Terapia Cellulare Non Trapiantologica In Ematologia ed Oncologia.
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1 Terapia Cellulare Non Trapiantologica In Ematologia ed Oncologia
2 Possibile Definizione Terapia Cellulare: Trattamento che prevede la ricostituzione, l aumento di numero o di efficacia di una funzione biologica ottenuto mediante l impiego di popolazioni cellulari.
3 Terapia Cellulare Terapia Cellulare Correlata a Procedura Trapiantologica Trapianto di Celulle Staminali Ematopoietiche Allogeniche Donor Lymphocites Infusion,,,, Allo-EBV-CTL nel trattamento delle Post Tramplant Lymphoprolipherative Disorders (PTLD) in pz sottoposti a BMT; AutoEBV-CTL nelle PTLD post SOT Utilizzo di CTLp anti-leucemia (LAM) Terapia Cellulare anti-infettiva CTL anti CMV, BK e Aspergillo APC artificiali (CD3+/CD28+ beads) nel contesto di Auto-TMO (NHL, CML, MM)
4 Terapia Cellulare non Trapiantologica Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata Ripopolazione Adottiva (T cell) T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK) Ottimizzazione della presentazione dell antigene Aumento antigen up-take e processing Modulazione della maturazione delle DCs Fornire co-stimulazione Antige discovery e modificazione dei peptidi per incrementare la loro avidità Manipolazione della risposta immune Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15) Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione (es:. α-tgf-β, α-il-10, T Reg /CD4+25+) Terapia Genica
5 La storia dell immunoterapia M. Burnet e L. Thomas nel 1957 proposero il concetto di Cancer Immunesurveilance Le prime prove di tale ipotesi furono testate mediante l utilizzo di ceppi murini per K.O. per alcuni geni dimostratisi essenziali per lo sviluppo di alcuni componenti fondamentali del sistema immunitario: Es.: RAG2-/- pertanto incapaci di formare T Ly, B ly, NKT; perforina-/-; IFN gamma-/- ecc. Questi animali sviluppano, con diverse caratteristiche, tumori spontanei o elevata percentuale dopo stimolazione con sostanze chimiche
6 Immunosorveglianza Tumor Immunology: Cancer Immunoediting Dunn & Schreiber Nature Immunology 2002 (3)11; QuickTime and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
7 Immunosorveglianza Possibili Meccanismi di Tumor-Escape Fattori del compartimento linfocitario: Scarso numero T cell help Insufficiente numero CTL anti-tumorali,, avidita dei CTL per il tumore Tolleranza immunologica Down-regulation di TCR signaling Apoptosi CTL Inadeguata funzione T cell (citochine, lisi) Aumento di T cellule a carattere soppressivo (T reg, CD4+CD25+) Produzione di citochine immunosoppressive (IL-10) Fattori Tumorali Insufficiente/assente espressione dell antigene Perdita di espressione MHC Assenza di molecole co-stimolatorie Produzione di citochine immunosoppressive (VEGF, IL-10,TGFb)
8 Possibili Effetti Indotti dalla Crescita Tumorale sul Compartimento T Cellulare IMPLICAZIONI TERAPEUTICHE SIGNAL # 2 STIMOLAZIONE Cellula Tumorale T- Cell Ag TCR SIGNAL # 1 Ag APC Cross priming Ag Ag TOLLERANZA - delezione clonale - anergia clonale Jenkins MK. JExpMed 1987; Pardoll D. Nature, 2001; 411, 1010 NEGLETTA Ochsenbein A.F et Al Nature, 2001, 411: 1058 ATTIVAZIONE/ INSUFFICIENTE ESPANSIONE Speiser D.E. et Al. J.Exp.Med. 1997; 186, Ripopolazione con T cell Adottiva Ottimizzare presentazione dell Ag Strategia DC based, peptide based, APC artificiali, ecc. Terapie immunologiche Ottimizzare presentazione dell Ag (DCs, vaccini) Amplificazione della risposta T cellulo mediata Terapia anti-soppressiva
9 Terapia Cellulare non Trapiantologica Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata Ripopolazione Adottiva (T cell) T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK) Ottimizzazione della presentazione dell antigene Aumento antigen up-take e processing Modulazione della maturazione delle DCs Fornire co-stimulazione Antige discovery e modificazione dei peptidi per incrementare la loro avidità Manipolazione della risposta immune Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15) Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione (es:. α-tgf-β, α-il-10, T Reg /CD4+25+) Terapia Genica
10 Cellule Effettrici ad Azione Citotossica CTL: T Linfociti che esercitano la loro attività citotossica mediante riconoscimento di cellule target (antigenicamente differenti) nel contesto del MHC classe I e II. TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes): popolazione eterogenea di linfociti (prevalentemente CD8+CD4+NK) localizzati nel contesto tumorale (es. melanoma, ca.ovarico) o linfonodi drenanti il tumore, aventi azione citotossica per lo più LAK-type, spesso non MHC-mediata). LAK (Lymphokine-Activated Killer): cellule con un azione citotossica su target cellulari NK-resistenti (es. Daudi cell) questa è implementata da IL-2. Cellule NK: hanno una spontanea attività citotossica nei confronti di cellule target (es. cellula tumorale) con una modalità non-mhc ristretta.
