La metodologia C.E.D.I.A.: affidabilità, precisione, robustezza

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Maddalena Carli
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1 La metodologia C.E.D.I.A.: affidabilità, precisione, robustezza Nella Cattai Laboratorio di Sanità Pubblica ASL Lecco Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA C loned E nzyme D onor I mmuno A ssay 1

2 Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA I dosaggi CEDIA utilizzano la tecnologia del DNA ricombinante per produrre un sistema di immunodosaggio altamente specifico Il metodo si basa sul frazionamento dell enzima batterico ß-galattosidasi, in due frammenti inattivi chiamati Enzima Accettore (EA) ed Enzima Donatore (ED) Enzima Accettore DNA ricombinante Riassociazione Enzima Donatore ß-Galattosidasi Enzima Attivo Ricombinato Frammenti Inattivi Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA Enzima donatore ED Enzima accettore EA Enzima Attivo Ricombinato I due frammenti (enzima accettore ed enzima donatore) si riassociano spontaneamente per formare un enzima attivo in grado di scindere un substrato, dando così luogo ad una reazione colorimetrica misurabile spettrofotometricamente 2

ß-Galattosidasi Enzima Attivo Ricombinato Frammenti Inattivi Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA Enzima donatore ED Enzima accettore EA Enzima Attivo Ricombinato I due frammenti

3 Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA I reagenti utilizzati per il dosaggio delle droghe d abuso con metodo CEDIA sono composti da : Reagente 1 contenente l enzima accettore la sostanza da ricercare e l anticorpo specifico per Reagente 2 contenente l enzima donatore da ricercare ed il composto colorante (rosso di clorofenolo-b-d-galattopiranoside) coniugato alla sostanza Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA Nella miscela di reazione si verranno a trovare quindi i seguenti componenti R1 Sostanza da ricercare nel materiale biologico R2 Reazione negativa : ΔA basso Reazione positiva : ΔA alto 3

colorante (rosso di clorofenolo-b-d-galattopiranoside) coniugato alla sostanza Metodologia immunoenzimatica in fase omogenea CEDIA Nella miscela di reazione

4 Vantaggi metodologici I vantaggi della linea CEDIA oltre agli aspetti operativi quali il consolidamento su analizzatori multiparametrici di routine, riguardano anche la qualità del risultato I test CEDIA presentano infatti una maggiore separazione tra il calibratore negativo, il cut-off e gli altri calibratori in termini di Δ di assorbanza rispetto a tutti gli altri metodi ed in particolare nei confronti dei metodi EMIT ed al lattice Ciò permette una maggiore precisione nella valutazione dei risultati a prescindere dalla variabilità strumentale Campioni con valori vicini al limite di cut-off sono quindi maggiormente discriminabili ed il rischio di falsi negativi o falsi positivi viene minimizzato Esempio di curva di taratura 4

altri metodi ed in particolare nei confronti dei metodi EMIT ed al lattice Ciò permette una maggiore precisione nella valutazione dei risultati a prescindere dalla variabilità

5 Menu Droghe d Abuso Barbiturati Benzodiazepine HS Buprenorfina Cocaina Metaboliti Metadone (EDDP) Metadone Oppiacei Fenilciclidina Propossifene Cannabinoidi 6-AM Amfetamine/ Ecstasy Sample Check Due livelli di cut off disponibili Le applicazioni per entrambi i valori di cut off sono validate Sono disponibili due livelli di cut off per i seguenti test Cutoff Primario (ng/ml) Amf/Ecstasy 1000 Barbiturici 300 Benzodiazepine 300 Cocaina 300 Oppiacei 2000 THC 50 Cutoff Secondario (ng/ml) Amf/Ecstasy 500 Barbiturici 200 Benzodiazepine 200 Cocaina 150 Oppiacei 300 THC 25 5

cut off sono validate Sono disponibili due livelli di cut off per i seguenti test Cutoff Primario (ng/ml) Amf/Ecstasy 1000 Barbiturici 300

6 COMPARAZIONE RANGE DI LINEARITA PRECISIONE Intra-Serie 6

7 BENZODIAZEPINE HS Altissima sensibilità e rilevazione dei metaboliti glucuronidati EDDP Nessuna cross-reattività con metadone COCAINA Alta sensibilità per cocaina e cocaetilene OPPIACEI Alta sensibilità per i metaboliti glucuronidati TEST ANTIADULTERAZIONE Ottima specificità per i dosaggi CEDIA su sostanze adulteranti 7

sensibilità per cocaina e cocaetilene OPPIACEI Alta sensibilità per i metaboliti

8 Benzodiazepina HS Benzodiazepina HS Aggiungere una determinata quantità dell enzima β-glucuronidasi al reagente R1 Porre nello strumento e procedere all analisi normalmente con la metodica delle Benzodiazepine 8

reagente R1 Porre nello strumento e procedere all

9 Misurato come 7-NH2-Clonazepam In rosso valori < 200 ng/ml 9

10 Metabolita primario del metadone La ratio metadone/eddp nelle urine dei pazienti è tipicamente 1:1 o 2:1 Identifica i Fast metabolizers Identifica gli adulteratori 10

11 11

12 1. Il problema: i test per il dosaggio degli oppiacei attualmente in commercio non sono specifici per l abuso di eroina 2. Essi rilevano: farmaci sedativi per la tosse (codeina,idrocodone) Morfina da semi di papavero 3. Soluzione SAMHSA Alzare il cut-off a ng/ml Confermare tutti i campioni positivi al test degli oppiacei con il 6-AM 4. Soluzione CEDIA sviluppare un test specifico per il 6-monoacetil morfina (6-AM) ad alta sensibilità (10 ng/ml) Risultati su screening* di ottanta campioni : 74 campioni positivi per 6-AM con la GC/MS (20 ng/ ml) sono risultati positivi per 6-AM con CEDIA 6 campioni negativi per 6-AM con la GC/MS sono risultati negativi per 6-AM con CEDIA 3 dei campioni negativi con la GC/MS sono risultati positivi con il 6-AM CEDIA ma sono risultati inferiori al cutoff * Fonte Polizia Americana 12

000 ng/ml Confermare tutti i campioni positivi al test degli oppiacei con il 6-AM 4.

