BIOTECNOLOGIE pag 1 di 16 POS VIR 018 INT rev. 0 del 26/01/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): QUANTIFICAZIONE MAIS EVENTO MON810
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1 BIOTECNOLOGIE pag 1 di 16 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo
2 BIOTECNOLOGIE pag 2 di Scopo Lo scopo della presente procedura è quello di descrivere le responsabilità e le modalità operative per la rilevazione e determinazione quantitativa di mais MON810 (evento di trasformazione MON ) in matrici agro-alimentari mediante PCR real time. 2. Campo di applicazione La presente procedura viene applicata a DNA estratto da matrici agro-alimentari per la rilevazione e determinazione quantitativa di mais MON810. Qualora il DNA di mais venga rimosso o altamente degradato durante il processo produttivo della matrice agro-alimentare, il metodo non fornisce risultati affidabili. Per il sistema endogeno HMG (High mobility group) il numero di copie di genoma rilevabili sono comprese tra 1000 e copie. Per il sistema evento specifico MON810 il numero di copie rilevabili è compreso tra 25 e copie. 3. Definizioni ed abbreviazioni - bp (base pairs): coppie di basi - Ct o ciclo soglia: ciclo al di sopra del quale la fluorescenza misurata supera un valore soglia e si distingue dal rumore di fondo - DNA bersaglio endogeno: tratto di DNA caratteristico della specie vegetale analizzata, presente in un numero di copie costante e conservato nelle diverse varietà vegetali di quella specie - DNA bersaglio ricombinante o transgenico: tratto di DNA caratteristico della modificazione genetica oggetto della prova - identificatore unico: codice numerico o alfanumerico volto a identificare un OGM, sulla base dell'evento di trasformazione autorizzato mediante il quale è stato sviluppato, e a permettere il recupero dei dati specifici pertinenti a quell'ogm - LOD (limit of detection): limite di rivelazione - LOQ (limit of quantitation): limite di quantificazione - NTC (no template control): controllo negativo di PCR - OGM (Organismi Geneticamente Modificati): organismi il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. - PCR (Polymerase Chain Reaction): reazione enzimatica in vitro, catalizzata da DNA polimerasi DNA dipendenti, che determina l amplificazione del DNA bersaglio. - Primer: oligonucleotide, che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio, utilizzato per innescare la reazione di PCR - Probe o sonda: oligonucleotide marcato che riconosce una sequenza specifica del DNA bersaglio rivelandone la presenza - qpcr: PCR quantitativa - Real Time PCR: tipologia di PCR in cui il sistema di rilevazione, avvalendosi di sonde marcate con fluorocromi specifiche per il prodotto di amplificazione, consente di seguire ciclo dopo ciclo l andamento della reazione
3 BIOTECNOLOGIE pag 3 di Riferimenti ABI PRISM 7900 SDS User s Manual, User Bullettin #2, dicembre Arumuganathan, K., Earle, E.D. (1991). Nuclear content of some important plant species. Plant Mol Biol Reporter 9, Certificate of analysis ERM -AD413; Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version ; Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version ; DO VIR Documento Organizzativo Guida all espressione dell incertezza di misura, UNI CEI ENV 13005, luglio Guida per la valutazione e la espressione dell incertezza nelle misurazioni, DT-0002 Sinal. Guidance document on meaurement uncertainty for GMO testing laboratories - Trapman S., Burns M., Broll H., Macarthur R., Wood R., Zel J. - IRMM 2007 IGR VIR 001 Istruzioni gestione reagenti IL VIR 002 creazione di file template.sdt" UNI EN ISO 21570: 2006 Prodotti alimentari Metodi di analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Metodi