I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta

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1 I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali Dott.ssa Chiara Targhetta

2 LOCUS localizzazione genomica unica all interno di un cromosoma; permette di definire la posizione di un gene o di una qualsiasi sequenza di DNA ALLELE una delle varie forme alternative di un gene o di una sequenza di DNA in una specifica localizzazione cromosomica (locus) Varianti alleliche Responsabili del POLIMORFISMO del genoma (VARIABILITÀ GENETICA)

3 I marcatori genetici Sono sequenze polimorfiche (presentano più varianti alleliche) che si trovano in un locus specifico all interno del cromosoma; si comportano in modo mendeliano e sono di facile rilevazione Identificano regioni cromosomiche nelle quali possono essere localizzati geni importanti la cui segregazione è difficile o impossibile da seguire

4 I marcatori genetici Poiché sono polimorfici possono essere utilizzati per valutare la variabilità genetica presente nelle specie e nelle popolazioni Locus 1 Locus 2 I marcatori genetici infatti identificano in modo semplice le mutazioni che si sono accumulate nel corso della storia evolutiva delle popolazioni

5 I marcatori genetici m1 m2 m1 m2 m3 m3 Essi permettono di costruire mappe genomiche dette mappe di linkage, definite in base alla frequenza di ricombinazione di tali marcatori Avendo a disposizione marcatori distribuiti uniformemente sul genoma è possibile seguire in modo indiretto la segregazione di qualsiasi gene

6 Classi di marcatori genetici....rilevabili a vari livelli a) livello morfologico: - caratteri mendeliani (caratteri qualitativi) b) livello biochimico: - gruppi sanguigni - isoenzimi - proteine (del plasma, del latte etc.) c) livello di DNA: - SNP, microsatelliti, RFLP, AFLP, RAPD,

7 Caratteristiche favorevoli dei marcatori del DNA Non influenzati dall ambiente Analisi indipendenti da sesso ed età Campioni di qualsiasi tessuto Neutrali Stabili Numerosi Polimorfici Generalmente codominanti Facili da monitorare Analisi automatizzabili

8 SNPs Polimorfismi a livello di singoli nucleotidi Variazioni di singole basi GAT CAG TTC GAT GTC GAT CAG TTA GAT GTC Frequenza elevata (più dell 1%) Molto abbondanti Distribuiti in modo casuale

9 Caratteristiche SNPs Numerosità (sono milioni) Alta riproducibilità e accuratezza Analisi è automatizzabile Sono spesso contenuti nei geni espressi Richiedono un lungo lavoro di messa a punto (per l individuazione del marcatore e del metodo per la sua rilevazione) Ne servono molti di più in fase di genotipizzazione

10 MICROSATELLITI o SSR (Simple Sequence Repeats) Ripetizioni in tandem di corte sequenze di nucleotidi: (AC) n, o (GT) n o (CAC) n o (GATA) n di- di- tri- tetra- nucleotidi Distribuite nel genoma animale in numero elevatissimo Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero di ripetizioni del motivo di base del microsatellite n Le regioni fiancheggianti tali ripetizioni sono conservate entro la specie e spesso anche a livello interspecifico

11 MICROSATELLITI o SSR

12 Visualizzazione microsatelliti 1) ESTRAZIONE DEL DNA Sangue Pelo Feci Seme 2) PCR DNA POLYMERASE CHAIN REACTION Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo 3 paia di cromosomi omologhi 3) ELETTROFORESI

13 PCR (polymerase chain reaction) Strumento per ottenere molte copie di una sequenza di DNA La reazione di amplificazione avviene ad opera di un enzima, la DNA polimerasi, e di sonde (primer) in grado di legarsi in modo complementare alle regioni fiancheggianti la mia sequenza bersaglio Il processo di amplificazione avviene in tre fasi: 1) Denaturazione del DNA (94-95 C) 2) Ibridazione del primer ad una temperatura variabile da 45 a 65 C a seconda della lunghezza e sequenza del primer 3) Estensione del frammento bersaglio (72 C) Tale ciclo si ripete n volte. La reazione viene effettuata in un termostato programmabile I prodotti possono essere visualizzati su un gel d agarosio

14

15 Microsatelliti o SSR

16 AFLP (amplified fragment lenght polimorphism) Evidenziano polimorfismi di restrizione, delezioni e inserzioni Allele 1 Allele 2 X Sequenza di taglio dell enzima di restrizione

17 AFLP fasi sperimentali EcoRI TaqI Digestione del DNA con enzimi di restrizione Legame di oligonucleotidi adattatori alle estremità dei frammenti (permettono l attacco dei primer nella fase successiva) Preamplificazione tramite PCR di parte dei frammenti generati Amplificazione selettiva e contemporanea marcatura di parte dei frammenti preamplificati Visualizzazione tramite elettroforesi dei frammenti selezionati e marcati

