Laboratorio di microbiologia

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3 Saverio Simeone Laboratorio di microbiologia Corso pratico di tecnica ed analisi microbiologica editrice san marco

4 Progetto grafico, fotolito e layout: Punto & Linea Gorle (BG) Copertina: Studio Vavassori Bonate Sotto (BG) Stampa: Castelli Bolis Poligrafiche Cenate Sotto (BG) Con la collaborazione della Redazione e dei Consulenti della C.E.S.M. Per le citazioni delle fonti, per le riproduzioni varie inserite in quest opera, nonché per eventuali non voluti errori e/o omissioni nei riferimenti o nelle attribuzioni all interno del libro, l editore è a disposizione degli accertati aventi esclusivo diritto. Il copyright delle iconografie e la proprietà dei marchi registrati citati nel testo, utilizzati ai soli fini didattici e a titolo esemplificativo, sono dei rispettivi proprietari in base alla normativa vigente. Printed in Italy ISBN TUTTI I DIRITTI RISERVATI 2004 Editrice San Marco S.r.l., Bergamo Ponteranica - info@editricesanmarco.it È vietata la riproduzione, anche parziale o a uso interno o didattico, con qualsiasi mezzo, non autorizzata dall editore. I trasgressori saranno puniti a norma di legge. Ristampa

5 PREFAZIONE Il testo di Laboratorio di microbiologia si propone come una guida pratica per gli studenti degli Istituti Tecnici e Professionali, futuri operatori e tecnici di laboratorio biologico-sanitario, chimico-biologico, alimentaristico e microbiologico, che per la prima volta affrontano il laboratorio di microbiologia. Il libro vuole essere uno strumento utile allo svolgimento di unità di lavoro per l acquisizione delle basi fondamentali della pratica microbiologica. Al tecnico spetta il controllo microbiologico dell aria, del suolo, delle acque, delle bevande e degli alimenti, facendo uso di strumentazioni e di metodiche ufficiali standardizzate o in mancanza di esse, di tecniche ampiamente collaudate e quindi facilmente ripetibili. Il laboratorio di controllo della qualità degli alimenti è uno dei passaggi fondamentali dell ispezione di un prodotto, a garanzia del consumatore e del produttore per la salvaguardia della salute pubblica. Le metodiche descritte nei 41 capitoli sono accompagnate da richiami teorici e schede didattiche di approfondimento per facilitare il compito dell esecutore, farlo riflettere sui fenomeni osservati e per formulare ipotesi personali. È possibile, attraverso la diversificazione delle prove, affinare capacità critiche e organizzative per raggiungere il necessario livello di autonomia nell esecuzione delle analisi. Al docente compete la scelta, tra gli argomenti trattati, delle esercitazioni che ritiene più significative in relazione agli indirizzi di specializzazione, all effettivo livello di conoscenza di base esistente nella classe e alle attrezzature del laboratorio. Il testo è aggiornato in materia di controllo microbiologico di tutte le matrici ambientali e alimentari, sia per quanto riguarda la legislazione vigente, nazionale e comunitaria, sia nei riguardi delle tecniche di analisi applicate di routine nei laboratori di microbiologia delle ARPA. Molte delle determinazioni fondamentali descritte possono essere realizzate con procedimenti molto semplici ed elementari, per i quali è sufficiente disporre di una dotazione strumentale minima. L opera si completa con un sintetico Atlante Microbiologico, con numerose Schede didattiche di approfondimento e con un nutrito repertorio di Allegati che sono l indispensabile completamento dei temi trattati. Laboratorio di microbiologia è il naturale complemento di Fondamenti di Microbiologia dello stesso Editore. L Autore 3