basati sull'acido nucleico; UNI EN ISO 24276: 2006 Prodotti alimentari Metodi di analisi per la ricerca di organismi geneticamente modificati e di prodotti derivati - Requisiti generali e definizioni; PG QUA 005 Gestione dei documenti PG VIR 001 Ricevimento, analisi, conservazione e smaltimento di campioni ufficiali prelevati PG VIR 003 Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR POS VIR 001 INT Organismi geneticamente modificati (OGM): Monitor PCR HMG; POS VIR 015 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB precipitante POS VIR 016 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Maxi Kit POS VIR 052 SUP Estrazione di DNA con la metodica CTAB POS VIR 053 SUP Estrazione di DNA con Dneasy Plant Mini Kit Statistics and chemometrics for analytical chemistry - J. N. Miller, J. C. Miller 2000 Westgard J.O. (2003) Ann. Clin. Biochem., 40, Moduli allegati Modulo POS VIR 018 INT/1: foglio di lavoro per organismi geneticamente modificati: quantificazione mais evento MON810 (file excel: GG-MM-AA POS VIR 018 INT qpcr MON810.xls);
4 BIOTECNOLOGIE pag 4 di 16 Modulo POS VIR 018 INT/2: Carta di controllo qpcr MON810 (file excel: POS VIR 018 INT Carta di controllo MON810.xls). 6. Principio Il DNA estratto e purificato dal campione da sottoporre a prova è amplificato enzimaticamente e rilevato mediante l impiego, in parallelo, di una coppia di primer ed una sonda specifici per il DNA bersaglio endogeno caratteristico del mais (regione del gene hmg), e di un altra coppia di primer ed un altra sonda specifici per l'area di inserzione del DNA ricombinante del mais MON810. Il sistema di quantificazione specifico per l evento di trasformazione MON810 è stato sviluppato per ottenere un prodotto di amplificazione di 92 bp corrispondente alla regione di integrazione del costrutto di trasformazione. L amplicone comprende una regione del promotore 35S derivato dal CaMV e una porzione del genoma della pianta. Per la determinazione del contenuto totale di DNA di mais viene amplificata una sequenza di 79 bp del gene della proteina high mobility group (hmg). Nella tabella alla fine del paragrafo sono riportate le sequenze 5'-3' degli oligonucleotidi. L eventuale comparsa di amplificati viene seguita attraverso un sistema di rivelazione in fluorescenza integrato allo stesso apparato di amplificazione. Vengono utilizzate sonde marcate con due fluorocromi, cosiddetti reporter (legato al 5 della sonda) e quencher (legato al 3 ); in assenza di amplificazione, il reporter irradiato trasferisce energia al quencher e viene osservata la fluorescenza solo di quest ultimo; a seguito di amplificazione, l attività 5 esonucleasica della polimerasi rimuove il reporter dalla sonda con conseguente emissione di fluorescenza specifica del reporter. Tale fluorescenza aumenta in modo direttamente proporzionale alla velocità di amplificazione. La fluorescenza misurata viene normalizzata rispetto ad un fluorocromo di riferimento passivo (ROX) presente nella miscela di reazione. Il metodo prevede la quantificazione assoluta del numero di copie di genoma aploide (1C) del mais totale e dell evento di trasformazione MON810 (MON ) tramite confronto tra il Ct rilevato dal campione e quello ottenuto dalle diluizioni del plasmide certificato ERM - AD413. Il rapporto tra le due quantità fornisce il contenuto relativo del mais MON810 sul totale dell ingrediente mais. Nome primer Sequenza 5-3 MaiJ-F2 (HMG For) TTg gac TAg AAA TCT CgT gct ga mhmg-rev (HMG Rev) gct ACA TAg gga gcc TTg TCC T Mhmg-probe (HMG Probe) FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gcg TA-TAMRA Mail-F1 (MON For) TCg AAg gac gaa gga CTC TAA CgT Mail-R1 (MON Rev) gcc ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT Probe Mail-S2 (MON Probe) FAM-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA gc-tamra 7. Apparecchiature, materiali, reagenti, materiali di riferimento e dispositivi di protezione individuali
