Implicazioni diagnostiche dell epcidina nelle patologie interessanti il metabolismo del ferro

Transcript

1 Implicazioni diagnostiche dell epcidina nelle patologie interessanti il metabolismo del ferro Joyce JC Kroot 1, Harold Tjalsma 1,2, Robert E. Fleming 3, Dorine W. Swinkels 1,2 1Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Genetic, Endocrine and Metabolic Disorders and 2 Hepcidinanalysis.com, Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, the Netherlands 3Saint Louis University School of Medicine, St. Louis, USA Traduzione a cura di Alberto Dolci ABSTRACT The peptide hormone hepcidin plays a central role in regulating dietary iron absorption and body iron distribution. Many human diseases are associated with alterations in hepcidin concentrations. The measurement of hepcidin in biological fluids is therefore a promising tool in the diagnosis and management of medical conditions in which iron metabolism is affected. We describe hepcidin structure, kinetics, function, and regulation. We moreover explore the therapeutic potential for modulating hepcidin expression and the diagnostic potential for hepcidin measurements in clinical practice. Cell-culture, animal, and human studies have shown that hepcidin is predominantly synthesized by hepatocytes, where its expression is regulated by body iron status, erythropoietic activity, oxygen tension, and inflammatory cytokines. Hepcidin lowers serum iron concentrations by counteracting the function of ferroportin, a major cellular iron exporter present in the membrane of macrophages, hepatocytes, and the basolateral site of enterocytes. Hepcidin is detected in biologic fluids as a 25 amino acid isoform, hepcidin-25, and two smaller forms, i.e., hepcidin-22 and -20; however, only hepcidin-25 has been shown to participate in the regulation of iron metabolism. Reliable assays to measure hepcidin in blood and urine by use of immunochemical and mass spectrometry methods have been developed. Results of proof-of-principle studies have highlighted hepcidin as a promising diagnostic tool and therapeutic target for iron disorders. However, before hepcidin measurements can be used in routine clinical practice, efforts will be required to assess the relevance of hepcidin isoform measurements, to harmonize the different assays, to define clinical decision limits, and to increase assay availability for clinical laboratories. INTRODUZIONE Il ferro è necessario per l attività biologica delle molecole che legano ossigeno, principalmente emoglobina e mioglobina, e degli enzimi che contengono ferro, comprendenti il sistema dei citocromi mitocondriali. Il ferro cellulare è prevalentemente legato alla ferroprotoporfirina IX (eme) e ai centri ferro-zolfo, che servono da cofattori enzimatici, o immagazzinato nel nucleo centrale vuoto della ferritina costituito da un multimero di 24 subunità. Senza un adeguata quantità di ferro, le cellule perdono la capacità di trasportare elettroni e di mantenere il metabolismo energetico. Tuttavia, l attività di ossido-riduzione del ferro può anche risultare dannosa, in primo luogo per la produzione di radicali liberi, metaboliti reattivi dell ossigeno. Pertanto, la concentrazione di ferro deve essere strettamente regolata sia a livello cellulare che sistemico. Un fattore cruciale per il mantenimento dell omeostasi sistemica del ferro è un efficace comunicazione tra le cellule che assorbono il ferro alimentare (enterociti del duodeno), quelle che lo utilizzano (principalmente i precursori eritroidi) e quelle dove viene immagazzinato (epatociti e macrofagi tissutali). L ormone peptidico epcidina interagisce con la ferroportina, che trasporta il ferro fuori dalla cellula, e perciò viene attualmente riconosciuto come il fattore di regolazione chiave dell omeostasi sistemica del ferro. In questo lavoro facciamo il punto sui più importanti avanzamenti derivati dagli studi su struttura, cinetica, regolazione e funzione dell epcidina e sull attuale stato dei saggi per la determinazione dell epcidina. Inoltre, riassumiamo gli studi sull epcidina condotti sull uomo in condizioni fisiologiche e patologiche e discutiamo l evidenza delle possibilità terapeutiche di *Questo articolo è stato tradotto con il permesso dell American Association for Clinical Chemistry (AACC). AACC non è responsabile della correttezza della traduzione. Le opinioni presentate sono esclusivamente quelle degli Autori e non necessariamente quelle dell AACC o di Clinical Chemistry. Tradotto da Clin Chem 2011;57: su permesso dell Editore. Copyright originale 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. In caso di citazione dell articolo, riferirsi alla pubblicazione originale in Clinical Chemistry 108 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

