Diss; ETH )(3. Cloning of DRAL, a novel LIM domain protein down-regulated in. embryonal rhabdomyosarcoma cells. Dipl.

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1 Diss; ETH )(3 Diss. ETH No Isolation and characterization of candidate tumor suppressor genes. Cloning of DRAL, a novel LIM domain protein down-regulated in embryonal rhabdomyosarcoma cells a dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences Presented by Michele Genini Dipl. Sci. Nat. ETH born April 17,1967 citizen of Cresciano, TI Accepted on the recommendation of Prof. Dr. J. C. Perriard Dr. B. W. Schafer Prof. Dr. H. M. Eppenberger 1995

2 1 SUMMARY Tumor cells derive from normal cells that loose their tight proliferation and differentiation control mechanisms resulting in progression toward the neoplastic phenotype. The understanding of the molecular mechanisms causing impaired growth control is one of the major challenge of cancer research. Two classes of genes have been found to cooperate in the regulation of growth and development of normal cells. The first discovered molecules involved in these processes were the oncogenes, which are positive regulators of cell proliferation. On the other hand, the tumor suppressor genes negatively regulate cell proliferation. Any alteration of oncogenes or tumor suppressor genes can trigger the induction of cancer. The aim of our study was to identify molecules which might be involved in the negative regulation of cellular proliferation. In particular, our attention was focussed on aspects of tumor suppression and related molecules. For this purpose, as experimental system, we used an embryonal rhabdomyosarcoma (erms) cell line. erms is a muscle cell derived tumor and represent a suitable system to study tumor suppression since its development has been implicated to involve a consistent loss of genetic information on chromosome 11, suggesting the existence of a tumor suppressor gene. Two experimental approaches were used to identify novel candidate tumor suppressor genes. First, we introduced a normal chromosome 11 via microcell mediated transfer into erms cells with the aim to induce tumor suppression. Six different microcell hybrids (MCH) were obtained. After injection of the MCH into nude mice, one of them showed reduced ability in tumor formation. However, analysis of this MCH using microsatellite DNA analysis and whole chromosome 11 painting revealed that the delayed phenotype was unrelated to the additional normal chromosome. This experiment did not provide any evidence for the existence of a tumor suppressor gene on chromosome 11. Therefore, as second approach to identify novel candidate tumor suppressor genes, we performed a subtractive hybridization experiment between human primary myoblasts and erms cells to isolate genes expressed exclusively in normal cells. A modified protocol from a published subtractive hybridization procedure allowed to isolate a high number of clones differentially expressed between the two cells. These clones were divided in two classes, one containing molecules of known sequence, the other with molecules of unknown sequence. The expression pattern in additional normal and tumorigenic cells of cdnas belonging to the first class were analyzed using Northern blots. This allowed to identify several molecules which might be designated as candidate tumor suppressor genes in virtue of their consistent differential expression among the cells tested. Furthermore, a clone with unknown

3 2 sequence showing particular strong differential expression between erms and human primary myoblasts was chosen as probe for screening a myoblast cdna library to obtain its full length cdna clone. The novel isolated cdna encodes a protein belonging to the family of LIM domain proteins and was named DRAL. DRAL contains four complete LIM domains and a truncated domain at the N-terminus of the protein. It shows a consistent differential expression in additional normal and tumor cells, which makes it an interesting candidate as tumor suppressor gene. In addition, its localization in the nucleus and the fact that LIM domain proteins have been found to interact with basic helix-loop-helix proteins might indicate its involvement in the pathway to normal muscle cell differentiation. In conclusion, the subtractive hybridization experiment resulted in the generation of a wide catalogue of molecules differentially expressed between normal and tumorigenic cells. Among them several can be regarded as candidate tumor suppressor genes. Functional studies of these candidate tumor suppressor genes on cell growth and differentiation will give new insights in the mechanisms leading to tumorigenesis.