5 BIOTECNOLOGIE pag 5 di Apparecchiature ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System Cappa a flusso laminare verticale sterile Congelatore -20 C ± 5 C Frigorifero +4 C ± 2 C Microcentrifuga Pipette monocanale volumi da 2 a 1000 ml Produttore di ghiaccio Vortex 7.2 Materiali Bicchieri di plastica Buffer TE (IPR VIR 127) Forbici Ghiaccio Griglia per microprovette Micropiastre ottiche di reazione da 96 pozzetti MicroAmp o microprovette ottiche MicroAmp Pinzette Provette tipo Eppendorf da 1,5 ml Provette tipo Eppendorf da 2,0 ml Puntali con filtro volumi da 2 a 1000 ml Secchielli per ghiaccio Soluzione decontaminante (IPR VIR 081) Soluzione disinfettante etanolo al 70% (IPR VIR 050) Strumento per l installazione dei tappi MicroAmp Supporto della griglia per microprovette o della micropiastra Supporti speciali per provette da 1,5 ml Tappi ottici MicroAmp o pellicola ottica adesiva 7.3 Reagenti Master mix PCR real time HMG (IPR VIR 148) Master mix mais evento MON810 (IPR VIR 137) H2O grado reagente sterile (IPR VIR 096) 7.4 Materiali di riferimento Plasmide ERM -AD413 (IRMM) 7.5 Campione di controllo Farina di mais MON810 0,57% - ERM -BF413d (IRMM)
6 BIOTECNOLOGIE pag 6 di Dispositivi di protezione individuali Guanti in lattice o vinile senza polvere Camice 8. Responsabilità Il Responsabile di Struttura ed il Responsabile della Prova hanno la responsabilità di garantire e verificare la corretta applicazione della presente procedura. Le responsabilità relative alla preparazione dei reagenti, all esecuzione del metodo di prova, alla lettura ed alla verifica dei risultati sono riportate sui moduli PG SQA 005/12: Tabella responsabilità personale a tempo indeterminato (TRPI) e Modulo PG SQA 005/13: Tabella responsabilità personale a tempo determinato, collaboratori e consulenti (TRPD). 9. Modalità operative Nell eseguire la procedura l operatore deve osservare scrupolosamente la PG VIR 003 (Gestione delle aree e delle attività per l esecuzione dei protocolli di PCR ). Durante l esecuzione della prova quantitativa, compilare le seguenti pagine del modulo POS VIR 018 INT/1 (file excel: GG-MM-AA POS VIR 018 INT qpcr MON810.xls): pag.1- campioni; pag.2- piastra pag.3-4 esiti qpcr Al termine della prova compilare il modulo POS VIR 018 INT/2: Carta di controllo qpcr MON810 corrispondente al file excel POS VIR 018 INT Carta di controllo MON810.xls e stampare il foglio di lavoro "grafico". 9.1 Norme di igiene e sicurezza Per l esecuzione della presente procedura si rimanda a quanto disposto dalla PG VIR 003 specificando che tali disposizioni, vista l innocuità della prova per l operatore, sono esclusivamente a tutela dell esito della prova stessa. 9.2 Preparazione dei campioni e dei controlli Da eseguire nell area di prova 220, 202 o 221A sotto cappa a flusso laminare verticale sterile. Dai campioni/controlli, estrarre e purificare il DNA secondo una delle seguenti procedure di supporto: POS VIR 052 SUP, POS VIR 053 SUP, POS VIR 015 SUP oppure POS VIR 016 SUP. Se possibile, quantificare il DNA ottenuto mediante lettura spettrofotometrica. Campioni: La prova quantitativa viene effettuata su 3 replicati di PCR alla concentrazione massima di 20 ng/µl corrispondente ad una quantità di DNA per reazione di 100 ng. Controlli:
