrana nucleare. Avviene poi un processo di trascrizione di messaggeri a cascata, per cui i primi messaggeri costituiscono un informazione per la traduzione di proteine precocissime, che, in parte, interagiscono con fattori cellulari (infatti anche per i virus erpetici, è valido il discorso della interruzione o smorzamento dei processi di espressione di sintesi macromolecolare cellulare), ma l altro loro ruolo è quello di innescare gli eventi successivi, riguardanti la trascrizione dei geni beta; a loro volta, i geni beta da una parte spengono l espressione dei geni alpha (una sorta di feedback negativo), dall altra avviano l espressione dei geni gamma, i quali codificano per le proteine tardive, cioè quelle strutturali, e quindi funzionali per la costituzione di nuovi virioni. In questo contesto di dinamica dell espressione genica, un ruolo importante lo svolge la proteina α-tif, proteina tardiva, che ritroviamo però nella fase precoce di espressione perché innesca la trascrizione dei geni precocissimi: lega infatti i promotori e i fattori di trascrizione cellulari per promuovere l attività delle RNA Polimerasi II. Inoltre ha poi l attività di transattivare, quindi innescare l espressione dei geni beta. Questi ultimi, come detto, si occupano di codificare quegli enzimi che sono necessari per la replicazione del virus e sono un corredo abbastanza ampio: non solo polimerasi, ma anche chinasi, elicasi e proteine che legano il DNA. Si tratta quindi di una serie di proteine che interagiscono con proteine cellulari e rappresentano appunto un bagaglio importante di attività virali, che il virus si porta dietro; i virus erpetici non utilizzano perciò polimerasi cellulari e questo è un vantaggio per poter utilizzare i farmaci attivi su questi enzimi. In cellule permissive, quindi non nelle cellule per la latenza, è importante il ruolo di una proteina, la cosiddetta Virus Host Shut-off Protein (VHS), che inibisce in questa fase l espressione dei geni cellulari. Una volta che si completa quindi la fase di espressione dei geni beta, questi spengono i promotori alpha, permettono la replicazione del genoma, una volta avvenuta la quale, si avvia poi la fase di espressione dei geni gamma. Il genoma dei virus erpetici circolarizza: segue quindi il modello di replicazione del rolling circle, ma anche parte della replica bidirezionale, secondo il modello della replicazione theta. Dopodiché, come terza fase dell espressione, abbiamo la trascrizione dei geni gamma, che sono principalmente strutturali, ma comprendono anche la proteina α-tif: essa rimane legata ai genomi di nuova generazione, per poter poi innescare successivi rami di replicazione virali e l espressione di nuovi genomi. Assemblaggio e rilascio Una delle glicoproteine, la gk in particolare dei virus erpetici, è implicata poi nelle fasi successive di assemblaggio, che avvengono nel nucleo: si verifica un rientro dei prodotti proteici di nuova produzione all interno del nucleo, dove avviene l assemblaggio e la gemmazione attraverso la membrana nucleare; poi l acquisizione della componente glucidica delle glicoproteine, che avviene attraverso il reticolo endoplasmatico e ~ 7 ~

8 l apparato del Golgi; infine si ha la fuoriuscita del virus, che può avvenire o attraverso la lisi cellulare (principalmente) oppure per esocitosi attraverso i sistemi di secrezione e trasporto cellulare. Latenza Per quello che riguarda il virus Herpes Simplex, mostriamo questo modello, ma in realtà vale per tutti i virus erpetici: la latenza si stabilisce nelle cellule non permissive o non completamente permissive per il ciclo produttivo virale. Probabilmente i meccanismi che deprimono l espressione dei geni nella fase di latenza sono molteplici: a tal proposito, un ruolo viene svolto dalle proteine tradotte dai messaggeri della latenza, che avrebbero un attività antiapoptotica nei confronti della cellula, evento che consente al virus di mantenersi in forma episomale. Un ruolo recentemente individuato importante lo avrebbero anche gli RNA antisenso, che funzionerebbero da regolatori negativi dell espressione dei geni trascritti precocissimi e questo consentirebbe