2 modulare le concentrazioni di epcidina. Infine, mettiamo in evidenza le più promettenti applicazioni diagnostiche della determinazione dell epcidina in medicina. SINTESI E STRUTTURA DELL EPCIDINA L epcidina umana è prevalentemente prodotta dagli epatociti come peptide di 25 amminoacidi (2789,4 Da) ed è secreta in circolo (1, 2). Un successivo rimaneggiamento della porzione amminoterminale della forma a 25 amminoacidi può determinare la comparsa in circolo di due forme più piccole di epcidina, a 22 e 20 amminoacidi. Questi peptidi di epcidina assumono una struttura a forcina, con quattro ponti disolfuro intramolecolari (Figura 1) (3). Sulla base di alcuni studi, ricercatori hanno riportato che l epcidina lega i metalli divalenti (Cu 2+, Fe 2+, Zn 2+ e Ni 2+ ), ma questi riscontri non sono coerenti tra loro: ad esempio, alcuni studi hanno suggerito la presenza di ferro nella parte centrale del peptide in una coordinazione tetraedrica con lo zolfo (4-6), mentre altri studi hanno fornito l evidenza di un motivo strutturale amminoterminale (ATCUN) che lega Cu 2+ e Ni 2+ (7, 8). La capacità dell epcidina di legare ferro e altri metalli divalenti indica che, nell ambito del metabolismo del ferro, l epcidina possa svolgere un ruolo non ormonale oppure che un meccanismo conformazionale di captazione dei metalli divalenti sia parte della sua funzione ormonale di regolazione della degradazione della ferroportina. C è ancora molto da scoprire sull origine delle isoforme più piccole dell epcidina, anche se i dati disponibili indicano che l attività tissutale calcioindipendente degli estratti pancreatici potrebbe determinare l accorciamento della porzione N-terminale dell epcidina-25 trasformandola in epcidina-22 e che la dipeptidilpeptidasi 4 è coinvolta nella trasformazione dell epcidina-22 in epcidina-20 (9, 10). In condizioni fisiologiche l epcidina-20 e l epcidina-22 sono presenti nelle urine e in concentrazioni molto basse nel siero (11-13). E interessante che queste isoforme più piccole dell epcidina compaiano nel siero di pazienti con patologie che si associano a elevate concentrazioni di epcidina-25, quali infarto acuto del miocardio (IMA), sepsi, anemia da malattia cronica (ACD), sindrome metabolica e malattia renale cronica (CKD) (Figura 2) (12-17). Studi in vivo condotti sui topi hanno dimostrato che solo l epcidina a lunghezza integrale di 25 amminoacidi induce una significativa iposideremia quando iniettata per via intraperitoneale (18). Questi riscontri sono corroborati da studi che hanno dimostrato che le forme troncate a 22 e 20 amminoacidi mostrano un attività di regolazione della ferroportina rispettivamente molto diminuita o quasi completamente persa in confronto all epcidina di 25 amminoacidi (19). Studi recenti hanno dimostrato che l epcidina è espressa anche in cellule diverse dagli epatociti, anche se a concentrazioni molto inferiori. Queste comprendono cellule tubulari renali, cellule della retina, monociti, neutrofili, adipociti, cellule alveolari, cellule β del pancreas e miocardiociti (20-27). Tuttavia, è improbabile che l epcidina prodotta da queste cellule apporti un contributo significativo alle concentrazioni rilevabili nel circolo sistemico, anche se potrebbe esercitare degli effetti locali in questi tessuti (vedi sotto). CINETICHE DELL EPCIDINA L epcidina in circolo è legata a α 2 -macroglobulina con un affinità relativamente alta e all albumina con un affinità relativamente bassa. Sulla base di calcoli teorici, si è stimato che 11% dell epcidina circola come frazione libera (28). Non si sa ancora se il legame a queste molecole di trasporto incida sulle proprietà funzionali dell epcidina. Si presume che la rimozione plasmatica dell epcidina avvenga a livello dei suoi siti attivi mediante meccanismi di degradazione cellulare congiunta con la ferroportina e tramite escrezione renale. A causa del suo basso PM e Figura 1 Struttura molecolare dell epcidina. È rappresentato il modello della