7 BIOTECNOLOGIE pag 7 di 16 Controllo positivo: Utilizzare DNA estratto dal campione ERM -BF413d 0,57 ± 0,17 % g.c./g.c. alla concentrazione di 20 ng/µl corrispondente ad una quantità di DNA per reazione di 100 ng; Controllo negativo: Prelevare una aliquota di almeno 50 µl di H 2 O g.r. sterile da utilizzare come controllo di reazione per l allestimento della prova. 9.3 Allestimento della reazione L esperimento consiste nella preparazione di una piastra da 96 pozzetti sulla quale vengono allestite due reazioni per l amplificazione e la quantificazione di un frammento di DNA specifico per il mais MON810 e per il gene endogeno del mais hmg. Ciascun campione, controllo o standard è analizzato in tre repliche di PCR per il sistema MON810 evento specifico e per il sistema endogeno HMG. Fase 1: Preparazione delle miscele di reazione 1. Prelevare o preparare le miscele di reazione per l'amplificazione della sequenza evento specifica del mais MON810 (IPR VIR 137) e della sequenza del gene hmg specifica del mais (IPR VIR 148) in due provette tipo Eppendorf da 1,5 ml per una quantità pari a 20 µl moltiplicato per 4 volte il numero di campioni, controlli e calibratori (esempio per 1 campione: 20 µl x 4 repliche = 80 µl). NB: Per ogni quantificazione calcolare il volume di miscela di reazione necessario per 5 punti di calibrazione, 1 controllo positivo 1 controllo negativo e per il numero di campioni da analizzare. esempio per 2 campioni da sottoporre a prova: 5 standard + 1 controllo positivo + 1 controllo negativo + 2 campioni = 9 campioni Volume di miscela di reazione da prelevare o preparare: 9 campioni x 4 replicati di PCR x 20 µl = 720 µl 2. Conservare le miscele di reazione in ambiente refrigerato fino all'utilizzo e per un periodo non superiore ai tre mesi a +4 C ± 2 C. Fase 2: Programmazione dello strumento 3. Accendere l ABI Prism 7900HT Sequence Detection System o l ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System almeno 30 prima dell'esecuzione della prova. 4. Aprire il file TEMPLATE qpcr MON810.sdt, predisposto come segue: Profilo di amplificazione: Step Stage T ( C) Tempo (sec.) Acquisizione n. cicli 1 UNG 50 C 120 NO 1X 2 Denaturazione iniz. 95 C 600 NO 1X 3a Denaturazione 95 C 15 NO 3b Annealing e sintesi 60 C 60 SI 50X
8 BIOTECNOLOGIE pag 8 di 16 Detector: Detector Reporter Quencher MON810 FAM TAMRA HMG FAM TAMRA Passive reference dye: ROX Volume di reazione: 25 µl Modalità: standard (per ABI 7900Fast) Per l impostazione del file fare riferimento all istruzione IL VIR 002 Creazione dei file TEMPLATE.sdt 5. Definire la collocazione dei controlli e dei campioni nella piastra di reazione da 96 pozzetti in cui avverranno le reazioni riportandola a pag. 2 del foglio di lavoro POS VIR 018 INT/1. Impostare tre repliche di PCR per ogni campione, standard o controllo per entrambi i sistemi di reazione. Preferibilmente riservare la metà superiore della piastra per il sistema transgenico MON810 e quella inferiore per il sistema endogeno HMG. 6. Salvare il file col nome GG-MM-AA qpcr MON810.sds, indicando il giorno-meseanno nel nome del file. Nel caso vengano effettuate più corse nella stessa giornata, attribuire ai file una numerazione sequenziale (es. GG-MM-AA qpcr MON810.sds, GG-MM-AA qpcr MON810 2.sds, ecc.). Fase 3: Preparazione dei calibratori e allestimento della reazione 7. La preparazione delle diluizioni del plasmide ERM -AD413 (S1-S9) da utilizzare come punti di calibrazione devono essere preparati poco prima dell allestimento della piastra. Utilizzare il buffer TE (IPR VIR 127) per l'allestimento delle soluzioni di calibrazione (S1-S9); trattandosi di diluizioni seriali vorticare i campioni almeno 10 secondi e centrifugare brevemente prima di procedere alla preparazione della diluizione successiva. Per la preparazione delle diluizioni seguire lo schema seguente: E T Conc. Iniziale Conc. Finale Fattore di Vol DNA Vol Buffer Cp/µl Cp/µl diluizione µl µl S1 2 x x S2 E 5 x S3 E x S4 T 2 x S5 E T S6 E S7 E T S8 T S9 T