6 INDICE GENERALE INDICE GENERALE CAPITOLO 1 IL LABORATORIO La vetreria Strumenti ed attrezzature di laboratorio Norme di comportamento durante le analisi Principali simboli e sigle internazionali dei prodotti pericolosi Informazioni e norme di sicurezza per maneggiare sostanze pericolose Miglioramento della sicurezza e della salute dei lavoratori sul luogo di lavoro 26 CAPITOLO 2 IL MICROSCOPIO Microscopio ottico Microscopio elettronico Microscopia in campo oscuro Microscopia a contrasto di fase Microscopia in contrasto interferenziale Microscopia a fluorescenza Stereomicroscopio Semplici osservazioni al microscopio 35 CAPITOLO 3 COLORAZIONI BATTERICHE Principi generali delle colorazioni Colorazione semplice monocromatica Colorazione differenziale di Gram Colorazione per l acido resistenza Colorazione della capsula Colorazione dei flagelli Colorazione delle spore 53 CAPITOLO 4 TERRENI DI COLTURA Terreni elettivi o nutritivi Terreni selettivi Terreni differenziali Preparazione di un terreno 60 CAPITOLO 5 IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI Raccolta del campione Preparazione del campione Semina Incubazione Sistemi miniaturizzati per la ricerca batterica La ricerca dei batteri non coltivabili Attività metaboliche dei batteri Identificazione biochimica delle Enterobacteriaceae 80 CAPITOLO 6 RICERCA DEI MICETI Il laboratorio di micologia Lieviti e muffe Controllo dei lieviti negli alimenti Determinazione dell aflatossina M1 93 CAPITOLO 7 MICROBIOLOGIA DELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO Significato ed interpretazione dei microrganismi Requisiti di qualità delle acque destinate al consumo umano Parametri microbiologici Modelli e frequenza delle analisi delle acque destinate al consumo umano D. Lgs. n. 31/2001: parametri microbiologici Tecniche per quantificare i parametri microbiologici Controllo minimo C1: ricerca dei coliformi e dei coliformi fecali Controllo normale C2: ricerca degli streptococchi fecali (enterococchi) Controllo periodico C3: conta microbica a 22 C e a 36 C 118 4

7 INDICE GENERALE capitolo 8 RICERCA DEI MICRORGANISMI PATOGENI NELLE ACQUE DESTINATE AL CONSUMO UMANO Controllo occasionale C Clostridi solfito-riduttori Staphylococcus aureus Ricerca delle salmonelle Ricerca delle shigelle Ricerca dei Proteus Batteriofagi nell ambiente idrico Virus enterici nell ambiente idrico Pseudomonas Ricerca del vibrione del colera Legionella pneumophila Ricerca delle leptospire Micobatteri Ricerca degli attinomiceti Aeromonas hydrophila Endotossine da batteri Gram negativi Protozoi nell ambiente idrico Elminti nell ambiente idrico Alghe nell ambiente idrico Funghi in ambiente idrico Ricerca dei funghi col metodo MF 163 CAPITOLO 9 ACQUE MINERALI Limiti di carica microbica Determinazione della carica microbica Ricerca dei coliformi Ricerca degli streptococchi fecali Ricerca dei clostridi solfito-riduttori Ricerca dello Staphylococcus aureus Ricerca di Pseudomonas aeruginosa Ricerca delle salmonelle 175 CAPITOLO 10 ACQUE TERMALI, ACQUE DI PISCINA, ACQUE DI SORGENTE Acque termali Acque di piscina Acque di sorgente 179 CAPITOLO 11 ACQUE DI BALNEAZIONE Norme tecniche per le acque di balneazione 182 CAPITOLO 12 NORME PER LA TUTELA DELLE ACQUE DALL INQUINAMENTO Obiettivi di qualità ambientale Tutela dei corpi idrici e disciplina degli scarichi Ricerca di Escherichia coli col metodo del numero più probabile (MPN) Saggi di tossicità Indicatori di qualità delle acque superficiali Indicatori di qualità di laghi, acque marine costiere, corpi idrici artificiali, acque sotterranee 198 CAPITOLO 13 MACROINVERTEBRATI E INDICI BIOTICI (IBE) Le acque dolci idonee alla vita dei pesci Indice Biotico Esteso (IBE) 200 CAPITOLO 14 UTILIZZAZIONE DEI FANGHI IN AGRICOLTURA Ricerca delle salmonelle 207 CAPITOLO 15 CONTROLLI DI QUALITÅ DEL LATTE DESTINATO AL CONSUMO UMANO Ricerca della fosfatasi Ricerca della perossidasi 213 5