la sola produzione di proteine legate alla latenza, mentre tutte le altre proteine sono bloccate. Esistono poi per quanto riguarda l attività replicativa del virus in fase di latenza due teorie. Sicuramente, tra le due, la più accreditata è l ipotesi statica, cioè il DNA, proprio in virtù del fatto che i geni della latenza, le proteine della latenza, l RNA antisenso bloccano l espressione degli altri geni virali, non sarebbe in grado di replicare nel nucleo del neurone, all interno del quale rimarrebbe in forma episomale; secondo un'altra corrente di pensiero invece si avrebbe una bassa, scarsa espressione virale, che comunque comporterebbe un minimo (anche se un minimo livello) di produzione di nuovi virioni (ipotesi dinamica). Dal sito di latenza il virus percorrendo la via assonale, che ha seguito dal sito di infezione primaria per raggiungere i gangli sensitivi, può ripercorrere la stessa via in senso centrifugo, raggiungere di nuovo gli stessi siti dove si era localizzata la lesione o l infezione (poiché spesso l infezione primaria può essere del tutto silente, asintomatica), e dare lesioni litiche: queste comportano lo scorrimento dell epitelio, l accumulo di liquidi e la formazione delle classiche vescicole, che poi diventano croste e si esauriscono. Lo stesso discorso vale per il virus della varicella-zoster (La varicella qualcuno di voi ce l ha avuta? Non dite di no, eh Spero per voi da piccolini, perché la varicella da adulti è un po più impegnativa, comunque vi ricorderete: prima vescicoletta, poi grattate e poi in tutto il corpo, nei posti più fastidiosi del mondo). La varicella ha una diffusione a livello cutaneo ampia, mentre la forma di riattivazione, cioè lo Zoster, fuoco di Sant Antonio, è limitata ad alcuni dermatomeri, toracici, lombari, a volte però la localizzazione può essere diversa; vi sono Zoster orbicolari molto fastidiosi, molto difficili da riconoscere, Zoster oculari etc.. In questo caso, l espressione è limitata ad un dermatomero, poiché il virus scende lungo una singola fibra nervosa afferente quel ganglio sensitivo, che sia toracico piuttosto che dorsale piuttosto che cranico, e condiziona la localizzazione della sede di riattivazione. ~ 8 ~

9 Parte II (Giulia Cappellazzo) (I paragrafi contrassegnati da * sono degli approfondimenti da me inseriti ai fini di rendere più comprensibile la trattazione) PARAMYXOVIRIDAE Generalità Sono virus ad RNA, Single Strand (ordine Mononegavirales). Anche qui vediamo un'ampia eterogeneità di virus appartenenti a sottofamiglie principali quali: PARAMYXOVIRINAE: è la più importante e comprende: RESPIROVIRUS (parainfluenza 1 e 3) RUBULAVIRUS (parainfluenza 2, 4a, 4b e parotite) MORBILLIVIRUS (virus del morbillo) HENIPAVIRUS (è un genere che comprende virus Hendra e Nipah, che hanno come conservatore naturale il pipistrello e da questo il virus può passare ad altri animali, rispettivamente e prevalentemente, il cavallo e il maiale e occasionalmente si può infettare anche l'uomo; li consideriamo ancora come virus che speriamo non diventino emergenti, ma bisogna portare attenzione anche ad essi) HAVULAVIRUS (virus della malattia di Newcastle, che occasionalmente può interessare anche l'uomo) PNEUMOVIRINAE: PNEUMOVIRUS (virus respiratorio sinciziale, sicuramente più importante nell'ambito dei pneumovirus) MATAPNEUMOVIRUS (sono un insieme di virus, inizialmente associati, se vi ricordate, all'epidemia di coronavirus* che c'è stata qualche anno fa, la quale all'inizio si pensava fosse causata da un metapneumovirus, in realtà poi si è scoperto che si trattava di un tipo specifico di virus di nuova insorgenza, partito dallo zibetto, un animale dal quale ha fatto poi il salto di specie e successivamente è scomparso, non prima di aver lasciato un consistente numero di morti tra cui un ricercatore e medico marchigiano, che conoscevo molto bene, che lavorava per l'organizzazione Mondiale della Sanità; infettivologo, esperto delle malattie tropicali, si è subito impegnato per cercare di individuare questo nuovo agente, ma purtroppo ci ha lasciato la vita.) [* si riferisce alla SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome - è una sigla che sta per Sindrome Acuta Respiratoria Severa, una forma atipica di polmonite apparsa per la prima volta nel novembre 2002 nella provincia del Guangdong (Canton) in Cina. È apparsa a Hong Kong e in Vietnam nel tardo febbraio 2003, poi anche in altri paesi per via di viaggi internazionali di individui infetti. La malattia, identificata per la prima volta dal medico italiano Carlo Urbani, è mortale in circa il 15% dei casi in cui ha completato il suo corso, con il tasso di mortalità attuale di circa il 7% degli individui che hanno contratto l'infezione. Questa malattia è causata da un coronavirus, così chiamato per la sua forma a corona.] Cercheremo di confrontare i paramyxovirus con una famiglia simile, cioè i virus dell'influenza (Orthomyxovirus). - I paramyxovirus sono, a differenza dei virus dell'influenza, caratterizzati da RNA a single strand, con polarità negativa, non segmentati e ciò rende ragione del fatto che, differentemente dai virus influenzali, sono abbastanza costanti, cioè non subiscono processi importanti di ricombinazione o di mutazione. Vi chiederete perché non subiscano mutazioni random, nonostante siano virus ad RNA per i quali abbiamo sempre detto che mutano quando ~ 9 ~

10 le polimerasi sbagliano? In realtà il motivo sembrerebbe essere dovuto al fatto che le mutazioni (perlomeno quelle che si è riusciti a studiare, utilizzare e simulare in vitro) riguardano dei geni importanti, indispensabili per la replicazione, quindi sarebbero mutazioni non fissate in quanto non vantaggiose per il virus. Inoltre il motivo richiama anche alcune considerazioni di tipo epidemiologico e critico, soprattutto a riguardo del morbillo. - Il nucleocapside è elicoidale. - Come i virus dell'influenza, sono pleiomorfi; sono provvisti di envelope. - Hanno una particolare strategia di replicazione che richiede ed è condizionata dalla continua produzione di alcune proteine. - Sono dotati (anch'essi come i virus influenzali) di ciclo replicativo lungo, possono dare effetti citopatici, che comprendono la formazione di inclusioni citoplasmatiche; sono virus sinciziogeni. Facendo un confronto rapidissimo con gli orthomyxovirus, notiamo che la caratteristica più importante dei paramyxovirus è la mancanza di segmentazione dell'rna (con le conseguenze che abbiamo già detto); inoltre non hanno bisogno di un primer, cioè un innesco per la replicazione e quindi possono replicare nel citoplasma; non hanno un meccanismo di rilascio all'interno di un endosoma (con quindi rilascio ph-dipendente), ma attraverso una fusione cellulare; la variabilità antigenica è minima per i paramyxo e elevata per gli orthomyxo; i riarrangiamenti genetici sono rari per i P. e frequenti per gli O.. Le malattie provocate dai Paramyxo sono sindromi parainfluenzali oppure malattia respiratoria sinciziale (come soprattutto la bronchiolite, importante in particolare in età pediatrica e neonatale), il morbillo e la parotite. I paramyxovirus (poi vedremo meglio nel dettaglio) producono una serie di proteine (7-8 proteine) importanti poiché implicate con il complesso polimerasico (proteina L, proteina P e nucleoproteina NP) e proteine di attacco che hanno o non hanno sempre attività e di emoagglutinina e di neuraminidasi; in particolare nel virus di parotite e influenza hanno entrambe le attività, in quello del morbillo ha solo attività emoagglutinante, nel virus respiratorio sinciziale nessuna delle due attività ma c'è una proteina diversa. In tutti e tre i casi comunque sono considerate proteine di attacco che riconoscono recettori specifici. Poi ricordiamo la proteina F che è un complesso che viene clivato nei due monomeri, di cui uno costituisce la frazione di tipo fusogeno. ~ 10 ~