9 BIOTECNOLOGIE pag 9 di 16 N.B. Le calibrazioni dei sistemi HMG e MON810 utilizzano concentrazioni del plasmide diverse, pertanto i livelli di concentrazione indicati con E (S2, S3, S5, S6, S7) sono quelli da utilizzare per la calibrazione del sistema HMG, quelli con T (S4, S5, S7, S8, S9) sono da utilizzare per la calibrazione del sistema MON Agitare le soluzioni di DNA con il vortexer per almeno 10 secondi e centrifugare brevemente. 9. Preparare sotto cappa due provette tipo eppendorf da 1,5 ml (una per il sistema HMG e l altra per il sistema MON810) per ciascun campione, controllo e calibratore. 10. Aggiungere in ciascuna provetta un volume di master mix pari a 3,5 replicati di PCR: 70 µl. 11. Aggiungere un volume di soluzione di DNA pari a 5 µl moltiplicato per 3,5 replicati di PCR per ciascun campione: 17,5 µl. 12. Agitare ogni provetta con il vortexer per almeno 10 secondi e centrifugare brevemente. Tale passaggio è importante per ridurre al minimo la variabilità tra le ripetizioni di PCR. 13. Dispensare 25 µl in ciascun pozzetto seguendo la disposizione dei campioni riportata a pag 2 del modulo POS VIR 018 INT/ Applicare la pellicola adesiva o i tappi ottici. 15. Agitare la piastra per la rimozione di eventuali bolle presenti sul fondo dei pozzetti. Fase 4: Analisi dei dati Al termine dell amplificazione procedere all analisi della corsa come descritto di seguito, analizzando separatamente i due sistemi HMG e MON810: 16. Impostare la linea di base: in modalità lineare, impostare la linea di base 3 cicli prima del ciclo in corrispondenza del quale la linea di soglia incrocia la prima curva di amplificazione (ad es. se il Ct più piccolo è 25, impostare la linea di base a 22). 17. Impostare la linea di soglia: impostare la modalità logaritmica per la rappresentazione delle curve di amplificazione. Impostare la linea di soglia nella zona dove i diversi profili di amplificazione risultano paralleli, cioè nella fase esponenziale di PCR. 18. Esportare i dati in un file di tipo testo (*.txt). 19. Copiare tutto il testo contenuto nel file *.txt ed incollarlo nel foglio Grezzi del file Excel denominato POS VIR 018 INT qpcr MON Per il calcolo del risultato e dell'incertezza di misura dei campioni procedere copiando ed incollando i valori di Ct corrispondenti agli standard e ai campioni sulle rispettive aree del foglio di lavoro "Calcolo %". 9.4 Verifica della corsa e criteri di accettabilità 21. Verificare che il controllo negativo presenti un Ct 40 sia per il sistema hmg che per MON810. In caso contrario la prova quantitativa deve essere ripetuta. 22. Per entrambe le curve di taratura verificare che il coefficiente R 2 0,98, in caso contrario provare a costruire una retta di taratura con quattro punti anziché cinque e verificare nuovamente il valore di R 2. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore di R 2 < 0,98, ripetere la prova quantitativa, eventualmente
10 BIOTECNOLOGIE pag 10 di 16 dopo avere preparato una nuova serie di diluizioni del materiale di riferimento Plasmide ERM -AD413 (IRMM); 23. Verificare che i coefficienti angolari delle rette di taratura siano compresi tra -3,0 e - 3,7. Anche in questo caso, se questo requisito non è soddisfatto, provare a costruire un altra retta di taratura con quattro punti, anziché cinque, e verificare il relativo valore del coefficiente angolare. Se anche la retta di taratura costruita con quattro punti presenta un valore del coefficiente angolare esterno all intervallo [-3,0;-3,7], ripetere la prova quantitativa, eventualmente dopo avere preparato una nuova serie di diluizioni del materiale di riferimento Plasmide ERM -AD413 (IRMM); 24. Compilare il modulo POS VIR 018 INT/2: Carta di controllo qpcr MON810 corrispondente al file excel POS VIR 018 INT Carta di controllo MON810.xls inserendo il risultato ottenuto dal campione di controllo nel foglio di lavoro "Dati". Verificare che il risultato ottenuto sia conforme ai requisiti descritti al paragrafo 11.3 e stampare il foglio di lavoro "Grafico". 