13 Following heroin administration, 6-AM was excreted rapidly with an average half-life of 0.6 h. This resulted in a very short detection time for 6-AM with a range of 2-8 h at the most sensitive cutoff limit. This short detection time limits the usefulness of 6-AM as a marker for identification of heroin abusers to a period immediately after drug use. In contrast, free morphine and total morphine were detectable up to approximately 24 h after heroin administration. The average half-life for free morphine was 3.6 h and for total morphine was 7.9 h. After morphine and codeine administration, no 6-AM was detected by GC/MS above the 0.81-ng/mL detection limit of the assay. It is concluded that the presence of 6-AM in urine can be interpreted with confidence to mean that heroin, or 6-AM, was administered within 24 h of specimen collection and that the presence of 6-AM in urine is not caused by morphine or codeine administration Forensic drug testing for opiates: I. Detection of 6-acetylmorphine in urine as an indicator of recent heroin exposure; drug and assay considerations and detection times. Cone EJ, Welch P, Mitchell JM, Paul BD. H O O O N C H 3 H 3 C O Identifica solamente i campioni positivi per l abuso di eroina e non quelli influenzati da alte concentrazioni di altri oppiacei Limitato range di linearità - 20 ng/ml Può non rilevare alte concentrazioni degli altri oppiacei che, comunque sono evidenziabili con il kit specifico 13

This short detection time limits the usefulness of 6-AM as a marker for identification of heroin abusers to a period immediately after drug use.

14 Oppioide semisintetico derivante dalla Tebaina Agonista e antagonista Attività farmacologica inferiore a quella della morfina Blocca i recettori così che altre droghe non possano essere ulteriormente attive Metabolismo NON viene assorbita dal tratto gastrointestinale Elevata liposolubilità / lunga durata d azione Forte legame con le proteine tissutali / lunga durata d azione Programma Dosaggio semplice Assunzione ogni 2 / 3 giorni Vantaggi Buona sensibilità a cut off 5 ng/ml Buona precisione intra day Limite di rilevabilità a 1,77 ng/ml Ripetibilità dei dati di calibrazione 14

/ lunga durata d azione Forte legame con le proteine tissutali / lunga durata d azione Programma Dosaggio semplice Assunzione ogni 2 / 3 giorni

15 Il test Anti Adulterazione è un test con metodologia CEDIA con un coniugato sensibile che è in grado di rilevare sostanze che : Interferiscono con la reazione di complementazione Interferiscono con la reazione del substrato Distruggono i componenti del kit (EA, coniugato, substrato) Innovazione tecnologica (tecnica del DNA ricombinante) Alta sensibilità analitica Ampi range di curva di taratura Elevata stabilità dei reagenti (mediamente 60 gg. dopo ricostituzione) Differenti possibilità di scelta dei calibratori e definizione del cut-off Ripetibilità dei risultati tra lotti differenti Minima % di cross reattività Possibilità di scelta tra il dosaggio qualitativo e semiquantitativo Applicazioni e prestazioni consolidate su strumentazione Beckman Coulter serie AU 15

di taratura Elevata stabilità dei reagenti (mediamente 60 gg.

16 Reagenti da ricostituire Rgt 1= reagente liofilo R1 (EA&Ab) Rgt 1a = tampone di ricostituzione R1 Rgt 2 = reagente liofilo R2 (ED & CPRG) Rgt 2a = tampone di ricostituzione R2 PERCHE CEDIA e Beckman Coulter AU AFFIDABILITA STRUMENTALE PRECISIONE FLESSIBILITA CUVETTE DI LETTURA IN VETRO OTTICO SISTEMA DI LAVAGGIO EFFICIENTE LINEARITA FOTOMETRICA MICROVOLUMI DI ANALISI 16

R2 PERCHE CEDIA e Beckman Coulter AU AFFIDABILITA STRUMENTALE PRECISIONE FLESSIBILITA

17 Conclusioni La tecnologia CEDIA rappresenta oggi la più solida ed affidabile soluzione integrata per il dosaggio delle droghe d abuso in random access I vantaggi del sistema CEDIA uniti all alta tecnologia proposta dalla piattaforma analitica Beckman Coulter serie AU, garantiscono la soluzione ottimale per lo screening delle Droghe d Abuso di primo livello La proposta attuale comprensiva di dosaggi esclusivi ed il continuo sviluppo di nuovi prodotti garantiscono continuità nel campo dei dosaggi delle Droghe d Abuso in funzione delle continue evoluzioni determinate dall introduzione di nuove sostanze 17

per lo screening delle Droghe d Abuso di primo livello La proposta attuale comprensiva di dosaggi esclusivi ed il continuo sviluppo di nuovi prodotti

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