11 Questa è l'organizzazione genetica dei virus che diversamente sono in grado di esprimere, per quel che riguarda le proteine di superficie, un diverso assetto con produzione di proteine che hanno delle attività o di emoagglutinazione o di neuraminidasi o nessuna delle due. Queste sono le proteine HN, H, G, F (che abbiamo già descritto). Poi sono indicati il complesso polimerasico, nucleoproteico (NP, P, L e V) e una proteina di matrice (M) che anche in questo caso è un elemento che serve per la morfogenesi, l'assemblaggio e il rilascio del virus. Struttura del genoma e trascrizione Ora vediamo una interessante strategia di espressione di questi virus, il cui genoma (esemplificato nella slide) che contiene, procedendo da 3' a 5', rispettivamente le sequenze terminali Leader (sia a 3' che a 5') che non sono tradotte, e poi una serie di Open Reading Frame (sigla ORF*) tra i geni che codificano per singole proteine, che sono intervallati dalle sequenze di tipo EIS (E= End; I= Intermedied o Intergenic; S=Start). Ciò consente al virus di poter trascrivere in maniera ordinata, ma del tutto particolare, realizzando quella che abbiamo considerato essere una strategia importante per il virus di tradurre singole proteine da messaggeri monocistronici**. [* ORF= in italiano fasi di lettura aperte o DNA/RNA codificante (o Coding DNA Sequence [sigla CDS] se riferita specificamente al DNA) indica la parte (o sequenza) di DNA o RNA che codifica una proteina. In un gene le ORF si trovano comprese fra la sequenza di inizio ( codone d'inizio) e la sequenza di stop (codone di terminazione). È risaputo che, l'esistenza di una ORF, particolarmente se lunga, è una buona indicazione della presenza di un gene nella sequenza posta nelle immediate vicinanze.] [** Queste proteine sono codificate dal genoma del virus che presenta geni in sequenza, in cui ogni gene è separato dalle sequenze EIS (E=end, I=intergenic, S=start), al fine di codificare per mrna monocistronici (in poche parole vi è una sorta di pausa tra la trascrizione di un gene ed un altro). L'mRNA si dice monocistronico quando porta l'informazione per un solo gene, ed è una caratteristica tipica degli eucarioti, mentre nei procarioti l'mrna è molto spesso policistronico e cioè porta l'informazione per più geni (il trascritto di mrna corrispondente è in grado di tradurre per più catene polipeptidiche diverse, in sequenza).] In sostanza, che cosa succede? Nella slide vediamo le sequenze EIS interposte tra i diversi ORF. Il complesso polimerasico (P+L) ha come prima attività quella di iniziare la trascrizione di mrna al terminale 3' e quindi di trascrivere la sequenza Leader. Quando il complesso polimerasico raggiunge la sequenza intermedia con il segnale di stop, si ferma, si stacca e ricomincia a trascrivere a partire dallo START per la nuova proteina, in genere il gene N; quindi la trascrizione continua fino ad incontrare nuovamente un segnale di STOP, a tal punto la POL si stacca e ricomincia al terminale 3' del gene successivo. ~ 11 ~

12 Questo è sia un sistema per realizzare un processo di trascrizione/traduzione a partire da mrna monocistronici, sia un sistema che può dotarsi delle sequenze di riconoscimento (a 3' e 5') per la traduzione, cioè le sequenze K-metilate e le sequenze di poliadenilazione. Infine è anche un processo che interviene nella cosiddetta Trascrizione Polarizzata. Abbiamo detto infatti all'inizio che l'espressione della catena terminale è influenzata dall'accumulo di prodotti proteici, realizzati con una gerarchia che individua al terminale 3' la massima capacità di espressione e traduzione, quindi vengono prodotte più proteine N e P. Queste ultime sono le proteine critiche che poi entrano a far parte del complesso multiproteico. E via via, le proteine meno espresse sono quelle che si avvicinano al terminale 5': la proteina L è quella meno espressa. Il ruolo delle proteine N e P (in particolare della proteina N) è quello di determinare, nel momento in cui si accumula, uno shift dalla trascrizione e traduzione delle proteine a un segnale per iniziare la trascrizione dell'rna tutta lunghezza, che dovrà essere ricopiato per generare il genoma delle nuove particelle virali. Quindi solo quando si raggiungono alti livelli di proteina N, allora la polimerasi è in grado di saltare il segnale di stop, che incontrerebbe come abbiamo visto prima, e di proseguire la trascrizione fino alla fine di tutto il genoma. In questo modo si ha il passaggio, condizionato da bassi livelli di proteina N che favorisce la sintesi di singoli