struttura dell epcidina-25 secondo Jordan et al. (3) con i foglietti β (frecce grigie), lo scheletro peptidico (in grigio), i ponti disolfuro (1-8, 2-4, 3-6, e 5-7) (in verde), i residui di arginina e lisina carichi positivamente (in blu) e il residuo di acido aspartico carico negativamente (in rosso). Figura 2 Profili di spettrometria di massa a tempo di volo (TOF MS) di siero e urine di controllo sano e del siero di un paziente con malattia renale cronica (CKD). Gli spettri mostrano epcidina-25 (m/z 2789,4), epcidina-24 (m/z 2673,9) come standard interno (IS), epcidina-22 (m/z 2436,1) ed epcidina-20 (m/z 2191,8). Si noti che, in confronto al siero del controllo sano, il siero del paziente con CKD mostra chiaramente tutte e tre le isoforme di epcidina. Hep, epcidina. biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

3 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS del suo raggio ridotto, è molto probabile che l epcidina libera passi liberamente nel filtrato glomerulare. É stato calcolato che la frazione di escrezione dell epcidina nell uomo è bassa, intorno a 0-5%, o perché viene riassorbita in maniera simile ad altri piccoli peptidi oppure perché non è liberamente filtrata (29, 30). L evidenza per quest ultima spiegazione deriva dal riscontro, in pazienti con disfunzione glomerulare, di aumenti della concentrazione di epcidina sierica dell ordine di 1-6 volte soltanto (15, 16, 29, 31, 32), in confronto all aumento di volte della β 2 - microglobulina sierica. E noto che l escrezione di questa proteina a basso PM dipende quasi esclusivamente dalla filtrazione glomerulare. E possibile che il legame con α 2 -macroglobulina o con altre proteine di trasporto impedisca all epcidina circolante di essere liberamente filtrata. In alternativa, l atteso incremento della concentrazione di epcidina in circolo nei pazienti con ridotta filtrazione renale potrebbe essere bilanciato da una riduzione della produzione epatica di epcidina come meccanismo compensatorio. E puramente speculativo, ma plausibile, che in determinate condizioni l epcidina sfugga al riassorbimento tubulare renale. Il blocco del riassorbimento può rivestire un ruolo in parecchi disturbi del metabolismo del ferro associati a disfunzione tubulare e aumentate concentrazioni di epcidina urinaria, come infiammazione, sovraccarico di ferro e malaria (33, 34). Prima di interpretare la concentrazione urinaria di epcidina come specchio di quella sierica, bisogna anche tener conto della possibile produzione topica di epcidina a livello del tubulo, come pure di una possibile riduzione del suo riassorbimento tubulare (25). Sono quindi necessari studi ulteriori per valutare la possibilità che infezioni urinarie o una disfunzione tubulare possano contribuire all aumento delle concentrazioni di epcidina urinaria. FUNZIONE DELL EPCIDINA Si pensa che l epcidina-25 sia il principale regolatore dell assorbimento del ferro alimentare e del rilascio del ferro cellulare. Essa svolge la sua funzione regolatoria antagonizzando l attività della ferroportina, il principale esportatore di ferro cellulare a livello della membrana di macrofagi, epatociti e della zona basolaterale degli enterociti. L epcidina-25 induce l internalizzazione e la degradazione della ferroportina, con conseguente incremento dei depositi di ferro intracellulare e riduzione dell assorbimento del ferro alimentare e delle Figura 3 Assorbimento e ricircolo del ferro. La maggior parte del ferro utilizzato dall organismo è riciclato dai macrofagi a partire dagli eritrociti senescenti e riportato nel midollo osseo per essere incorporato nei precursori eritroidi. Il fegato e i macrofagi del sistema reticoloendoteliale funzionano come principali depositi di ferro. E importante ricordare che la quantità totale di ferro nell organismo può essere regolata solo attraverso il suo assorbimento, mentre la perdita di ferro avviene solo passivamente attraverso la desquamazione cellulare della cute e delle mucose e le perdite ematiche. Questo determina l assorbimento e la perdita di 1-2 mg di ferro al giorno. L epcidina, un peptide prodotto nel fegato, controlla la concentrazione plasmatica di ferro inibendo l esternalizzazione del ferro dagli enterociti e dai macrofagi mediata dalla ferroportina. Di conseguenza, un aumento della produzione di epcidina causa una diminuzione delle concentrazioni plasmatiche di ferro. L espressione dell epcidina è regolata dallo stato dei depositi marziali dell organismo, infiammazione, richiesta di ferro dal compartimento eritroide e ipossia attraverso vie di regolazione che coinvolgono l espressione dei geni HFE, recettore 2 della transferrina (TFR2) e dell emocromatosi di tipo 2 (giovanile) (HFE2) (conosciuto anche come HJV). Adattata da riferimenti 142 e biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