11 Immunosorveglianza: Modello Murino Monitoraggio volume Tum. MRD Impianto K7M2 Amputazione Monitoraggio Recidiva Volume: cm 3
12 Osteosarcoma nell Ospite SCID: Invariata la crescita tumorale primaria significativo incremento di recidive/metastasi Primary Tumor Growth Death from Recurrent Disease Amputation size p= Balb/c SCID Days After Implant 20 Balb/c SCID Days after tumor implant
13 K7M2 Osteosarcoma MRD Ruolo dell Immuno-ricostituzione nella Prevenzione di Metastasi SCID Monitoraggia volume K7M2 Impianto Amputazione Monitoraggio Di Recidiva LN early Immuno-ricostituzione CD4+ e CD8+ 25x 10 6 cells = 10 % T cell repertoire Tumor Burden LN late Immuno-ricostituzione CD4+ e CD8+ 25x 10 6 cells = 10 % T cell repertoire MRD
14 T Cell Immuno-Ricostituzione Puo Prevenire Recidiva Tumorale Primary Tumor Growth Death From Recurrent Disease scid LN early 100 scid LN early 80 LN late p= vs. SCID p= vs. SCID Days After Implant Days After Implant Esposizione di cellule T alla Crescita Tumorale Primaria Non Enficia la Capacita di Controllo di Recidiva
15 Evidenza di Priming Immunologico in Animali con Progressiva Crescita di Osteosarcoma Produzione di IFNγ dopo stimolazione in vitro con cellule K7M2 p= Produzione di IFNγ dopo stimolazione in vitro con DC pulsate Lisato Tumorale p= Naive T. Bearing 0 Tum. Bear.+ DCs Tum. Bear.+ Lisato tum.- DC Naive+ Tum. Lysate DC
16 Terapia Cellulare non Trapiantologica PNAS 2004
17 Terapia Cellulare non Trapiantologica Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata Ripopolazione Adottiva (T cell) T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK) Ottimizzazione della presentazione dell antigene Aumento antigen up-take e processing Modulazione della maturazione delle DCs Fornire co-stimulazione Antige discovery e modificazione dei peptidi per incrementare la loro avidità Manipolazione della risposta immune Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15) Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione (es:. α-tgf-β, α-il-10, T Reg /CD4+25+) Terapia Genica
18 Cellule Dendritiche (DC): biologia Ottimizzazione di Strategie Vaccinali Mediante l Utilizzo di DC Copyright Cell Systems Initiative, University of Washington
19 Cellule Dendritiche: biologia Le Sentinelle del Sistema Immunitario M. Jefford et al. Lancet 2003
20 La Processazione dell Antigene Endosoma/lisosomi MHC-II peptide CD4 endocitosi Patogeno Cross-presentation peptidi citosol MHC-II Golgi Proteosoma TAP MHC-I MHC-I peptide CD8 DC
21 Immature vs Mature DCs Importanza della maturazione, effetti sulla risposta immunitaria DC Immature DC Mature Danger signals Bacterial products Cytokines T cells Uptake antigene Endocitosi Processazione antigene via MHC class I/II Costimolazione high CD40, CD54, Class II Migrazione vs linf. Presentazione del Ag Stimolazione cell T Sviluppo cellule CD4+ CD8 T antigene specifiche (CTL)
22 Terapia Cellulare non Trapiantologica Possibili Fonti di Antigeni Tumorali nella strategia Vaccinale DC-based DCs rproteine Estratti proteici crna mrna DCs Corpi apoptotici cdna Tumor cells Peptidi DCs Cellule di fusione Peptidi sintetici (modificati) DCs