messaggeri monocistronici, ad una fase in cui, bypassando il segnale di stop, si ha la produzione di un mrna lungo e poi del genoma da parte della polimerasi virale. Assemblaggio e rilascio del virione Come sempre il nucleocapside viene poi assemblato nel citoplasma e vengono assemblate le nucleoproteine con RNA di nuova generazione. Infine l'assemblaggio e la maturazione vengono completati a livello della superficie cellulare con fuoriuscita per gemmazione (o budding) del virus. Questa immagine mostra come l'effetto citopatico, conseguentemente alla fusione cellulare, porti a cellule giganti, sincizi e corpi inclusi. (Le slide dalla 17 alla 31 sono state saltate per mancanza di tempo) ~ 12 ~

13 Una curiosità (riportata nell ultima slide) riguarda il possibile ruolo di zoonosi dei virus Nipah e Hendra che troviamo nei pipistrelli soprattutto, ma anche potenzialmente il cinghiale o i topi possono infettare il maiale e da qui occasionalmente il virus può essere trasmesso ad altri animali, come i cavalli e altri mammiferi. Al momento è diffuso in Malesia e Australia, ma bisogna portare attenzione perché abbiamo avuto brillanti esempi di virus esoterici che si sono avvicinati alle nostre zone geografiche e i motivi li abbiamo più volte sottolineati. PICORNAVIRIDAE Generalità Sono virus a RNA a polarità positiva. Si tratta di una grossa famiglia con molti generi: Enterovirus, Hepatovirus (virus dell'epatite A, -ci mancava questo, è un genere a parte, veniva considerato tra gli enterovirus-), Rhinovirus (virus del raffreddore comune), Aphtovirus (Afta Epizootica: si tratta di una zoonosi che occasionalmente potrebbe coinvolgere l'uomo), Cardiovirus (lasciamo perdere!), Parechovirus (infezioni gastro-intestinali e respiratorie nell'uomo), Erbovirus, Kobuvirus, Teschovirus (lasciamo perdere!). Gli Enterovirus hanno 68 sierotipi diversi. I Rhinovirus hanno almeno 100 sierotipi diversi, cioè determinano un raffreddore diverso dall'altro poiché ci troviamo di fronte a una sottotipizzazione del Rhinovirus amplissima che giustifica la frequenza e ovviamente la non immunità nei confronti di altri nuovi Rhinovirus. Gli Hepatovirus hanno una sola sottospecie (virus dell'epatite A). Coxsackie A e B, Echovirus, Parechovirus e Enterovirus hanno invece un numero di specie abbastanza ampio. Sono tutti caratterizzati da un'organizzazione genetica comune: sono virus piccolini, privi di envelope, sono particolarmente resistenti, anche all'ambiente acido dello stomaco quindi passano nell'intestino; infatti la loro trasmissione è sempre per via aerogena o per trasmissione fecaleorale. Hanno una struttura del capside icosaedrica, formata da 4 principali proteine: Vp1, Vp2, Vp3, Vp4 di cui solo le prime 3 costituiscono la superficie in forma di caratteristiche strutture geometriche dell'icosaedro, mentre Vp4 è internalizzata e vedremo il suo ruolo *. ~ 13 ~

14 Il genoma è una molecola di RNA positivo costituita da circa 7500 nucleotidi (o 7.5 Kb), che trascrive per un singolo messaggero lungo che traduce per una poliproteina, che poi viene clivata da proteinasi virali (similmente al virus dell'epatite C, che appartiene alla famiglia dei Flavivirus...). [* riporto il libro di testo riguardo alla simmetria icosaedrica del virione dei Picornaviridae: l'unità fondamentale costituente il capside è il protomero, che contiene una copia delle 4 proteine strutturali. L'aggregazione di 5 protomeri forma ciascuno dei 12 pentameri (costituenti l'icosaedro) la cui parte centrale prominente, strutturata a stella a 5 punte, occupa i 12 vertici dell'icosaedro. Vp1, Vp2 e Vp3 formano il rigido guscio esterno, mentre Vp4 si trova internamente a una stretta depressione della struttura, denominata canyon, che corre intorno ai 12 vertici. All'interno del canyon, che non permette l'ingresso di molecole anticorpali, avviene l'interazione della Vp4 con il recettore cellulare specifico.] Ritorniamo alle proteine capsidiche: la proteina Vp4, differentemente dalle altre proteine Vp1, Vp2, Vp3 che si portano sulla superficie, è interna a formare una struttura definita come un canyon, la quale ha una importanza fondamentale