8 INDICE GENERALE CAPITOLO 16 RICERCA DEI PARAMETRI MICROBIOLOGICI DEL LATTE Prova della reduttasi Carica microbica totale Enterobacteriaceae Escherichia coli Determinazione della carica microbica nel latte sterilizzato Ricerca dei batteriofagi nei batteri lattici mesofili Ricerca dei batteri propionici Latte mastitico Latte in polvere per l alimentazione della prima infanzia 245 CAPITOLO 17 SALMONELLA NEI PRODOTTI LATTIERO-CASEARI Ricerca delle salmonelle 252 CAPITOLO 18 LISTERIA MONOCYTOGENES NEI PRODOTTI ALIMENTARI Ricerca di Listeria Limiti di Listeria monocytogenes in alcuni prodotti alimentari 263 CAPITOLO 19 YERSINIA NEI PRODOTTI LATTIERO-CASEARI Ricerca di Yersinia enterocolitica 268 CAPITOLO 20 CAMPILOBATTERI Ricerca dei campilobatteri 273 CAPITOLO 21 RICERCA DI SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE Par-Test ADM Beta-Lactam Antibiotic Test LacTek Sistema BR Test 278 CAPITOLO 22 BURRO Determinazione della carica batterica Determinazione dei coliformi totali e termoresistenti Conteggio dei microrganismi lipolitici 282 CAPITOLO 23 FORMAGGIO Analisi microbiologica di un formaggio 288 CAPITOLO 24 YOGURT Ricerca dei lieviti nello yogurt Conteggio di Streptococcus thermophilus Ricerca dei lattobacilli Streptococcus thermophilus e lattococchi 298 CAPITOLO 25 GELATO Materie prime più comuni Ricerca flora aerobica a 32 C Numerazione dei coliformi Ricerca dello Staphylococcus aureus 306 CAPITOLO 26 BATTERI SPORIGENI AGENTI DI MALATTIE DA ALIMENTI Ricerca del Bacillus cereus Riconoscimento di Clostridium botulinum Ricerca di Clostridium perfringens Ricerca dei clostridi butirrici 312 6

9 INDICE GENERALE CAPITOLO 27 UOVA Ricerca delle salmonelle Ovoprodotti 318 CAPITOLO 28 PASTE ALIMENTARI E PIATTI PRECUCINATI Paste alimentari Farine per l alimentazione Piatti precucinati 322 CAPITOLO 29 MIELE 324 CAPITOLO 30 CARNE Controllo microbiologico delle carcasse animali Bioluminescenza Carni macinate e in pezzi Carni avicole Ricerca di sostanze inibenti nelle carni Impiego dei caseinati alimentari 337 CAPITOLO 31 SALUMI Analisi dei salumi 339 CAPITOLO 32 FARINE DI CARNE E DI PESCE 345 CAPITOLO 33 PESCI E PRODOTTI DELLA PESCA Norme sanitarie dei prodotti della pesca Molluschi eduli lamellibranchi 350 CAPITOLO 34 FRUTTA E VERDURA 355 CAPITOLO 35 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEI COSMETICI 359 CAPITOLO 36 DISCIPLINA IGIENICA DI PENNE E PIUME Test microbiologici (da eseguire in seconda istanza) 362 CAPITOLO 37 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEL VINO Determinazione della carica microbica Saggio di fermentescibilità Terreni di coltura 372 CAPITOLO 38 MICROBIOLOGIA DEL TERRENO Analisi microbiologica del terreno 375 CAPITOLO 39 MICROBIOLOGIA DEL COMPOST 382 CAPITOLO 40 CONTROLLO MICROBIOLOGICO DELLE SUPERFICI E DELL ARIA Controllo microbiologico delle superfici Controllo microbiologico dell aria 391 CAPITOLO 41 VALUTAZIONE DELL'ATTIVITÅ ANTIMICROBICA Antibiogramma La determinazione dell attività inibente dei disinfettanti 400 APPENDICE 403 SCHEDE DIDATTICHE 417 ATLANTE MICROBIOLOGICO 449 INDICE ANALITICO 477 7

10 Capitolo 1 IL LABORATORIO

11 IL LABORATORIO LA VETRERIA La vetreria del laboratorio di microbiologia è, con poche eccezioni, la stessa in uso nei laboratori di chimica. Bicchieri (becher), beute (matracci), provette, piastre (capsule o scatole) Petri e pipette devono essere sempre sterilizzati in stufa a secco a C o in autoclave in corrente di vapore a 121 C per non meno di 15 minuti, oppure, eccezionalmente, in acqua bollente per qualche minuto. I recipienti di vetro sottoposti a riscaldamento sono di vetro Pyrex e Murano, resistenti agli sbalzi termici e alle soluzioni alcaline. Solo per l esecuzione di preparazioni chimiche, quali l allestimento di coloranti, di reattivi o altro, è sufficiente la semplice pulitura. La vetreria dopo l asciugatura a temperatura ambiente o in stufa, non deve presentare macchie o aloni, indicatori di una non perfetta pulizia. Eventuali residui adesi devono essere allontanati risciacquando ripetutamente con acqua distillata. Prima della sterilizzazione la vetreria contaminata deve essere immersa in recipienti contenenti soluzioni battericide (cresolo grezzo all 1%, lisoformio, ecc.) per il tempo consigliato dalla ditta fornitrice. Residui sulle pareti dei recipienti di vetro possono essere rimossi usando soluzioni saponose, miscela cromica o solventi adatti. Per le manipolazioni di materiale infetto, o presunto tale, sono d obbligo i guanti monouso. Dopo l uso è buona norma sterilizzare tutti i materiali, terreni compresi, i quali verranno raccolti in appositi contenitori. Tutti i rifiuti potenzialmente pericolosi devono essere smaltiti secondo le disposizioni di legge. La vetreria rotta, come tutti i rifiuti, non va dispersa nell ambiente. Fig Materiali di uso comune in laboratorio. 9