9.5 Verifica fogli di calcolo Con cadenza semestrale l affidabilità dei fogli di calcolo excel utilizzati nella presente procedura viene verificata mediante l analisi di una corsa test standard ad esito noto denominata POS VIR 018 INT qpcr test. Tutta la documentazione relativa a tali verifiche è conservata nell area di lavoro 200 in un apposito raccoglitore denominato OGM Verifica dei fogli di calcolo. 10. Espressione dei risultati: Esito 1 Risultato % < LOD/LOQ relativo (0,07%); Numero copie MON810 Campione 26; 2 Risultato % LOD/LOQ (0,07%); Numero copie MON810 Campione > 26; Espressione del risultato ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): QUANTIFICAZIONE EVENTO MAIS MON810: non rilevato mais MON810 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): QUANTIFICAZIONE EVENTO MAIS MON810: mais MON810 X % (tra X min % e X max %) espressa come incertezza estesa con fattore di copertura 2 relativo a gradi di libertà ad un livello di confidenza del 95%. Nel caso in cui un campione sottoposto a prova quantitativa presenti un numero di copie medio dell'evento MON810 inferiore o uguale al LOD pratico (26 copie) il risultato della
11 BIOTECNOLOGIE pag 11 di 16 prova è espresso come descritto per l'esito 1 indipendentemente dal contenuto percentuale osservato. 11. Validazione / verifica della capacità del laboratorio nell applicazione dei metodi di prova e di taratura e stima dell incertezza di misura: 11.1 Validazione I calcoli relativi alle fasi descritte in questo paragrafo sono riportati nel modulo Foglio di lavoro per la validazione/verifica della capacità del laboratorio nell applicazione dei metodi e stima dell incertezza di misura (VMSI POS VIR 018 INT) Specificità e sensibilità La specificità della reazione è stata assunta come descritto nel protocollo di validazione del Laboratorio Comunitario di Riferimento (CRL): CRL assessment on the validation of an event specific method for the relative quantitation of maize line MON 810 DNA using realtime PCR as carried out by Federal Institute for Risk Assessment (BfR) ( gmocrl.jrc.ec.europa.eu/summaries/mon810_validation_report.pdf). La specificità e la sensibilità sperimentale vengono verificate allestendo prove con campioni/materiali di riferimento positivi e negativi per la presenza di DNA di mais MON810 e vengono calcolate tramite le seguenti formule: n. risultati. negativi Specificità (%): 100% VN n. risultati. positivi Sensibilità (%): 100% VP dove: VN = Veri Negativi = n. campioni non contenenti l analita VP = Veri Positivi = n. campioni contenenti l analita La ISO 24276:2006 indica come criteri di accettabilità del metodo una specificità 95% e una sensibilità 95%. Dallo studio collaborativo i valori di specificità e sensibilità sono risultati pari a: Specificità = % = 98,7% 76 Sensibilità (%) = % = 99,3% 304 Determinazione del LOD (limite di rivelazione) Il limite di rilevazione (LOD) è definito come la quantità minima di analita che può che può essere rilevata in modo affidabile ma non necessariamente quantificata. Il limite di rilevazione del metodo è stato calcolato seguendo il documento dell'institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) "Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories" (Trapman et al., 2007).
