XXXIII CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA

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1 Vol. 23, Num. 3 Dicembre 2014 Poste Italiane S.p.A. - Sped. in Abb. Postale - D.L. 353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 n. 46) art. 1 com. 1 - DCB - Roma ISSN Contiene I.A. P e r i o d i c o d e l l a S o c i e t à I t a l i a n a d i C i t o m e t r i a Flow cytometric analysis of circulating endothelial cells and endothelial progenitors for clinical purposes in oncology: urgent need for methodological standardization Tumori solidi pediatrici: allestimento e caratterizzazione di linee tumorali primarie per un progetto di applicazione clinica del trapianto aploidentico di cellule staminali ematopoietiche XXXIII CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA AGGIORNAMENTI E INNOVAZIONI DELLA CITOMETRIA IN APPLICAZIONI CLINICHE E DI RICERCA Palazzo Ducale - Lucca, settembre 2015

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5 Periodico della Società Italiana di Citometria Vol. 23, Num. 3 DIRETTORE RESPONSABILE Raffaele De Vita COMITATO EDITORIALE Marco Danova Dipartimento di Medicina A.O. di Pavia S.C. di Medicina Interna e Oncologia Medica Ospedale Civile di Vigevano Raffaele De Vita Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell Uomo ENEA - Centro Ricerche Casaccia Roma Eugenio Erba Istituto Ricerche Farmacologiche Mario Negri Milano Giuseppe Starace Istituto Medicina Sperimentale CNR Roma Volume 23, numero 3 - Dicembre 2014 Lettere GIC Periodico della Società Italiana di Citometria Autorizz. del trib. di Roma n 512/92 del 17/9/92 Edizione quadrimestrale Spedizione in abbonamento postale Peer Review Journal ISSN Grafica: Renato Cafieri Stampa: Redazione: Società Italiana di Citometria SOMMARIO Dicembre 2014 Premio di Studio Francesco Mauro 2 LA CITOMETRIA E LE SUE APPLICAZIONI NELLA RICERCA DI BASE E NELLA CLINICA XXXIII Conferenza Nazionale di Citometria 6 AGGIORNAMENTI E INNOVAZIONI DELLA CITOMETRIA IN APPLICAZIONI CLINICHE E DI RICERCA Palazzo Ducale - Lucca, settembre 2015 Elenco/Albo Citometristi GIC Esperti a che punto siamo? 8 Sessione di esami 2015 scritto e orale Lucca settembre Flow cytometric analysis of circulating endothelial cells and endothelial progenitors for clinical purposes in oncology: urgent need for methodological standardization 9 Marco Danova, Mariangela Manzoni, Giuditta Comolli, Martina Torchio, Giuliano Mazzini Tumori solidi pediatrici: allestimento e caratterizzazione di linee tumorali primarie per un progetto di applicazione clinica del trapianto aploidentico di cellule staminali ematopoietiche 25 Comini Marta, Bolda Federica, Beghin Alessandra, D'Ippolito Carmelita, Ruggeri Loredana, Alberti Daniele, Bercich Luisa, Carella Graziella, Porta Fulvio, Caruso Arnaldo, Lanfranchi Arnalda c/o Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell Uomo ENEA Centro Ricerche Casaccia, s.p. 016 Via Anguillarese, ROMA 06/ Fax 06/ Associato alla Unione Stampa Periodica Italiana In copertina: Lucca, sede della XXXIII Conferenza Nazionale di Citometria Aggiornamenti e innovazioni della Citometria in applicazioni cliniche e di ricerca, Palazzo Ducale, dal 22 al 25 settembre 2015, piazza Anfiteatro vista dall alto. Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre SOMMARIO 5

6 6 Società Italiana di Citometria XXXIII CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA AGGIORNAMENTI E INNOVAZIONI DELLA CITOMETRIA IN APPLICAZIONI CLINICHE E DI RICERCA Palazzo Ducale Lucca, settembre 2015 Cellule staminali e terapie cellulari Ciclo cellulare e apoptosi Citogenetica molecolare Ematologia clinica e sperimentale Immunologia clinica e sperimentale Medicina trasfusionale Microbiologia clinica e sperimentale Microscopia Nuove tecnologie e metodologie citometriche Oncologia clinica e sperimentale Qualifiche e certificazioni in citometria Scienze ambientali e biotecnologie Tossicologia e Radioterapia SCUOLA NAZIONALE DI CITOMETRIA Corsi di aggiornamento La formazione continua del Citometrista 22 settembre 2015 Elementi base di Citometria in Ematologia Coordinatori: A. Aiello, A. Kunkl Elementi base di Citometria in Immunologia Coordinatori: A. Fattorossi, L. Zamai Elementi base di Citometria in Ricerca Coordinatori: R. Casotti, G. Pirozzi con il Patrocinio di Presidenza del Consiglio dei