per quel che riguarda il riconoscimento del recettore. Recettori Come vedete, i recettori per questi virus, indipendentemente dalla distinzione, appartengono a delle molecole, prevalentemente di natura molto simile a quella delle immunoglobuline (hanno anche struttura e morfologia molto simili), oppure si tratta di integrine, oppure di molecole di adesione, oppure per altri virus si tratta di fattori di regolazione dell'attività complementare. Tutti hanno fondamentalmente una struttura simile, che li fa entrare nell'ambito della superfamiglia delle Ig, con un motivo carbossi-terminale intracitoplasmatico e un motivo N-terminale che presenta 2 o più globosità che costituiscono, per quel che riguarda la componente più esterna, il sito di riconoscimento per il canyon, rappresentato da questa invaginazione capsidica in cui è presente la proteina Vp4. Struttura del genoma Le analogie strutturali e funzionali del genoma del Picornavirus e di quello del Flavivirus riguardano non solo la presenza di proteine strutturali e non strutturali che vengono codificate a partire da un messaggero unico come poliproteina che poi viene clivata, ma anche la presenza all'estremità 5' e 3' di strutture regolatorie. In particolare all'estremità 5' c'è una struttura che abbiamo già individuato nei Flavivirus, costituita da diversi motivi, epitopi con una conformazione stemloop ed uno di questi ha una formazione di IRES (cioè sito di riconoscimento interno dei ribosomi), quindi è questa la strategia che anche questi virus adottano, diversamente da quelli dotati di una struttura cap, per innescare la traduzione sul ribosoma cellulare. Diversamente dai Flavivirus, è importante il ruolo della proteina VPg (Virion Protein genomic), che si associa all'estremità 5' ed è importante per innescare la trascrizione del virus. ~ 14 ~

15 Ritroviamo anche i geni che codificano per le proteine capsidiche (Vp1-Vp4) e per le proteine non strutturali rappresentate da una serie di proteasi e di proteine che intervengono nel determinare lo spegnimento delle funzioni cellulari quindi sono proteine shut-off. Infine la polimerasi che è posta in genere per la proteasi e il riconoscimento della proteina VPg all'estremità 3' del genoma. Ciclo replicativo Come avviene il ciclo replicativo? Il virus entra attraverso un meccanismo di endocitosi mediata da recettore (abbiamo visto l'ipotesi del canyon che sostiene questo tipo di riconoscimento), con traslocazione per alcuni picornavirus (non sempre è così) in cui passa direttamente l'acido nucleico oppure il capside entra, viene poi liberato l'rna ed essendo a tutti gli effetti un messaggero a polarità positiva con un sito di riconoscimento per i ribosomi, innesca direttamente la traduzione di una poliproteina, i cui prodotti servono non solo per la produzione di proteine strutturali ed enzimatiche compresa la polimerasi, ma alcuni hanno degli effetti devastanti la cellula in quanto ne arrestano la funzionalità: sono proteine shut-off e di reclutamento del binario di traduzione a favore del virus, inoltre alcune di quelle proteine che abbiamo visto prima hanno qualche funzione di innescare l'apoptosi cellulare quindi gli effetti sono poi associati alla lisi, a seguito della liberazione della progenie virale, ossia effetti destruenti per la cellula. Quindi si verificano cambiamenti morfologici-strutturali dovuti alla lisi e disfunzione attraverso il meccanismo shut-off. Assemblaggio Per quello che riguarda l'assemblaggio, i picornavirus hanno rappresentato un modello particolare per capire come l'autoassemblaggio avvenga a partire dai precursori protomerici di piccole dimensioni, che si associano via via a formare dei pentameri più grossi, i quali a loro volta compongono un capside vuoto che a quel punto è in grado di associarsi con il genoma a rna e poi concludere gli eventi di processamento dei precursori per le singole proteine virus capsidiche e formare la particella virale nuova. (la spiegazione da slide 11 a 27 del file riguardante i picornavirus non è stata fatta perchè non c'era tempo) ~ 15 ~