12 BIOTECNOLOGIE pag 12 di 16 Il LOD è stato calcolato a partire dai dati di validazione ottenuti con lo studio collaborativo, in particolare: 4u0 LOD = 2 1 4RSU dove: u 0 = Incertezza standard assoluta RSU = Incertezza standard relativa Come riportato nel VMSI POS VIR 018 INT, il LOD risulta pari a 0,07% di mais MON810. Il LOD assoluto è calcolato considerando il numero di copie di genoma aploide (1C) di mais MON810 contenuto in un campione costituito da 100 ng di mais con contenuto di 0,07% dell'evento MON810. Il valore corrispondente a una copia di genoma aploide (1C) è stato assunto pari a 2,725 pg (Arumuganathan & Earle, 1991). Il LOD assoluto è stato calcolato essere pari a 26 copie di genoma aploide di mais MON810. Determinazione del LOQ (limite di quantificazione) Le linee guida fornite dall'engl (European Network of GMO Laboratories) nel documento "Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing" versioni del 25/01/2005 e del 13/10/2008 definiscono il limite di quantificazione (LOQ) come la concentrazione minima di analita che può essere rilevata in maniera affidabile con un grado accettabile di precisione e accuratezza. Definiscono inoltre tra i criteri di accettabilità che la concentrazione LOQ sia almeno 1/10 della concentrazione limite stabilita per legge (0,09%). Il limite di quantificazione (LOQ) del metodo è stato calcolato seguendo il documento dell'institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) "Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories" (Trapman et al., 2007). Il LOQ è stato calcolato a partire dai dati di validazione ottenuti con lo studio collaborativo, in particolare: LOQ = RSU u MAX RSU dove: u 0 = Incertezza standard assoluta RSU = Incertezza standard relativa RSU = Incertezza standard relativa massima accettabile MAX Come riportato nel VMSI POS VIR 018 INT, il LOQ risulta pari 0,05% di mais MON810. Pertanto seguendo le indicazioni del documento "Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories" (Trapman et al., 2007) essendo LOQ < LOD si assume LOQ = LOD = 0,07% di mais MON810 Il LOQ assoluto è pari al LOD assoluto: 26 copie di genoma aploide di mais MON810. 2
13 BIOTECNOLOGIE pag 13 di 16 Precisione La precisione è stata valutata in accordo con la ISO tramite studio collaborativo calcolando lo scarto tipo di ripetibilità e lo scarto tipo di riproducibilità. Le linee guida fornite dall'engl (European Network of GMO Laboratories) nel documento "Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing" versioni del 25/01/2005 e del 13/10/2008 definiscono i limiti di accettabilità pari a: RSD r 25% RSD R 35% per concentrazioni di analita 0,02% e RSD R 50% per concentrazioni di analita < 0,02% Di seguito sono riportati i risultati ottenuti: Campioni 0,10% w/w 0,50% w/w 1,00% w/w 0,57% gc/gc 5,00% w/w Valore medio 0,08 0,32 0,63 3,17 s r 0,01 0,04 0,11 0,43 RSD r % s R 0,03 0,08 0,16 0,72 RSD R % Esattezza L'esattezza del metodo è stata valutata come descritto nella ISO sull'unico materiale di riferimento certificato in numero di copie disponibile (ERM -BF413d 0,57 ± 0,17 % g.c./g.c.). Sono stati calcolati quindi il BIAS e il BIAS relativo: BIAS = m µ BIAS BIAS % = 100% µ con: m: media pesata dei risultati µ: valore certificato Risultati: BIAS 0,57% = 0,06 BIAS% 0,57% = 11% Le linee guida fornite dall'engl (European Network of GMO Laboratories) nel documento "Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing" versioni del 25/01/2005 e del 13/10/2008 definiscono il limite di accettabilità per il BIAS% compreso tra i valori [-25%;+25%].
