L introduzione della biologia molecolare nei laboratori di microbiologia alimentare: l esperienza del Laboratorio di riferimento Europeo per E.

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1 L introduzione della biologia molecolare nei laboratori di microbiologia alimentare: l esperienza del Laboratorio di riferimento Europeo per E. coli Stefano Morabito EU Reference Laboratory for E. coli including VTEC; Dipartmento di Sanità Publica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanità, Roma

2 Sicurezza degli alimenti: Approccio microbiologico classico 5 Standards colturali per la sicurezza alimentare (1441/07) 1HPLC (1441/07 Istamina) 12 Standards colturali per igiene di processo (1441/07)

3 Un nuovo paradigma per la sicurezza alimentare Nuovi Pericoli! Microorganismi non coltivabili (NoV, HAV) Microorganismi che non possono essere distinti dai ceppi non-patogeni appartenenti alla stessa specie (STEC) Microrganismi che presentano nuove combinazioni di geni di virulenza (STEC, EHAEC O104:H4)

4 Evoluzione delle metodologie impiegate nel controllo degli alimenti International Standards based on PCR Sohier, D et al Frontiers in Microbiology

5 Un nuovo paradigma per il controllo degli alimenti

6 ISO TS 13136:2012 STEC STEC O157 STEC O26 STEC O103 STEC O111 STEC O145 Coltura d arricchimento Geni stx Gene eae O26 O103 O111 O145 O157 geni Il metodo ISO TS contiene le indicazioni per identificare 8 target genici

7 ISO TS 13136: Ricerca di STEC identificazione dei top five sergroups STEP 1 (24h) 18 h 5 h Real Time PCR Geni stx Campioni Negativi: release! Target principale: stx! Campioni Positivi: Identificazione presuntiva di STEC vai all isolamento- Hold!

8 ISO TS 13136: Ricerca di STEC identificazione dei top five sergroups STEP 2 (2h) Attaching/Effacing adhesion Real Time PCR Gene eae STEP 3 (2h) Real Time PCR geni di sierogruppo Step 2 e 3: Indirizzare la selezione dei reagenti per l isolamento. Informativi per i risk managers

9 Isolamento di STEC top five STEP 4 (18-20 h) IMS O-specifica Reattivi commerciali disponibili per l arricchimento selettivo dei ceppi di E. coli apparteneti a cinque sierogruppi oggetto del metodo

10 Isolamento di STEC Fino a 50 colonie. PCR Screening per i geni stx Lo scopo del metodo ISO TS è la ricerca di STEC negli alimenti.

11 ISO TS 13136: Flow Chart I Stx -negativi Stx -positivi Stx -positivi Stx -positivi Screening eae eae-negativi eae-positivi eae-positivi Screening 5 Sierogruppi Release Isolamento (screening colonie per stx) Sierogruppo-negativi Isolamento (screening colonie per stx) Sierogrup po-positivi Isolamento (IMS+ screening colonie per stx)

12 ISO TS 13136: Espressione del risultato

13 ISO TS 13136: Espressione del risultato

14 Screening Multi-Target: Criticità Geni di virulenza e di sierogruppo possono essere presenti in cellule batteriche differenti Presenza di stx-phages liberi nell arricchimento vtx eae vtx vtx O26 ISOLAMENTO E RICHIESTO PER DIMOSTRATRE LA PRESENZA DI TUTTI I GENI NELLA STESSA CELLULA BATTERICA VIVA

15 STEC e patogenicità: Visione empirica STEC ASSOCIATI CON LE FORME PIU GRAVI (CE, SEU) Meccanismi di virulenza addizionali Attaching/Effacing adhesion STEC >100 sierogrouppi Nel serbatoio e nell ambiente Courtesy of Prof. Helge Karch O157 O26, O111, O103, O145: EHEC

16 Maggio-Giugno 2011: STEC O104:H4 3,842 casi 2987 non-seu 855 SEU 18 Decessi (0.6%) 35 Decessi (4.1%)

17 Un ceppo STEC nuovo di zecca??

18 EHEC attaching/effacing adhesion EAggEC Entero-aggregative adhesion

19 E. coli Enteroaggregativi Emorragici (EAHEC) EAEHEC O111:H2 8 HUS 1992 France EAEHEC O104:H4 850 HUS EAEHEC O111:H21 1 HUS EAEHEC O104:H4 1 HUS EAEHEC O104:H HUS Italy EAEHEC O104:H4 1 HUS 2001 Germany 2010 Finland 2011 Germany, France 2012 Northern Ireland Visione empirica->troppo restrittiva!!!!