4 concentrazioni del ferro circolante (Figura 3) (35-38). Oltre al suo ruolo nella regolazione sistemica del metabolismo del ferro, l epcidina contribuisce anche alla difesa dell ospite. Essa è stata originariamente identificata come peptide antimicrobico (1, 11). Benchè studi in vitro rivelino l effetto battericida dell epcidina, questo effetto richiederebbe concentrazioni più elevate di quelle osservate in circolo. Tali concentrazioni possono essere raggiunte a livello locale, ad esempio nei fagosomi di macrofagi infettati (39). L epcidina potrebbe anche contribuire indirettamente alla difesa dell ospite riducendo le concentrazioni plasmatiche di ferro. Il ferro è necessario per la crescita batterica e la riduzione del ferro plasmatico ha un effetto batteriostatico. Inoltre, si è scoperto che l epcidina modula la trascrizione indotta da lipopolisaccaride sia in macrofagi in coltura che in modelli murini in vivo (40). Quest ultima osservazione indica per l epcidina un ruolo nella modulazione della risposta infiammatoria acuta all infezione batterica. L epcidina prodotta da tipi cellulari differenti dagli epatociti (vedi sopra) può indurre effetti topici su questi tessuti. Attraverso un interazione autocrina con la ferroportina, l epcidina topica può proteggere le cellule circostanti dalla carenza di ferro, prevenire lo stress ossidativo extracellulare, influenzare la risposta infiammatoria e/o ridurre la quantità di ferro extracellulare disponibile per i patogeni extracellulari (27, 40-42). Sebbene le forme più piccole di epcidina non provochino una risposta che esita nella riduzione del ferro circolante, non è noto se esse possiedano qualche altra funzione biologica dell epcidina-25 (ad es., nella difesa dell ospite o nella capacità di legare i metalli) (4, 6, 11, 43). REGOLAZIONE DELL EPCIDINA Numerosi processi fisiologici e patologici regolano la sintesi dell epcidina (Figura 3) (44). Le situazioni nelle quali la richiesta di ferro in circolo è aumentata (particolarmente l attività eritropoietica) provocano una riduzione della sintesi epatica di epcidina. Queste condizioni comprendono carenza di ferro, ipossia, anemia e situazioni caratterizzate da un accelerata attività eritropoietica. Una riduzione dell epcidina induce il rilascio del ferro di deposito e l aumento dell assorbimento di ferro alimentare. D altro canto, infezioni e infiammazione causano un aumento della sintesi di epcidina. Questa sintesi elevata determina una diminuzione del ferro disponibile per l eritropoiesi ed è considerata il meccanismo alla base del sequestro di ferro nel sistema reticolo-endoteliale (RE), della riduzione dell assorbimento intestinale di ferro e delle basse concentrazioni di ferro caratteristiche dell ACD. Le vie funzionali di segnale attraverso le quali stato marziale, attività eritiropoietica, ipossia e infiammazione influenzano l espressione di epcidina sono sempre più studiate. Queste vie comprendono quattro percorsi di regolazione strettamente interconnessi (Figura 4). Regolazione da parte dello stato marziale Per modificare l espressione di epcidina nell epatocita il ferro di deposito epatico e il ferro che circola legato alla transferrina (Tf-Fe 2 ) inviano segnali biologici tra loro distinti (Figura 4) (44-46). Sembra che la transferrina circolante sia rilevata tramite un complesso epatocellulare, che comprende il recettore-1 della transferrina (TfR1), il TfR2 e la proteina HFE. Carenze di TfR2 e HFE inducono la riduzione delle concentrazioni dell epcidina tramite le chinasi extracellulari regolate dal segnale: la via della proteinchinasi attivata da mitogeni (ERK/MAPK) e/o la via della proteina morfogenetica dell osso (BMP)/SMAD [ mothers against decapentaplegic homolog (Drosofila)] (BMP/SMAD) (Figura 4). I depositi intracellulari di ferro comunicano con l epcidina tramite le BMPs, particolarmente BMP6, con una modalità paracrina o autocrina. Queste