Ministri Agenzia nazionale per le nuove tecnologie, l energia e lo sviluppo economico sostenibile Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Istituto Nazionale Tumori Fondazione G. Pascale Stazione Zoologica Anton Dohrn Provincia di Lucca Comune di Lucca Con il Patrocinio ed il supporto della Provincia di Lucca Comitato Organizzatore R. De Vita (Roma) E. Erba (Milano) G. Mazzini (Pavia) G. Pirozzi (Napoli) Comitato Scientifico A. Aiello (Milano) R. Chianese (Ivrea) I. D Agnano (Roma) M. Danova (Pavia) R. De Palma (Napoli) L. Del Vecchio (Napoli) M.G. Della Porta (Pavia) A. Fattorossi (Roma) D. Fenoglio (Genova) G. Gaipa (Monza) A. Kunkl (Genova) F. Lanza (Cremona) S. Lucretti (Roma) A. Manti (Urbino) O. Nappi (Napoli) M. Rocchi (Bari) M. Spanò (Roma) V. Tirino (Napoli) C. Usai (Genova) A. Venditti (Roma) L. Zamai (Urbino) Segreteria Scientifica Società Italiana di Citometria c/o Unità Biologia delle Radiazioni e Salute dell'uomo ENEA Centro Ricerche Casaccia s.p. 016 Via Anguillarese, Roma tel fax Segreteria Organizzativa Italymeeting s.r.l. Via Parsano, 6/b Sorrento NA tel fax XXXIII CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014

7 QUOTE DI ISCRIZIONE Conferenza dopo il 31 maggio Soci GIC Senior** 280,00 330,00 Non strutt. Soci GIC Senior** 150,00 200,00 Soci GIC* 300,00 350,00 Non strutt. Soci GIC* 180,00 230,00 Non Soci GIC 320,00 370,00 Corso 40,00 Crediti formativi ECM 30,00 Le quote sono IVA esclusa *In regola con la quota associativa 2015 **iscritti da almeno 3 anni e in regola con le quote Coloro che intendono usufruire della quota ridotta per i giovani non strutturati dovranno inviare, insieme alla scheda di iscrizione, una autocertificazione vistata dal Responsabile della Struttura di appartenenza, che ne attesti la posizione. La quota include il volume degli Atti della Conferenza, il materiale congressuale, le colazioni di lavoro, le pause caffè e le attività previste dal programma sociale. I contributi scientifici saranno presentati sotto forma di relazioni su invito, comunicazioni orali e poster; gli abstract devono essere redatti in inglese e dovranno pervenire alla Segreteria GIC entro il 15 giugno. Gli abstract accettati saranno disponibili online nel sito Web di CYTOMETRY B. Saranno assegnati 4 Premi Poster GIC in diverse discipline. Nell ambito della Conferenza è prevista l annuale Assemblea Sociale GIC, la consegna dei Premi di Studio GIC e la presentazione di materiale e di apparecchiature da parte delle principali Aziende del settore. ACCREDITAMENTO E.C.M. per Corsi e Conferenza: Biologo, Medico, Chimico, Farmacista, Tecnico S.L.B. e Veterinario ELENCO/ALBO DEI CITOMETRISTI ESPERTI SESSIONE DI ESAMI 2015 Il GIC ha istituito un Albo per la figura professionale di Citometrista, suddiviso per specifici settori disciplinari. Si svolgerà una sessione di esami, martedì 22, riservato a Colleghi con una specifica e documentata esperienza professionale. Questa andrà dettagliata nella apposita scheda CV da allegare alla domanda d'iscrizione all'esame insieme al versamento di una quota associativa straordinaria di 25,00. Coloro che supereranno l'esame scritto potranno sostenere l'esame orale, il giorno seguente, nella stessa sede. L'esame si svolgerà solo se perverranno almeno 5 iscrizioni. CALENDARIO martedì 22 settembre Corsi di Aggiornamento Esame scritto Elenco/Albo Registrazione e allestimento dei poster Seminari introduttivi: Immunoematologia e Metodologie Analitiche Apertura Conferenza Lettura Magistrale mercoledì 23 settembre Sessione Plenaria Sessioni Parallele Sessione Poster giovedì 24 settembre Sessione Plenaria Sessioni Parallele Sessioni Parallele Sessione Poster Assemblea dei Soci venerdì 25 settembre Sessioni Parallele Sessione Plenaria PROGRAMMA SOCIALE PRELIMINARE martedì 22 settembre Registrazione con Caffè Brindisi di Benvenuto giovedì 24 settembre Degustazione Sapere i Sapori a Km 0 venerdì 25 settembree Sorteggio Premi scheda valutazione evento Colazione Speciale di saluto* Visita culturale* *è indispensabile la prenotazione alla Segreteria GIC con un messaggio entro il 1 settembre 2015 RIEPILOGO SCADENZE 31 maggio scheda iscrizione per quota ridotta 15 giugno scheda iscrizione e abstract per comunicazioni orali e poster 30 giugno scheda e CV per Esame scritto Elenco/Albo dei Citometristi 15 luglio prenotazione alberghiera 1 settembre prenotazione per le visite culturali Ulteriori informazioni ed aggiornamenti e le schede per l iscrizione, consultare il sito GIC: Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014 XXXIII CONFERENZA NAZIONALE DI CITOMETRIA 7