4 3 RIASSUNTO Le cellule tumorali derivano da cellule normali i cui meccanismi di controllo della proliferazione e della differenziazione sono danneggiati. Una delle maggiori sfide della ricerca sul cancro 6 la comprensione dei meccanismi molecolari che impediscono un normale funzionamento delle cellule. Negli ultimi anni, con l'avvento della biologia molecolare, e stato possibile identificare due famiglie di geni, i cui prodotti cooperano nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare. Dapprima sono stati scoperti gli oncogeni, i quali regolano positivamente la crescita delle cellule. Successivamente sono stati identificati i geni oncosoppressori, antagonisti funzionali degli oncogeni, i quali inibiscono la proliferazione cellulare. Qualsiasi alterazione degli oncogeni o dei geni oncosoppressori pud generare una cellula neoplastica. Lo scopo di questo studio e quello di identificare geni coinvolti nella regolazione negativa della proliferazione cellulare. In particolare, il nostra interesse era rivolto verso gli aspetti molecolari coinvolti nella soppressione dei tumori. Per raggiungere questo scopo abbiamo utilizzato una linea cellulare di rabdomiosarcoma embrionale. II rabdomiosarcoma embrionale e un tumore che si sviluppa da cellule muscolari ed e un ottimo modello per studiare eventi in relazione alia soppressione di tumori. 6 stato infatti dimostrato che 1'insorgenza di questo tumore implica una perdita di informazione genetica dal cromosoma 11, fatto che suggerisce l'esistenza di un gene oncosoppressore. Per identificare nuovi geni coinvolti nei complessi meccanismi della normale regolazione cellulare sono stati usati due differenti approcci sperimentali. II primo consiste neu'introdurre un cromosoma 11 aggiuntivo nelle cellule tumorali, attraverso un trasferimento mediato da microcellule, al fine di causare una inibizione nella crescita. Abbiamo cosi ottenuto sei differenti ibridi microcellulari, la cui tumorigenicita e stata analizzata mediante iniezione subcutanea in topi nudi. Uno degli ibridi ha mostrato un notevole rallentamento nella formazione di tumori. Un'accurata analisi citogenetica e molecolare di questo ibrido ha perd dimostrato che questo rallentamento e indipendente dal cromosoma 11 aggiuntivo. Questo esperimento non ha quindi fornito nessuna prova dell'esistenza di un gene oncosoppressore su questo cromosoma. II secondo approccio sperimentale consiste in un'ibridizzazione sottrattiva tra mioblasti primari e cellule di rabdomiosarcoma embrionale. Questa tecnica permette di isolare geni espressi esclusivamente in un tipo di cellula, nel nostro caso specifico nelle cellule normali. La modifica di una procedura pubblicata in precedenza ha permesso di isolare un elevato numero di cloni espressi differenzialmente tra le due cellule. I cloni sono stati suddivisi in due gruppi, il primo comprendente molecole la cui sequenza era gia conosciuta, la seconda comprendente molecole la cui sequenza non era conosciuta.

5 4 L'analisi dell'espressione di geni appartenenti al primo gruppo in varie cellule tumorali e non ha permesso di identificare alcuni geni potenzialmente oncosoppressori. Un clone appartenente al secondo gruppo (sequenza sconosciuta), che aveva mostrato un'elevata differenza di espressione tra cellule normali e tumorali, e stato usato quale sonda per lo screening di una banca di cdna derivato da mioblasti primari. Questo metodo ci ha permesso di clonare la sua sequenza completa, che codifica per una proteina appartenente alia famiglia delle proteine con regione LIM. Questo nuovo gene, chiamato DRAL, contiene quattro regioni LIM complete e una regione LIM troncata nella parte N-terminale della proteina. Esso presenta un notevole livello di espressione differenziale in varie cellule tumorali e normali, rendendolo un interessante candidato quale gene oncosoppressore. La sua localizzazione nel nucleo e il fatto che e" stato dimostrato che le proteine contenenti regioni LIM interagiscono con proteine contenenti regioni basic helix-loop-helix, potrebbe essere un indizio del coinvolgimento di DRAL nel controllo della differenziazione delle cellule muscolari. In conclusione, l'ibridizzazione sottrattiva ha permesso di identificare un gran numero di molecole che sono espresse differenzialmente nelle cellule normali e tumorali. Alcune di queste molecole possono essere considerate come possibili geni oncosoppressori. Studi sugli effetti di questi geni potenzialmente oncosoppressori sulla crescita e differenziazione cellulare permetteranno di capire meglio i meccanismi che portano alia genesi dei tumori.