molecole di segnale extracellulari agiscono sui recettori epatocellulari della BMP per attivare la via di segnale intracellulare SMAD e aumentare la trascrizione di epcidina. L emojuvelina (HJV), un corecettore di BMP (47), è cruciale per l espressione di epcidina perché differenti vie di regolazione dell epcidina convergono su questa proteina di membrana. In condizioni di ferro basso, la HJV di membrana è clivata dalla matriptasi-2, una serina proteasi transmembrana 6, codificata dal gene della serina proteasi transmembrana 6 (TMPRSS6) espresso prevalentemente nel fegato (48, 49). Il clivaggio da parte di matriptasi-2 indebolisce il segnale di BMP. Regolazione da parte di segnali di eritropoiesi In studi su topi, sull uomo e in vitro è stato scoperto che la somministrazione di agenti stimolanti l eritropoiesi (ESA) riduce la produzione di epcidina nell epatocita (50-53). L eritropoiesi richiede considerevoli quantità di ferro, per cui la soppressione della sintesi epatica di epcidina da parte di segnali biologici di eritropoiesi è di grande importanza fisiologica. Tuttavia, non è ancora chiaro come l eritropoiesi regoli l epcidina. L ipotesi, dimostrata in colture cellulari, che l eritropoietina (EPO) agisca direttamente sui recettori dell epatocita (51) non è stata confermata in modelli animali di anemia, nei quali si è visto che la ridotta espressione di epcidina dipende dall eritropoiesi e non è direttamente mediata dall EPO (53, 54). Recenti osservazioni indicano che il segnale di eritropoiesi può comprendere una o più proteine rilasciate a livello dei siti di eritropoiesi attiva, come il fattore di crescita-differenziazione 15 (GDF15) e l omologo-1 della proteina twisted gastrulation (TWSG1). Queste molecole, come le BMPs, sono componenti della famiglia del fattore di crescita trasformante β e quindi potrebbero agire mediante un azione effettrice sulla via BMP/SMAD (Figura 4) (55-57). Le correlazioni tra espressione di TWSG1, parametri del ferro circolante e concentrazione di epcidina sierica non sono ancora state determinate nell uomo. Nessuno di biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

5 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS Figura 4 Vie molecolari e funzionali di regolazione della sintesi epatica di epcidina. Si possono distinguere tre vie molecolari: HFE/TfR2, BMP/SMAD e JAK/STAT. Il modello proposto descrive due segnali del ferro all epcidina, uno mediato dai depositi di ferro intracellulare e l altro dal ferro circolante (Tf-Fe 2 ). I depositi di ferro intracellulari del fegato aumentano l espressione della proteina morfogenetica dell osso (BMP) 6, che serve da fattore autocrino interagendo con i recettori di superficie di BMP. L emojuvelina (HJV) è un corecettore di BMP che aumenta il legame della BMP. La conseguente attivazione delle proteine intracellulari SMAD trasduce un segnale di aumento della trascrizione di epcidina. HJV è soggetta a clivaggio da parte della furina, che è regolata da ferro e ipossia, a formare un componente solubile (shjv). shjv si può successivamente comportare da corecettore solubile e da antagonista della sintesi di epcidina indotta da BMP6. In condizioni di ferro basso, HJV legata alla membrana è clivata anche da matriptasi-2 (effetto forbice) indebolendo ulteriormente il segnale di BMP6. Tf-Fe 2 extracellulare media un secondo segnale del ferro. In questo schema, Tf-Fe 2 spiazza la proteina HFE da TfR1. HFE viene quindi liberata e può interagire con TfR2. Il complesso HFE TfR2 attiva la trascrizione dell epcidina attraverso la via di segnale BMP/SMAD. Numerosi studi hanno fornito evidenze indirette del coinvolgimento della via di segnale epatica ERK/MAPK (chinasi extracellulari regolate dal segnale/proteinchinasi attivata da mitogeni) nella regolazione dell epcidina da parte del ferro attraverso TfR2 e/o HFE. Recenti studi sui topi, tuttavia, hanno dimostrato che la somministrazione acuta e cronica di ferro per via enterale non attivava la via ERK/MAPK, riscontro che suggerisce che questa via in vivo può non essere fisiologicamente coinvolta nell omeostasi del ferro. L ipossia influenza la stabilizzazione epato-specifica del fattore 1 inducibile dall ipossia (HIF-1), che induce matriptasi-2 e il conseguente clivaggio di HJV. Questa via può essere sinergistica all elevato rilascio di shjv indotto dal suo clivaggio da parte della