8 Elenco/Albo Citometristi GIC Esperti a che punto siamo? Sessione di esami 2015 scritto e orale Lucca settembre Lo avevamo annunciato ufficialmente a Lucca 2013 ( Qualifica di Citometrista su Lettere GIC Vol. 22 Num. 1 Aprile 2013) e abbiamo quasi terminato il Primo ciclo di esami di ammissione, con il Secondo che ripartirà nuovamente da Lucca fra pochi mesi, settembre p.v. con la nuova sessione di esami scritto e orale che svolgeremo, questa volta, negli stessi giorni. Ricordiamo (per i neo-soci) che il GIC si è fatto promotore di un percorso che intende riconoscere, a beneficio esclusivo dei propri iscritti, e su base volontaria, la figura professionale di Citometrista Esperto istituendo uno specifico Elenco, con le peculiarità di Albo; quindi, si è posto l obiettivo di riconoscere l eccellenza professionale del citometrista, la qualità delle analisi e delle applicazioni citometriche in Italia. Il GIC con questa iniziativa si pone anche l obiettivo di promuovere la formazione e l aggiornamento continuo dei Ricercatori e degli Operatori professionali di questa disciplina. In pratica è un invito, nell ambito delle proprie aree di competenza, ad attuare con correttezza e competenza la gestione degli specifici processi analitici in tutti i loro aspetti dalla preparazione del campione, alla misura, alla interpretazione dei risultati e alla loro refertazione. L Elenco/Albo, sarà caratterizzato da una struttura organizzativa nella quale saranno riconosciute figure con profili professionali, con diversi livelli e differenti aree applicative specialistiche. In pratica sarà articolato in due livelli professionali: Citometrista Esperto Livello Base Citometrista Esperto Livello Avanzato, entrambi articolati in specifiche aree di competenza ovvero nei quattro principali campi applicativi della citometria: ematologia, immunologia, ricerca e ambiente/microbiologia. Tornando al percorso, in realtà il Primo ciclo ha avuto inizio con la seduta di esami scritti ad Urbino, lo scorso settembre, e con le sessioni di esami orali di Napoli (svolta in febbraio) e di Milano e Roma (in marzo): avremo così i primi idonei ad essere iscritti all Elenco/Albo. Sebbene per una valutazione globale bisognerà attendere la conclusione dei lavori delle Commissioni, possiamo tentare una prima valutazione preliminare di come sta andando questa iniziativa GIC (che si è rivelata molto impegnativa dal punto di vista organizzativo) che ha visto un notevole interesse da parte dei Soci. I più giovani sono stati ovviamente i primi a volersi cimentare con un percorso di qualificazione, anche perché sono quelli che più sentono l esigenza di un riconoscimento che attesti le loro capacità professionali, in un contesto di precarietà del mondo del lavoro, mai così grave come quello che stiamo vivendo. Ci preme dire subito che sembra stia andando abbastanza bene e lo possiamo affermare sulla base dei risultati dello scritto di Urbino. Abbiamo avuto circa 50 iscritti suddivisi nelle diverse aree e possiamo dire che i risultati degli esami sono stati soddisfacenti con una discreta preparazione nel loro campo di attività professionale. Va però sottolineato che entrando nel merito dei quesiti inclusi nello scritto ed a quelli più frequentemente errati è emersa una carenza di fondo che se volessimo fare un paragone con l esame per la patente di guida potremmo affermare che i citometristi italiani guidano bene e magari conoscono anche il codice della strada, ma pochi sanno a cosa serve il carburatore.e come la Motorizzazione è inflessibile con il numero di quiz anche noi abbiamo cercato di esserlo! Si potrebbe infatti discutere che una buona analisi citometrica non richiede che l operatore conosca l ottica o i principi di base della fluorescenza, ma noi riteniamo che un esperto debba avere un bagaglio culturale che includa anche queste conoscenze di base. È dunque emerso (ma i primi segnali erano già stati evidenziati nei colloqui di idoneità) che molti giovani (ma non solo.) sono arrivati alla citometria partendo dalle applicazioni anziché dalle basi metodologiche/strumentali; e