Imparare dagli errori: metodi scientifici senza l'utilizzo di animali nella ricerca medica e nelle prove di tossicità. Dott.

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1 Imparare dagli errori: metodi scientifici senza l'utilizzo di animali nella ricerca medica e nelle prove di tossicità Dott.ssa Lidia Armati

2 Imparare dai disastri: Talidomide (10000 focomelici), TGN1412, Vioxx... REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals): Regolamento (CE) n. 1907/2006 Principio delle 3 R: Replacement, Refinement, Reduction L'importanza di studiare cellule e tessuti umani La sperimentazione animale non è mai stata validata, i metodi scientifici alternativi sì: centro europeo ECVAM (Ispra, Italia) testa le varie tecniche per valutare se sono ripetibili, affidabili, scientifiche Molti metodi alternativi hanno già portato ad avere intuizioni scientifiche poi confermate (es. biopsie, autopsie, epidemiologia), altri sono innovativi e promettenti.

3 Colture cellulari Le colture cellulari mantengono in vitro molte delle loro caratteristiche in vivo: le cellule miocardiche si contraggono e rispondono aumentando o diminuendo la frequenza delle contrazioni in seguito all aggiunta di determinati farmaci (feedback) le cellule endocrine secernono in vitro gli ormoni e rispondono alle diverse condizioni ambientali aumentando o riducendo la secrezione (per es. cellule di paratiroide rispondono alla presenza di calcio)

4 Test di Ames Per testare se un composto è in grado di creare mutazioni Ceppi mutati di salmonella (un batterio) che non possono più sintetizzare l'amminoacido istidina, necessario per la loro crescita Viene aggiunta la sostanza da testare: se è mutagena, il batterio riesce nuovamente a produrre istidina e cresce a dismisura

5 Test del micronucleo Osservazione al microscopio di cellule in mitosi (che si stanno dividendo per riprodursi) precedentemente colorate con metodiche particolari. A contatto con la sostanza da testare: se questa è capace di provocare mutazioni si verificano errori nella replicazione cellulare e oltre al nucleo saranno visibili dei frammenti di DNA nel citoplasma, i cosiddetti micronuclei.

6 Test della cometa (elettroforesi su singola cellula) Si valuta la presenza di mutazioni cromosomiche: le membrane cellulari vengono lisate tramite un apposito detergente perchè sia esposto il materiale genico, il vetrino con le cellule viene poi posto nella vasca dell'elettroforesi e viene aggiunta una sostanza fluorescente che si lega al DNA e rende visibile il nucleo al microscopio a fluorescenza. L'elettroforesi è costituita da un gel immerso in un campo elettrico: la sostanza in esame si divide nelle sue componenti secondo la massa e la carica, dato che ogni componente migra sul gel verso la polarità opposta alla propria, dalla quale è attratta. Se il DNA testato non ha mutazioni, al microscopio sarà visibile un'unica formazione rotonda compatta, viceversa alcuni frammenti di DNA spezzati dalla mutazione tenderanno a rimanere più distanti dal resto del materiale genetico, formando una struttura che somiglia alla coda di una cometa.

7 Elettroforesi su gel, per il test della cometa

8 Test della cometa

9 Test della cometa

10 Biomarkers Addotti del DNA: composti generati dalla modifica del DNA a seguito di una sua interazione con composti chimici = indicatori, biomarcatori, di esposizione ad un agente cancerogeno, in grado di modificare il DNA. Questi addotti possono essere visti con metodi immunoenzimatici. Le monoossigenasi sono enzimi che hanno il compito di ossidare certi composti grassi (pesticidi, idrocarburi...) per renderli più solubili e quindi eliminabili. Questi enzimi sono inducibili, ovvero aumentano quando nell'ambiente sono presenti le sostanze tossiche. Il loro aumento è quindi un segno indiretto di tossicità del composto. Le metallotioneine sono proteine citoplasmatiche che legano i metalli pesanti e anche queste aumentano di numero se sono presenti metalli pesanti.

11 Biomarkers Le proteine da shock termico sono altre proteine citoplasmatiche sintetizzate in risposta a certe situazioni pericolose come la febbre, l'infiammazione, la carenza di zucchero, il cancro e molte altre, quindi un loro aumento segnala una situazione d'allarme per il sistema biologico. Ci sono poi proteine, come le esterasi, che sono inibite da composti come gli insetticidi, rivelando così la loro presenza I lisosomi, organuli citoplasmatici, sono degli spazzini che digeriscono molecole che la cellula deve eliminare: quando entrano in contatto con sostanze esterne, queste destabilizzano la membrana dei lisosomi, i quali accumulano per ossidazione le lipofuscine (grassi), che possono essere misurate e messe in relazione alla quantità di elementi tossici presenti.

12 Toxcast: robot che in 2 giorni testa la tossicità di composti su cellule e proteine umane, mentre nell animale servirebbero anni

13 Corrositex : al posto del Draize test, che testava la sostanza sull occhio del coniglio (che non ha ghiandole lacrimali e possiede 3 palpebre, diversamente dall'uomo):

14 Skimune : Prevede la risposta immunitaria (es. allergia) della cute umana ad un nuovo composto chimico: misura la proliferazione di linfociti T e il rilascio di citochine (mediatori dell'infiammazione) mettendo in contatto sangue umano, frammenti di cute umana e il composto da testare. Svela anche la tossicità di composti non rilevata da studi su animali.

15 MIMIC (Modular IMmune In vitro Construct) Monociti di vari donatori (+ rappresentativi) in soluz. nutritiva passano lo strato di endotelio fino al collagene sottostante, si differenziano in cellule presentanti l'antigene, di cui i macrofagi restano nel collagene, le cellule dendritiche tornano in alto, vengono cimentate con antigeni, poi con linfociti T e B per creare cellule della memoria (vaccini).

16 Colture cellulari 3D Biologia + nanotecnologie, stampanti 3D

17 Organi artificiali molto promettenti per la medicina dei trapianti e per riprodurre l effetto di una malattia su un organo, es. Virtual Liver

18 Body on a chip: polmone e cuore finanziato dal Dipartimento della difesa USA con 24 milioni di dollari

19 Body on a chip: rene e arterie

20 Simulatore polmone umano Simulatore metabolico respiratorio realizzato dalla NASA per testare le condizioni dei polmoni in situazioni avverse, con la possibilità di introdurre farmaci nel sistema, cambiare parametri come la frequenza respiratoria e valutare le conseguenze.