furina in condizioni di ipossia. L eritropoiesi è controllata in parte dalla produzione di eritropoietina (EPO) nel rene e comunica con l epatocita attraverso il fattore di crescita e differenziazione 15 (GDF15) e l omologo-1 della proteina twisted gastrulation (TWSG1), che inibiscono il segnale di BMP/SMAD all epcidina. Gli stimoli infiammatori, come interleuchina 6, inducono la sintesi di epcidina attraverso la via della janus chinasi/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione- 3 (JAK/STAT). TfR, recettore della transferrina; BMPR, recettore della BMP; IL-6R, recettore dell interleuchina 6. questi fattori, tuttavia, sembra essere necessario per mediare la riduzione di epcidina osservata con la somministrazione di EPO. E probabile che saranno identificati ulteriori fattori eritropoietici che inducono una regolazione negativa dell espressione di epcidina. Regolazione da parte dell ipossia Una ridotta espressione di epcidina è stata descritta in vivo come risposta all ipossia (58, 59). Questo effetto potrebbe essere in parte attribuibile all effetto dell ipossia sull espressione di EPO e quindi sull attività eritropoietica e/o, forse, a un interazione diretta con i recettori dell epatocita (51). Inoltre, le basse concentrazioni di epcidina osservate in risposta all ipossia si potrebbero attribuire a una stabilizzazione epato-specifica del fattore inducibile dall ipossia (HIF)-1, con effetti a valle sulla via di segnale BMP/SMAD (60-62). È ancora controverso se HIF si leghi direttamente al promotore dell epcidina. Tuttavia, esistono meccanismi indiretti attraverso i quali gli HIF possono regolare l espressione di epcidina. Un aumentata attività di HIF si associa all aumento del clivaggio di HJV mediato dalla matriptasi e, quindi, a una ridotta espressione di epcidina (62). Inoltre, la regolazione sistemica del ferro da parte dell asse epcidina-ferroportina agisce in armonia con il sistema di controllo dell omeostasi del ferro cellulare degli enterociti. I topi carenti di HIF-2α intestinale hanno una ridotta espressione sia di ferroportina che di trasportatore 1 di metalli bivalenti (DMT1), il principale importatore di ferro sulla superficie apicale degli 112 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

6 enterociti duodenali, e non sono quindi in grado di indurre l assorbimento di ferro anche in presenza di una ridotta espressione di epcidina (63). Questi dati indicano che in condizioni di ipossia (o di carenza di ferro), l espressione di HIF-2α promuove l assorbimento di ferro a livello intestinale mediante un incremento dell attività di DMT1 e ferroportina. Questo riscontro implica che le modificazioni sul trasporto del ferro indotte da HIF-2α possano prevalere sugli effetti indotti dall asse di regolazione epcidina-ferroportina. Regolazione da parte dell infiammazione L aumento dell espressione di epcidina da parte dell infiammazione è principalmente mediato dall interleuchina-6 (IL-6). L interazione a livello epatocellulare di IL-6 con il suo recettore attiva la via di segnale della janus chinasi/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione-3 (JAK/STAT) (59, 64-66). L espressione di epcidina è aumentata anche dallo stress ossidativo o da quello del reticolo endoplasmatico. Questa risposta indotta dallo stress può essere controllata dal fattore di trascrizione proteina H legante l elemento di risposta all AMP ciclico (67) o dai fattori di trascrizione inducibili dallo stress, proteina legante l amplificatore CCAAT (C/EBPα) e proteina omologa di C/EBP (68). La sottoregolazione di C/EBPα dipendente dall alcol, probabilmente attraverso le specie radicaliche dell ossigeno, potrebbe essere responsabile della riduzione dell espressione di epcidina e del conseguente (moderato) sovraccarico di ferro nei forti bevitori (69, 70). Interazione tra vie di regolazione dell epcidina L attivazione delle vie di regolazione dell epcidina sopradescritte dipende sempre dall interazione di fattori circolanti o autocrini con i recettori di membrana dell epatocita, allo scopo di controllare la produzione epatica di epcidina per un adeguato mantenimento dell omeostasi sistemica del ferro (44). Esistono numerose potenziali possibilità di comunicazione incrociata tra queste vie ed evidenze sperimentali dimostrano che queste vie, se rese completamente indipendenti una dall altra, non