questo è ancor più evidente in ambito clinico (ematologia e immunologia) dove più routinarie sono appunto le applicazioni e minori le possibilità formative di tipo tecno/metodologico. E dunque come GIC ci sentiamo se non responsabili certamente sensibili a queste carenze di base e sarà nostro dovere ed impegno cercare di colmarle con adeguate iniziative formative. In realtà lo abbiamo sempre fatto in passato e potremmo dire che la formazione citometrica è parte del DNA del GIC, che infatti è nato agli albori della Citometria in Italia, proprio per divulgarne le applicazioni, ma sulla base di concrete conoscenze citometriche anche strumentali. Cogliamo quindi l occasione proprio a Lucca di tornare sui nostri passi per rilanciare una iniziativa formativa ovvero i Corsi pre-congressuali che in passato hanno fatto parte di una nostra tradizione radicata. Vorremmo poter soddisfare le esigenze di tutti (nel senso delle varie aree applicative) e dunque ne programmiamo tre, sui tre indirizzi immunologia, ematologia e ricerca (eventuali richieste di aggiornamento in ambito ambientale verranno accorpate al Corso ricerca ) in cui abbiamo anche strutturato il programma di Qualifica ; da quanto abbiamo riferito più sopra ci sembra che le lacune principali siano di base e su questa formazione di base vorremmo puntare, ma per rendere questo lavoro più mirato vorremmo il consenso di chi vi parteciperà. A questo scopo troverete nella Domanda di iscrizione una apposita opzione di preferenza (base o avanzato) che ci aiuterà a definire l impostazione finale dei Corsi in modo che i docenti designati sappiano quali sono le aspettative degli allievi con cui dovranno interagire. 8 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014

9 Flow cytometric analysis of circulating endothelial cells and endothelial progenitors for clinical purposes in oncology: urgent need for methodological standardization Marco Danova 1, Mariangela Manzoni 2, Giuditta Comolli 3, Martina Torchio 1, Giuliano Mazzini 4 1S.C. Medicina Interna ed Oncologia Medica, Ospedale Civile di Vigevano, A.O. Di Pavia, Vigevano (Pavia), Italy. 2S.C. Oncologia Medica, Ospedale Maggiore di Crema, Crema (Cremona), Italy. 3S.C. Microbiologia e Virologia, Laboratori Biotecnologie,IRCCS Fondazione S. Matteo, Pavia, Italy. 4Istituto di Genetica Molecolare, Consiglio Nazionale delle Ricerche, IGM-CNR, Pavia, Italy. - Abstract The possibility to quantify circulating endothelial cells (CECs) and endothelial progenitor cells (EPCs) represent a promising tool for monitoring the clinical outcome of tumors with the potential to assess the response to various treatments. The number of CECs and EPCs is very low and they cannot be identified using a single marker and often need to be discriminated by using a combination of antigens with different cell surface expression. Flow cytometric detection of CECs and EPCs in whole blood is the most commonly utilized method in clinical studies, but remains a technically challenging in that no standardized protocol for reproducible enumeration of these cells is available. In this review, we cover the most commonly utilized protocols to define CECs and EPCs by flow cytometry (FCM) in different oncological settings. For this purpose we have carefully evaluated the most significant clinical studies, published from 2008 to 2013 that utilized FCM for CEC and/or EPC detection in cancer patients. The multitude of flow cytometric methodologies applied, together with the heterogeneity of the patients enrolled in the different trials, greatly limits comparability of results. A lack of both a consensus on CEC and EPC phenotype and of an inter-laboratory standardized FCM assay has resulted in a great heterogeneity in the reported blood levels of CECs and EPCs. Consequently, inter-laboratory variability limits the interpretation of CEC/EPC potential to predict survival and / or response to therapy. Moreover, reproducibility in their quantification/characterization will only be achieved with careful inter-laboratory standardization of methodologies utilized. Riassunto La possibilità di quantificare le cellule endoteliali circolanti (CECs) e i progenitori endoteliali circolanti (EPCs) rappresenta uno strumento promettente per monitorare l outcome clinico dei tumori e per valutare la loro risposta a vari trattamenti. Il