14 BIOTECNOLOGIE pag 14 di 16 Linearità La linearità delle reazioni dei sistemi MON810 e hmg è stata valutata calcolando il valore medio degli indici R 2 delle curve di calibrazione osservate nello studio collaborativo. Per entrambi i sistemi sono stati osservati valori medi di R 2 > 0,99 Criterio di accettabilità ENGL: R 2 0,98 Efficienza delle reazioni L'efficienza delle reazioni per i sistemi MON810 e hmg è stata calcolata a partire dal valore medio dei parametri di pendenza osservati nello studio collaborativo. 1 E (%) = 10 pendenza I valori medi della pendenza della curva di calibrazione è risultata pari a: MON810 = -3,555 hmg = -3,435 corrispondenti a valori di efficienza pari a: MON810 = 91,3% hmg = 95,7% Criterio di accettabilità ENGL: -3,1 pendenza -3,6 (110,2% efficienza % 89,6%) Stima dell incertezza di misura La scelta della procedura da adottare per la stima dell incertezza di misura, all interno del range di calibrazione, è caduta sul modello top-down, essendo disponibili dati di validazione ottenuti attraverso uno studio collaborativo. In particolare, si è fatto riferimento al sistema ed alle formule descritte nei paragrafi 2.2 e 2.4 del Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories pubblicato dalla Commissione Europea. In base a tali riferimenti, l incertezza standard u associata alla misurazione di una concentrazione c viene calcolata mediante la seguente formula: u = u ( c RSU ) dove u 0 è l incertezza standard assoluta, mentre RSU è l incertezza standard relativa. All incertezza standard così calcolata viene applicato un fattore di copertura pari a 2 per ottenere un incertezza estesa U con un livello di confidenza pari a circa il 95%, secondo la seguente formula: U = 2 u 11.3 Carta di Controllo Allo scopo di verificare costantemente lo stato di controllo statistico della prova quantitativa si costruisce una carta di controllo di Shewhart (Miller et al, 2000) nel seguente modo. Si prepara un grafico di tipo cartesiano, recante in ascisse il numero progressivo delle prove effettuate, ed in ordinate il valore percentuale ottenuto nelle prove.
15 BIOTECNOLOGIE pag 15 di 16 La carta di controllo viene costruita a partire dai valori ottenuti nello studio collaborativo di validazione sul materiale di riferimento ERM -BF413d (campione di controllo) assumendo come valore di tendenza centrale il valore medio ( x =0,63%) e come fattore di dispersione lo scarto tipo di ripetibilità ( σ r =0,11). Nel grafico si evidenziano: il valore medio, x ; le soglie, inferiore e superiore, di attenzione ( x ± 2σ r ) le soglie, inferiore e superiore, di allarme ( x ± 3σ r ) Al termine di ogni prova quantitativa si assegna un numero d ordine alla prova e si introduce nel grafico il valore percentuale ottenuto per il materiale di riferimento ERM -BF413d (campione di controllo). La collocazione di tale valore percentuale rispetto ai valori soglia evidenziati nel grafico consente di stabilire se il sistema di quantificazione è sotto controllo statistico, attraverso un percorso interpretativo fondato sulle cosiddette regole di Westgard (Westgard, 2003). Il seguente diagramma di flusso descrive sommariamente le tappe di questo percorso. Dove: 12s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di attenzione superiore o inferiore alla soglia di attenzione inferiore ; 13s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di allarme superiore o inferiore alla soglia di allarme inferiore ; 22s = il valore ottenuto dal campione di controllo è superiore alla soglia di attenzione superiore o inferiore alla soglia di attenzione inferiore e l evento si è già verificato nella prova precedente; 41s = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per quattro prove consecutive, o superiore alla media più 1σ o inferiore alla media meno 1σ;
16 BIOTECNOLOGIE pag 16 di 16 10x = il valore ottenuto dal campione di controllo risulta, per dieci prove consecutive, o sempre superiore alla media o sempre inferiore alla media. La prova rifiutata viene ripetuta alle medesime condizioni eventualmente eseguendo la prova su un strumento diverso. Se il problema persiste, sarà necessario controllare uno o più dei seguenti fattori: Estratto di DNA utilizzato come controllo positivo; Calibrazione (plasmide di riferimento); Taratura delle pipette; Fogli di calcolo, sia in fase di allestimento sia in fase di analisi della prova; Fogli di lavoro relativi all intera prova. Nel caso le verifiche risultino insufficienti, si richiede l intervento esterno di un tecnico specializzato per il controllo della strumentazione dell ABI Prism 7900HT Sequence Detection System and SDS Enterprise Database o dell ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System).
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