funzionano. Le concentrazioni di epcidina nel siero sembrano essere determinate dalla forza relativa dei singoli regolatori. Nel tentativo di delineare la forza relativa di questi nei pazienti con disturbi del metabolismo del ferro, abbiamo proposto un algoritmo per predire la concentrazione relativa di epcidina sulla base di alcuni parametri del siero [proteina C-reattiva (PCR), saturazione della Tf e recettore solubile della Tf], che riflettono infiammazione, sideremia e le vie di regolazione dell eritropoiesi (71). Questo algoritmo considera l interrelazione tra queste vie, dimostrando che l inibizione dell epcidina da parte dell eritropoiesi impatta pesantemente sulla sovraregolazione dell epcidina indotta dal ferro e che l infiammazione aumenta drasticamente l'epcidina, indipendentemente dallo stato marziale e dall attività eritropoietica. Questi riscontri concordano con i risultati di studi che dimostrano che un elevata richiesta di ferro da parte del compartimento eritroide limita l effetto di induzione di epcidina da parte di una concomitante risposta infiammatoria (50, 72-75). Altri studi hanno dimostrato che un eritropoiesi aumentata e/o inefficace limita l induzione di epcidina indotta dall aumento dei depositi corporei di ferro (52, 73). I lavori sull effetto di un difetto della via HFE/TfR2 sulla sovraregolazione di epcidina da parte dell infiammazione mostrano risultati contraddittori. Uno studio ha mostrato una risposta smorzata dell epcidina agli stimoli infiammatori in topi knock-out per la proteina HFE (76), mentre risultati di altri studi sugli stessi topi o su un paziente con una mutazione di HFE indicano che l induzione di epcidina da parte dell infiammazione è indipendente dalla proteina HFE (77, 78). È chiaro che in futuro sono necessari ampi e ben progettati studi per migliorare le nostre conoscenze su questa rete di regolazione dell epcidina nei diversi disturbi del metabolismo del ferro. METODI DI DETERMINAZIONE DELL EPCIDINA Fin dalla scoperta dell epcidina c è stato un notevole interesse per lo sviluppo di un saggio utilizzabile per la determinazione di questo ormone peptidico nei fluidi biologici. Un accurata determinazione delle concentrazioni di epcidina nel siero e nelle urine potrà migliorare la nostra comprensione dei disturbi del metabolismo del ferro e fornire un utile strumento per la diagnosi differenziale e la gestione clinica di tali malattie. Sfide nel dosaggio dell epcidina La quantificazione dell epcidina è complicata dalla sua tendenza ad aggregare e ad adsorbirsi ai materiali in plastica utilizzati in laboratorio (provette, pipette monouso, puntali), richiedendo pertanto l implementazione di robuste procedure di laboratorio (79). Inoltre, il progresso nello sviluppo di un saggio immunochimico convenzionale per l epcidina è stato ostacolato dalle difficoltà di generare anticorpi antiepcidina specifici in ospiti come i conigli. Questa difficoltà è dovuta alla struttura dell epcidina, piccola e compatta, che esprime pochi epitopi antigenici (Figura 1), e all alto grado di conservazione dell epcidina all interno di un ampio gruppo di specie, che diminuisce l elicitazione di una risposta immunitaria nell animale ospite (50). L interpretazione dei risultati dell esame epcidina potrebbe essere influenzata dalla specificità dei vari saggi, che possono rilevare l epcidina che circola libera, l epcidina legata a proteine di trasporto o entrambe le frazioni. Infine, la presenza delle isoforme dell epcidina- 22 e -20, che non svolgono alcun ruolo nella regolazione del metabolismo del ferro, può interferire con la quantificazione dell epcidina-25 nei saggi immunoassistiti che utilizzano anticorpi che reagiscono con tutte queste isoforme. biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