numero di CECs e di EPCs è molto basso e non sono identificabili con un solo marcatore ma solo mediante una combinazione di antigeni diversamente espressi sulla superficie delle cellule. La Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014 valutazione delle CECs e delle EPCs nel sangue periferico mediante la citometria a flusso (FCM) rappresenta la metodica più comunemente utilizzata negli studi clinici, pur rimanendo una sfida dal punto di vista tecnico, non esistendo ad oggi un protocollo standardizzato e riproducibile per la conta di queste cellule. In questo articolo, abbiamo considerato i protocolli citofluorimetrici per la definizione di CECs e EPCs più comunemente impiegati in diversi tipi di neoplasie solide ed in diversi setting di malattia, valutando gli studi più significativi tra quelli pubblicati tra il 2008 ed il Il numero di differenti metodologie basate sulla FCM, insieme all eterogeneità dei pazienti arruolati negli studi clinici, limita in modo significativo la comparabilità dei risultati. La mancanza di un consenso sulla definizione del fenotipo di CECs ed EPCs e su un unica procedura analitica sufficientemente standardizzata si traduce prima di tutto in una grande variabilità dei livelli di CECs ed EPCs basali riportati negli studi. La grande variabilità interlaboratorio limita fortemente l inter - pretazione di un potenziale valore delle CECs e delle EPCs nel predire la sopravvivenza e/o la risposta alla terapia. Una futura utilizzazione in ambito clinico di questi biomarkers potrà quindi essere raggiunta solo mediante programmi di standardizzazione delle metodologie utilizzate tra i differenti laboratori. Key words: biomarkers, circulating endothelial cells, endothelial progenitor cells, flow cytometry, solid tumors. Introduction Circulating endothelial cells (CECs) and endothelial progenitor cells (EPCs) have been indicated as potential surrogate biomarkers of angiogenesis in cancer and other diseases (1-3). Recent studies have demonstrated that the number of these cells the peripheral blood (PB) of cancer patients (pts) is altered by disease status and treatments, such as chemotherapy (CT) and anti-angiogenetic therapies. However, CECs and particularly EPCs represent a small and heterogeneous cell population in human blood and this makes a standardized and repro- ATTIVITÀ SCIENTIFICA 9

10 ducible approach for their monitoring technically challenging (4). In addition, despite extensive research, there is still debate about EPC defining markers. The focus of most studies in humans has been on the expression of stem cell markers such as cluster differentiation (CD) 34 or CD133 and endothelial antigens (Ags) such as CD31 or the kinase-insert domain (KDR), or type 2 vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR-2). Flow cytometry (FCM) is the most widely utilized method for rare event analysis such as CEC and EPC quantification since it has the advantage of simultaneous determination of stem and endothelial markers in a multiparametric approach and is at the same time, a quantitative method (5,6). With expanding interest in the field of clinical applications for CEC and EPC quantification, the development of standardized protocols for analysis is mandatory. To date, a large variety of flow cytometric methods to detect CECs and EPCs in pts with solid tumors have been utilized, based on different combinations of surface markers, sample-handling and staining protocols, gating strategies and data analysis programs (6). We conducted an extensive review of the scientific literature, in particular a Medline search using the the terms: CECs, EPCs, FCM, biomarkers and clinical oncology. Here we report the more important methodological findings reported in the literature which have contributed to the different results observed across various studies. Flow cytometry protocols for the study of CEC and EPC quantification in Clinical Oncology Considering the methodologies described from 2008 to 2013 in various tumor types, the published papers were analysed for the flow cytometric approach and the baseline values for CECs and EPCs reported (Table 1) as well as for the panel of endothelial markers utilized (Table 2), with the aim of emphasizing the pre-analytical and analyt- Table 1: Methodological differences and results among different FCM-based studies of CECs and EPCs in solid tumors (FCM= flow cytometry; CECs=circulating endothelial cells; EPCs= endothelial progenitor cells; PB= peripheral blood; pts= patients; WBC= white blood cell; nr= number; n.a.= not assessed; ml= milliliter; µl= microliter; MNCs= mononuclear cells; PBMNCs= peripheral blood mononuclear cells; not reported= data no reported or mentioned within the study). 10 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014