23 Tumore specifici bcr/abl protein (CML, ALL) Idiotipo immunoglobuline (NHL, MM) Pml/Rar alfa protein (APL) Shared Tumor-specific Ag (cancer testis Ag, o Melanoma associate) MAGE BAGE GAGE Terapia Cellulare non Trapiantologica Classificazione degli Antigeni Tumorali Antigeni di differenziazione (espressi anche dai normali tessuti) Melan A Mart-1 Proteinase-3 WT-1 Oncogene/tumor suppression Ag P53 Ras mutated protein Virus Associated Ag EBV
24 Terapia Cellulare non Trapiantologica L attivita di Antigen discovery nei tumori dell adulto implicazioni nei tumori pediatrici NBL GAGE-1 (80%) MAGE-1 (50-80%) EWS GAGE-1 XAGE-1,2 RMS XAGE-1,2 Sarcomas GAGE-2 (25%) NY-ESO-1(80%) MAGE Glioblastoma GAGE-3,6 (70%) MAGE-1 Her-2 gp100 Medulloblastoma GAGE-3,6 (45%) Head & Neck PRAME ALL t(8;21) PRAME
25 Terapia Cellulare: Strategia Vaccinale Selezione? Utilizzo di adiuvanti? Quando? Quanto? MRD/low tumor burden Immmuno Riconstituzione Post alte dosi CT
26 Terapia Cellulare non Trapiantologica Fonti alternative di APC CD40 Activated B cell (CD40-B cell): Linfociti B attivati ex-vivo mediante stimolazione con CD40. Tale trattamento media la upregolazione di molecole co-stimolatorie ed incremento della presentazione dell Ag. Conferendo alla cellula caratteristiche che assomigliano a quelle tipiche della DC. ( espressione Rec. Chemochine, produzione di citochine, ecc.) Possono essere facilmente ottenute ed espanse in vitro, pertanto rappresentano una potenziale alternativa fonte di APC autologhe. APC artificiali: CD3/CD28 stimolazione mediante anticorpi coniugati con microbiglie. Mediano l attivazione e l espansione policlonale di popolazioni T cellulari (NHL, CML) Von Bergwelt et al. Cancer Res 2004; Lapointe R. Cancer Res 2004
27 Terapia cellulare non Trapiantologica Studi in ambito pediatrico Expression of MHC class I, MHC class II and cancer germline antigens in neuroblastoma (Wolfl et al Cancer Immunol Immunother 2004) Neuroblastona and DC function (Redlinger RE et al Semin Pedatr Surg 2004) Results of phase 1 study utilizing monocyte-derived Dendritic cells pulsed with tumor RNA in children and young adults with brain tumor (DA Caruso et al. Neuro-Oncol 2004) Restored immune response to an MHC-II restricted antigen in tumor bearing hosts after elimination of regulatory T cell. (Nicholl et al. J ped. Surg 2004) Characterization of CD34+progenitor-derived DC pulsed with tumor cell lysate for a vaccination strategy in children with malignant solid tumor and a poor prognosis (Ackermann et al Klin Pediatr 2004) Functional and molecular characterization of interleukin-2 transgenic Ewing tumor cell for in vivo immunotherapy (Burdach et al Ped Blood Cancer 2004) Pilot trial of tumor specific peptide vaccination and continous infusion of IL2 in patients with recurrent Ewing sarcoma and Alveolar Rhabdomiosarcoma (Dagher R Med. Ped. Oncol. 2002)
28 Terapia Cellulare non Trapiantologica Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata Ripopolazione Adottiva (T cell) T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK) Ottimizzazione della presentazione dell antigene Aumento antigen up-take e processing Modulazione della maturazione delle DCs Fornire co-stimulazione Antige discovery e modificazione dei peptidi per incrementare la loro avidità Manipolazione della risposta immune Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15) Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione (es:. α-tgf-β, α-il-10, T Reg /CD4+25+) Terapia Genica