18 AFLP Marcatore polimorfico Marcatore monomorfico

19 Applicazioni dei marcatori nel settore zootecnico Costruzione di mappe genetiche e fisiche Mappatura di geni utili Isolamento di geni utili Mappatura di QTL Diagnosi di anomalie genetiche Analisi di paternità Studi su filogenesi, variabilità genetica, struttura e dinamica di specie e popolazioni Stima della consanguineità e ausilio ai piani di accoppiamento Tracciabilità dei prodotti

20 QTL: QUANTITATIVE TRAIT LOCUS sequenza genomica che ha un ruolo nell espressione di un carattere quantitativo è associata alla manifestazione di un carattere produttivo; probabilmente contiene un gene che è coinvolto nell espressione di quel carattere se si individua un marcatore ad essa contiguo/associato si può selezionare per il carattere desiderato (es. produzione di latte) semplicemente valutando la presenza/assenza di determinate varianti alleliche del marcatore

21 Mappa genetica..e identificazione di QTL SELEZIONE ASSISTITA DA MARCATORI l identificazione di un associazione tra marcatore e QTL permette una selezione più efficiente CLONAGGIO DI POSIZIONE identificare e clonare un gene che influenza un carattere quantitativo

22 Analisi paternità con microsatelliti Due alleli del microsatellite PADRE GENOTIPO: 263/263 PADRE GENOTIPO: 128/ GENOTIPO: 128/146 GENOTIPO: 263/277 MADRE MADRE FIGLIO GENOTIPO: 128/128 FIGLIO GENOTIPO: 263/ FIGLIO GENOTIPO: 124/128 GENOTIPO: 263/ FIGLIO FIGLIO GENOTIPO: 128/ DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA

23 Paternità: APPLICAZIONI Analisi di paternità esclusa in modo deterministico - il figlio ha un allele diverso da quello dei genitori - il figlio non ha almeno un allele di ciascun genitore provata solo in modo probabilistico Stime degli indici genetici con il metodo BLUP-Animal Model Piani di accoppiamento Calcolo dell ereditabilità

24 Marcatori e tracciabilità Utilizzando contemporanemente più marcatori si ottengono profili allelici in grado di identificare in modo univoco gli individui impronte digitali del DNA (fingerprinting) Se il profilo dell individuo è unico o è altamente probabile che lo sia, posso riconoscere l individuo stesso a partire da campioni di tessuto (sangue, pelo, carne, latte) dai quali ottengo il DNA da sottoporre all analisi dei marcatori TRACCIABILITÀ

25 In corrispondenza di ogni marcatore ogni individuo avrà uno solo (omozigosi) o due degli alleli possibili la probabilità che due individui abbiano la stessa combinazione di alleli in un locus può essere alta se aumentiamo il numero dei marcatori la probabilità che due individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i loci diventa piccolissima Numero loci (marcatori) Probabilità di matching (stesso profilo) * % % % % % % *considerando che tutti gli alleli in tutti i loci abbiano una frequenza pari a 0.25 (quattro alleli per ogni locus)

26 Marcatori e variabilità genetica BIODIVERSITA :...the variability among living organism in all the ecosystems in which they are part (FAO 1992)

27 Misurare la diversità a) a livello fenotipico: - caratteri morfometrici - caratteri morfologici Una porzione molto elevata di diversità genetica non è espressa Nuove tecnologie permettono di rivelarla b) a livello genotipico: - marcatori biochimici - marcatori molecolari

28 Marcatori molecolari La variabilità è espressa da: Numero e % di marcatori polimorfici Numero medio di alleli per locus La variabilità è quantificabile tramite: Eterozigosi attesa H exp =1-p 2 - q 2 Calcolo delle distanze genetiche

29 Rappresentazione delle distanze attraverso un dendrogramma

30 Marcatori molecolari e distanze genetiche Individuo A Individuo B Confronto profili ottenuti con analisi marcatori Stima della diversità in termini di numero di bande comuni e bande non condivise Maggiori le differenze fra i profili Maggiori le diversità a livello genomico

31 Importanza della conservazione della biodiversità nelle specie zootecniche Soddisfare future richieste di mercato Soddisfare futuri bisogni dell uomo Affrontare nuove patologie e condizioni ambientali Valore storico e culturale Valore ecologico (equilibrio ecosistema) Conservazione del territorio Valore socio-economico in aree marginali e PVS (es. prodotti tipici, turismo)

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