11 Table 2: Immuno phe - notype of EPCs utilized in various clinical studies (CD= cluster differen - tiation; VEGFR= va scu - lar endothelial growth factor receptor; n.a.= not assessed; not reported= data no reported or mentioned within the study). ical factors that should be carefully taken into account when quantifying CECs and EPCs for clinical purposes. Breast cancer (7) - Venous PB, from pts with advanced disease, 10 milliliters (ml) was collected in ethylenediamine-tetra-acetic acid (EDTA)-containing tubes. The PB mononuclear cell (MNC) layer was isolated using Ficoll density-gradient centrifugation within 12 hours of blood collection. MNCs were then labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC-conjugated anti-cd14 (BD Pharmingen, San Jose, CA), phycoerythrin (PE)-conjugated anti-cd146 (BD Pharmingen, San Jose, CA) or PE-conjugated anti-cd133 (Milteny Biotec, Auburn, CA) with FITC-conjugated anti-vegfr2 (BD Pharmingen, San Jose, CA). The frequency of circulating EPCs was determined by measuring of cells co-expressing CD133 and VEGFR2 after gating for CD14-positive Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014 cells. Analysis was performed using a Beckman Coulter (Fullerton, CA) flow cytometer and data were analyzed using associated software. Results were reported as number of EPCs per 5 million MNCs. Head and Neck cancer (8) - Blood samples were taken via venipuncture using a 6 ml EDTA tube. FACS analysis was carried out within three hours. Two hundreds microliters (µl) blood containing EDTA were used per sample. To avoid unspecific binding via Fc-receptors, samples were incubated with 10 µl FcR-blocking reagent (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) for 15 minutes at room temperature (RT). Next, the cells were incubated with fluorochrome-labeled mononuclear antihuman mouse antibodies or appropriate isotype controls for 20 minutes at RT. CEC: 40 µl CD31-FITC (Becton Dickinson, Biosciences, NJ), 5 µl CD146-PE (Becton ATTIVITÀ SCIENTIFICA 11

12 Dickinson), 20 µl CD45-peridinincyanine (PeCy)5 (Becton Dickinson) and 5 µl 7-aminoactinomicin (ADD) (Becton Dickinson, Biosciences). EPC: 2 µl KDR-Biotin (Abcam, Cambridge, UK), 20 µl CD133-PE (Miltenyi Biotec), 5 µl 7ADD (Becton Dickinson, Biosciences) and 10 µl of CD3, CD33 and CD19-PE-Cy5 (Becton Dickinson). Mature CECs were defined as negative for the haematopoietic marker CD45 and positive for the endothelial markers CD146 (P1H12) and CD31. EPCs were defined as positive for CD133 and VEGFR-2 and negative for the lymphocyte markers CD3, CD19. Dead cells were excluded by the use of 7-ADD. CECs and EPCs were expressed as number of events identified as CECs or EPCs per analyzed events. Breast cancer (9) - Peripheral blood samples were collected using 4 ml Vacutainer tubes containing sodium citrate (3.2%). From these samples, 50 µl of anticoagulated blood was aliquoted for analysis of monocyte activation, and 3 ml was aliquoted for analysis of CECs. All samples were stored at RT and processed within three hours. For the CEC analysis, normal donor blood spiked with human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) at approximate equivalent numbers (50:50 mixture) per leukocyte count was used as a positive control for all experiments. In preparation for the analysis of CECs, samples were first enriched using a negative selection/depletion strategy. Anticoagulated blood samples (3 ml) were transferred to 4 ml Vacutainer cell preparation tubes (CPT) (Becton Dickinson, BioSciences Canada, Mississauga, ON). These tubes contain a citrate anticoagulant with a Ficoll Hypaque (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany) density fluid and a polyester gel barrier which permits one-step separation of mononuclear cells from whole blood via centrifugation. In addition, 50 ml of Rosette Sep1 Human CD45 depletion cocktail (StemCellTechno - logies, Vancouver, BC) was added to samples before centrifugation, incubated for 20 minutes at RT, and then centrifuged at 1,700g for 30 minutes with the brake off in order to produce an enriched sample of nucleated cells depleted of CD451 leukocytes. This cell layer was collected, washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and re-suspended in 100 ml of PBS 1 1% bovine serum albumin 1 mm-edta. Samples were stained with 10 µl of anti-human PE-CD146 (clonep1h12; BD Biosciences) and 10 µl of antihuman FITC-CD45 (Beckman Coulter, Fullerton CA) at RT for 15 minutes in the dark. Samples were then washed, fixed, and permeabilized with the Intra- Prep Fix/Perm Kit (Beckman Coulter), re-suspended in 500 µl of propidium iodide (PI) (Beckman Coulter), and incubated for 45 minutes before flow cytometric analysis. A four color XL-MCL (Beckman Coulter) was configured to detect the FITC-CD45 signalling FL1 (525 nanometers, nm, band pass filter), PE-CD146 in FL2 (575 nm band pass filter), and PI FL3 (625 nm band pass filter). Flow cytometric data collection was standardized by using a 600 events acquisition time for each sample. Flow rates were kept below 350 events/second to minimize the effect of coincidence events, and two wash cycles with distilled water were processed through the flow cytometer between each sample to minimize cell carry over between samples. Events which were CD146-positive, CD45-negative were considered to be CEC events; they were expressed as number of events considered CECs per 600 detected events. Various solid tumors (10,11) - The first 3 ml of PB (potentially contaminated with endothelial cells from the venipuncture) were discarded and pts bearing catheters were excluded from the study. Blood was collected in cell processing tubes (Becton Dickinson) containing sodium citrate and Ficoll. Within two hours, tubes were centrifuged at RT for 25 minutes at 1,600 g. The MNCs were transferred to a cryotube and an equal volume of freezing medium (RPMI 1640 with 20% DMSO for a final 10% concentration) was added to the cell suspension. Samples underwent a controlled freeze using an isopropanol bath in a -80 C freezer. Samples were then stored in liquid nitrogen until the day of shipping, in abundant dry ice and always took <7 days. After shipping, the tubes were kept in liquid nitrogen up to the day of thawing, which was performed by washing the cells using the same storage medium. Samples were enumerated within 60 minutes after thawing. CECs and EPCs were evaluated by six-color FCM using the nuclear stain Syto16 and 7-AAD and a panel of MoAbs including anti-cd45 (to exclude hematopoietic cells), anti- CD133, anti-cd31, and anti-cd146. Cell suspensions were evaluated after red cell lysis by a FACSCanto (Becton Dickinson). After acquisition of at least 1 x 10 6 cells per blood sample, analyses were considered informative when an adequate number of cells (>100, typically ) was collected in the CEC enumeration gates. CECs were defined as DNA (Syto16)-positive, negative for the hematopoietic marker CD45, positive for the endothelial markers CD31 and CD146, and negative for the progenitor marker CD133. EPCs were identified by the expression of CD133. The combination of Syto16 and 7-AAD was used to gain insight into CEC viability. Necrotic cells were identified as Syto16low/7-AAD+, apoptotic cells as Syto16low/7-AAD-, and viable cells as Syto16-bright / 7-AAD-negative. To assess and validate the reproducibility of the procedure, in three separate series of studies, a fresh and a frozen/thawed sample were evaluated in triplicate by the same operator (for the analysis of intra-reader variability) and by three different operators (for the analysis of inter-reader variability). For the evaluation of variability over time, fresh samples were evaluated on the same day of collection and after 24, 48, and 72 hours; frozen samples were thawed and investigated after 0, 2, 7, and 14 days of storage in liquid nitrogen. Finally, duplicate frozen samples were sent from Houston to Milan and read in duplicate (evaluated by two different laboratories, which were blinded to each other s results) in the two laboratories after > 6 months 12 ATTIVITÀ SCIENTIFICA Lettere GIC Vol. 23, Num. 3 - Dicembre 2014

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