20 STEC e sicurezza alimentare: una visione più ampia è necessaria! I sierogruppi che causano SEU sono in evoluzione continua STEC eae-negativi possono essere associati alla malattia grave I VTEC sono una popolazione estremamente eterogenea dal punto di vista patogenetico e nei caratteri identificativi!!

21 Quali STEC identificare?? E. coli STEC VTEC Patogeni

22 Regolamenti Europei per la Sicurezza Alimentare Il Pacchetto Igiene comprende regole su: Igiene degli alimenti Regole di igiene specifiche per gli alimenti di origine animale Criteri Microbiologici Linee guida sull applicazione Misure transitorie Regolamenti a livello degli SM

23 GERMOGLI: Matrice normata Controlli in vigore dal 1 st Luglio 2013

24 ISO TS 13136: Flow Chart I Stx -negativi Stx -positivi Stx -positivi Stx -positivi Screening eae eae-negativi eae-positivi eae-positivi Release Screening Sierogruppo O104 Screening 5 Sierogruppi Isolamento (screening colonie per stx) Sierogruppo-negativi Isolamento (screening colonie per stx) EU-RL VTEC_Method_04_Rev 1 10/07/2013 Sierogrup po-positivi Isolamento (IMS+ screening colonie per stx)

25 ISO TS 13136:2012 STEC STEC O157 STEC O26 STEC O103 STEC O111 STEC O145 STEC O104 Coltura d arricchimento Geni stx Gene eae O26 O103 O111 O145 O157 O104 geni Il metodo ISO TS 13136, basato sulla PCR ha consentito di produrre una revisione rapida per fare fronte alle esigenze normative!

26 Ricerca di STEC negli alimenti non normati Aumento dei test per STEC dopo la crisi O104 Aumentata consapevolezza del pericolo Trend positivo Matrici non normate Mancanza di regole certe -> Dispute

27 Risk Management (Art. 14 Reg CE 178/2002) Scientific Opinion on VTEC-seropathotype and scientific criteria regarding pathogenicity assessment Published on April the 9 th, 2013 EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) Pathogenicity can neither be excluded nor confirmed for a given STEC serogroup or serotype based on the seropathotype concept or analysis of the public health surveillance data. IL SIEROGRUPPO NON E UN FATTORE DI VIRULENZA I geni che codificano le Verocitotossine sono l unico determinante di virulenza There riconosciuto. is no single or combination of marker(s) that defines the potential of a STEC Fattori strain aggiuntivi to cause (legati human al meccanismo disease. While di colonizzazione) vtx2- and eae-positive sono probabilmente strains are associated associati con with un a quadro high risk sintomatologico of more serious più illness severo. other virulence gene combinations Grado di virulenza and/or in serotypes relazione may al profilo also be di associated rischio degli with alimenti serious (linee disease, guida) including HUS. Patient-associated (e.g., age, immune status, antibiotic therapy in the preinfection period), and dose-related factors may also be of importance.

28 Linee guida STEC In discussione alla Standing Committee on the Food Chain and Animal Health (SCFCAH) Microbiological Criteria Working Group

29 Linee guida STEC Risultati di Laboratorio Caratterizzazione del pericolo Analisi del rischio Profilo di rischio alimento Contesto Tipologia di alimento Gestione del rischio

30 Linee guida STEC

31 Linee guida STEC Nessun tipo di STEC = Tolleranza zero! STEC Altamente patogeni Top 5 + O104

32 Linee guida STEC Es. Carpaccio Trattamento non sufficiente (es. hamburger poco cotto) Alimento consumato dopo trattamento appropriato (es. roastbeef) Etichetta con avvertenze al consumatore Insufficiente chiarezza su destinazione finale d uso da parte di OSA (es. carcasse)

33 In conclusione.. La Biologia Molecolare diventa approccio analitico di riferimento Criticità legate alla produzione di evidenze indirette della presenza/assenza di patogeni negli alimenti Sviluppo di strumenti destinati alla gestione del rischio (linee guida, criteri etc ) La ISO TS è il metodo di riferimento per la ricerca di STEC in matrici normate (germogli) e non normate (carni) ed è comunque l unico standard per questi patogeni (mgliore strategia possibile) Regolamento 209/2013 (e collegati)+linee guida potrebbero contribuire a facilitare l adozione di misure in caso di positività ai tests eseguiti su tutte le matrici

34 Grazie per l attenzione! The EU-RL VTEC folks