12 1 IL LABORATORIO Fig Materiali di uso comune in laboratorio. 10

13 IL LABORATORIO 1 Fig Materiali di uso comune in laboratorio. 11

14 1 IL LABORATORIO Fig Materiali di uso comune in laboratorio. 12

15 IL LABORATORIO 1 Complessi filtranti Nalgene (Pbi) Dispositivi filtranti Nalgene (Pbi) Fig Materiali di uso comune in laboratorio. 13

16 1 IL LABORATORIO 1.2 STRUMENTI ED ATTREZZATURE DI LABORATORIO N el laboratorio di microbiologia, la strumentazione essenziale comprende: - bunsen; - frigorifero; - congelatore da 8 a 20 C; - termostato ad aria regolabile da 20 a 60 C; - stufa termostatica regolabile da 20 a 250 C; - stufa a microonde; - bagnomaria termostatato; - omogeneizzatore Stomacher; - bilancia tecnica (con divisioni da 0,01 g); - bilancia analitica digitale (div. 0,1 mg); - autoclave; - ph-metro; Micropipetta monocanale UNI - FIX Pipette di Mohr monouso Micropipetta multicanale SOCOREX Pipettatore NEW AKKU per il prelievo e la dispensazione di liquidi Fig Pipette e micropipette. Le micropipette sono sistemi di dispensazione in grado di erogare volumi di liquido di elevata precisione (Pbi). 14

17 IL LABORATORIO 1 - contacolonie; - centrifuga; - giara per anaerobiosi; - microscopio ottico composto; - stereomicroscopio; - microscopio a fluorescenza; - spettrofotometro; - cappa a flusso laminare; - valigetta termica refrigerata per trasporto campioni. Per uso scolastico vi sono dei kit (Sartorius, ecc.) per microbiologia ambientale in valigetta con l attrezzatura per semplici esperimenti microbiologici di scienze naturali per la ricerca di germi nell acqua, nell aria, nella terra. Nelle pagine seguenti sono schematizzati i principali materiali e strumenti a disposizione del tecnico di laboratorio microbiologico (dal catalogo Pbi International). Anse Bactostreak Inceneritore di batteri Bacteria - Safe Tamponi Transport-Kit Bacchette Daf Anse calibrate Dispol Bacchette Etaleur Tamponi Swab Anse calibrate Saloop Fig Anse e inceneritore per batteriologia. 15

18 1 IL LABORATORIO A) B) C) Fig Scatole (piastre) Petri in polistirolo, sterili, monouso, piane e trasparenti. A) normali B) suddivise in più scomparti per saggiare lo stesso inoculo su terreni diversi in un unica piastra C) a fondo retinato per facilitare il conteggio delle colonie (Pbi). 16

19 IL LABORATORIO 1 Contacolonie manuale Contacolonie elettronico Fig Contacolonie manuale e automatico. Il modello automatico Accucount-Super (Pbi) dotato di telecamera esterna, permette il conteggio degli oggetti sia al microscopio sia direttamente in piastra. 17

20 1 IL LABORATORIO Bagno scuotitore termostatato Damian ; range di temperatura: da temperatura ambiente a 100 C. Termostato Cosmos Giara per anaerobiosi. La giara è un recipiente cilindrico, trasparente che, attraverso l impiego di reattivi chimici, permette di creare condizioni di anaerobiosi o di microaerofilia. Il coperchio, a chiusura ermetica, è provvisto di valvola per lo svuotamento dei gas, di manometro per la misurazione della pressione di esercizio, di una valvola di sicurezza e di una sede per il catalizzato (palladio). L anaerobiosi è garantita dall idrogeno e dall anidride carbonica che si liberano dopo l aggiunta di acqua in una busta contenente il reattivo. L avvenuta anaerobiosi è segnalata dal viraggio di un indicatore (resazurina). Fig Termostati e giara per anaerobiosi. 18