29 NK NK NK NK NK Expand NK cells (low dose) Innate Immunity Effetti IL-2 mediati Potenzialmente Utili Nel contesto di Immunoterapia Activation-Induced Cell Death (AICD) T Cell trophic factor Proliferation of activated T cell Differentiation of CTL IL-15 IL-2 Therapy Activate NK cell (high dose) Lysis Type 1 Cytokines Synergize for production of other cytokines (e.g. IFNγ, TNFα) Substitute IL15 in NK cell differentiation (via IL2/15Rβγc) NKpre CD56- Innate Immunity NK cell CD56+ NK Tumor NK effector function Innate Immunity
30 Memory T cell Partially substitute IL-15 in the generation of memory CD8+ pool Lytic Activity (CTLs, NK) Effetti IL-7 mediati Potenzialmente Utili Nel contesto di Immunoterapia Induce Lak cells Induce Type 1 cytokines Induce Other Cytokines (e.g. IL-2, IFNγ) IL-7 Therapy Programmed Cell death Up-regulation bcl-2 family molecules Broaden Immune response Recruit Low Affinity clones mono GM-C SF + IL7 Generate Monocytes derived DCs DCs TGFβ production Expand High affinity CD8+ clones Expand High Affinity CD4+ clones? Ag Presenatation Tumor cell TGFβ production Tumor Induced Suppression Expansion of existing or vaccine-induced Immune response
31 Innate Immunity NK NK NK NK NK NKpre CD56- NK cell CD56+ Maintenance Expansion of NK cells NK cell Differentiation Innate Immunity Effetti IL-15 mediati Potenzialmente Utili Nel contesto di Immunoterapia No effect on naïve CD4+ T cell (low expression IL2/15Rβ) Increase Memory CD8+ T cell Critical in the generation and Maintenance of Memory CD8+ pool IL-15 Therapy Expand High Affinity CD8+ clones Expansion of existing or vaccine-induced Immune response Type 1 Cytokines Synergize for production of other cytokikens (e.g. IFNγ, TNFα) Recruit Low Affinity CD8+ clones Broaden Immune response
32 Terapia Cellulare non Trapiantologica Strategie per stimolare/amplificare la risposta immunitaria antitumorale T cellulo mediata Ripopolazione Adottiva (T cell) T Linfociti (CTL, TIL, LAK, NK) Ottimizzazione della presentazione dell antigene Aumento antigen up-take e processing Modulazione della maturazione delle DCs Fornire co-stimulazione Antige discovery e modificazione dei peptidi per incrementare la loro avidità Manipolazione della risposta immune Amplificazione T cell in vivo (es: IL2, IL7, IL15) Diminuzione dei meccanismi di immunosoppressione (es:. α-tgf-β, α-il-10, T Reg /CD4+25+) Terapia Genica
33 Possibile Definizione Terapia Genica: Trattamento che si propone di correggere il/i difetti molecolari causa di una determinata patologia mediante introduzione nelle cellule somatiche del gene mancante o difettivo.
34 Terapia Genica e Vaccinoterapia Inserzione di geni in grado di ottimizzare la risposta immunitaria nel contesto di vaccini antitumorali es: Gene hil-2 in TIL (vettori retrovirali) TCR antigene specifico (es. Anti-gp100) Gene per hil-12 in DC Gene per GM-CSF in cellule tumorali Molecole co-stimolatorie (es. CD80) in cellule tumorali
35 Vaccinoterapia Antigene specifici GM-CSF APC artificiali Citochine DCs Terapia genica Adoptive T cell Proteine
ALLEGATO 2 DESCRIZIONE SCIENTIFICA DEL PROGETTO E OBIETTIVI
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