16 Hepatovirus : Virus dell' epatite A (HAV) Precedentemente è stato associato al genere degli Enterovirus; oggi invece è l'unico rappresentante (l'unica specie) di un genere a sé stante, gli Hepatovirus. È l'agente eziologico di una delle due forme principali di epatite da virus a trasmissione fecale-orale (l'altro è il virus dell'epatite E) ed è quindi frequentemente associato al consumo di cibi o bevande contenenti il virus, poiché inquinati evidentemente dal materiale fecale umano; si può ritrovare quindi in alcuni particolari alimenti (e in alcune particolari bevande, le bevande non ci riguardano, gli alimenti probabilmente sì), poiché il consumo di frutti di mare in grado di concentrare l'acqua, fa si che accumulino una grossa quantità di virus e quindi, se non trattiamo questi alimenti con il calore per tempi sufficientemente adeguati per eliminare il virus, rischiamo di infettarci e quindi di avere una epatite acuta sintomatica o asintomatica. Quest'ultima è il quadro più frequentemente osservato dalle nostre parti, quindi abbiamo più spesso delle forme asintomatiche, peraltro anche il momento in cui ci si infetta è un po' spostato verso l'età giovane-adulta e ciò significa che siamo un po' più attenti alle norme igieniche o di trattamento degli alimenti, ma questo viceversa può essere un danno perché, come abbiamo detto anche in altre occasioni, un incontro precoce con microrganismi, con virus predispone ad una situazione di tolleranza e quindi anche di mancanza di effetti di malattia associati all'infezione. Differentemente da altri Picornavirus, l'infezione da virus dell'epatite A non è litica, per cui nella patogenesi della malattia epatica dell'epatite (si tratta di un'epatite prettamente acuta senza possibilità di avere persistenza del virus nell'organismo) il meccanismo di danno è mediato dal sistema immune. L'epatite A ha un'incubazione di circa 30 giorni; la trasmissione è fecale-orale. Come vi stavo dicendo prima: tanto più precoce è l'età in cui ci si infetta, tanto meno è evidente la sintomatologia, che invece è maggiormente manifesta nell'età giovane-adulta. Le complicazioni sono rare (epatite fulminante). Non si verifica mai un'infezione persistente. Questo schema rappresenta un modello tipico (che riprenderemo quando parleremo di diagnostica) in cui la diagnosi di infezione può essere condotta attraverso diverse metodologie diversamente indirizzate o alla ricerca del virus o alla ricerca di antigeni o a quella di anticorpi associati all'infezione. Come avremo modo di ribadire, oggi l'armamentario tecnologico dal punto di vista diagnostico a nostra disposizione è abbastanza ampio; dovremmo però scegliere che cosa fare puntando sull' accuratezza diagnostica e l'utilità diagnostica piuttosto che sull' appeal tecnologico che stiamo facendo: è bello parlare di PCR, PCR quantitativa o di utilizzo di microchip molecolari, ma in questo caso abbiamo a disposizione un semplicissimo metodo basato sulla ricerca di anticorpi di classe IgM che ci consente di fare una brillante terapia senza andare a spendere risorse e tempo con altri tipi di indagini. Voglio che vi arrivi questo messaggio che riprenderemo anche più avanti. ~ 16 ~

17 E' rappresentata l'epidemiologia (la prevalenza a livello mondiale): vedi ovviamente tutte quelle situazioni in cui i microrganismi e i virus a trasmissione fecaleorale hanno una maggiore prevalenza per i soliti motivi o si ha una situazione intermedia da un punto di vista epidemiologico. La diagnosi la abbiamo già detta sopra: la presenza di IgM indica un'infezione acuta e, poiché non c'è la possibilità di osservare infezioni persistenti, sappiamo che la presenza di IgG nel nostro organismo vuol dire che abbiamo superato l'infezione (e possiamo mangiare tranquillamente le cozze crude a rischio di prenderci il tifo, paratifo, il colera o altro, ma sicuramente non l'epatite A) oppure che siamo stati vaccinati. È indicato vaccinarsi se si decide di permanere nelle zone a più alto rischio di trasmissione per un periodo sufficientemente lungo compatibile comunque con i periodi di incubazione dell'infezione. Nota del professore: La poliomelite noi non ce la abbiamo più però è presente in altre zone geografiche ~ 17 ~