7 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS Saggi di prima generazione (semiquantitativi) In parecchi studi iniziali fu utilizzato un immunosaggio disponibile in commercio che misurava il precursore dell epcidina proepcidina nel siero invece del peptide con attività biologica (80). La pertinenza di questi studi è discutibile, per il fatto che le concentrazioni di proepcidina non correlano né con le concentrazioni urinarie di epcidina né con quelle sieriche e nemmeno con le attinenti risposte fisiologiche (71, 81-83). I primi saggi per misurare l'epcidina-25 biologicamente attiva sono stati un immunodot (59) e la spettrometria di massa (MS) SELDI-TOF (12, 15, 84). Tuttavia, questi saggi potevano essere utilizzati solo per una misura semiquantitativa dell epcidina. Saggi di seconda generazione (quantitativi) In anni recenti, un progresso sostanziale è stato ottenuto con l introduzione di uno standard interno per quantificare l epcidina-25 nel siero e nelle urine con un metodo TOF-MS aggiornato (13, 30). Inoltre, Ganz et al. (29) hanno sviluppato un saggio ELISA competitivo (celisa) per l epcidina umana nel siero. Altri gruppi hanno descritto saggi affidabili per l'epcidina, che si possono suddividere in tre metodologie principali: a) MS (85-95), b) saggi immunochimici, comprendenti RIA (96, 97) celisa (13, 29, 98, 99) ed ELISA tradizionali (100) e c) un saggio competitivo per il sito di legame dell epcidina alla ferroportina (43). Tra i saggi immunochimici attualmente disponibili in commercio per la misura dell epcidina nel siero, abbiamo trovato che il RIA e il saggio immunoenzimatico della ditta Bachem sono adeguati per differenziare tra la concentrazione di epcidina presente in campioni di siero di controlli e di pazienti con differenti disturbi del metabolismo del ferro, mentre il saggio per l epcidina biologicamente attiva della DRG Instruments forniva concentrazioni simili su tutti i campioni e non era in grado di discriminare i disturbi del metabolismo del ferro (risultati non pubblicati). Punti di forza e limiti dei saggi quantitativi per epcidina plasmatica e urinaria I metodi in MS richiedono una strumentazione relativamente costosa, ma hanno il vantaggio di discriminare tra epcidina-25, -22 e -20 (13). I saggi in ELISA determinano la concentrazione totale di epcidina, con differenti contributi da ciascuna di queste tre isoforme in funzione della specificità dell anticorpo. Tuttavia, questo limite potrebbe essere superato sfruttando anticorpi specifici per l epcidina-25 (100). Si dovrebbe però anche considerare che non è stata indagata sistematicamente la valenza della determinazione di epcidina-25 anziché dell epcidina totale per l assunzione di decisioni cliniche. Gli immunosaggi hanno le potenzialità per un utilizzo più ampio nei laboratori clinici. Inoltre, il numero di campioni processabili è molto probabilmente più alto con i saggi ELISA che con la MS. Tuttavia, i metodi MS possono essere automatizzati (101, 102) e dovrebbero essere ottimizzati per l epcidina, in quanto le caratteristiche amfipatiche del peptide lo portano a restare facilmente adeso ai dispositivi di plastica del laboratorio, soprattutto quando per volumi relativamente piccoli di campione si utilizzano provette grandi. I dati di confronto tra le caratteristiche analitiche dei vari saggi in letteratura sono incompleti, in quanto non tutti gli studi hanno riportato queste caratteristiche in accordo alle procedure STARD ( STAndards for the Reporting of Diagnostic accuracy studies ) (103) o validato i saggi descritti in accordo alle raccomandazioni sulle procedure analitiche della Conferenza Internazionale per l Armonizzazione (ICH) (104). Ciononostante, la comunità scientifica e medica è stata informata sulla situazione corrente e sul grado di accordo dei metodi per la determinazione dell epcidina grazie a un recente invio di campioni per la determinazione dell epcidina nelle urine e nel siero, il cosiddetto Round Robin 1, condotto a livello internazionale nel In questo studio la correlazione tra i metodi partecipanti era generalmente buona e sia la variabilità tra le misure del campione nei diversi laboratori che l imprecisione della maggior parte dei metodi era simile (105). Tuttavia, la concentrazione assoluta di epcidina era largamente differente tra i saggi. Quest ultima variazione non è sorprendente considerando l assenza di un metodo di riferimento (106) e di un calibratore commutabile validato o di altro materiale per l armonizzazione dei saggi. Queste differenze nell assegnazione del valore limitano la confrontabilità dei dati raccolti utilizzando metodi diversi e precludono la possibilità di definire intervalli di riferimento e livelli decisionali universali per l assunzione di decisioni cliniche. Pertanto, è stato promosso un secondo round robin per l epcidina plasmatica allo scopo di esaminare l armonizzazione dei risultati a livello globale, scambiandosi materiali sintetici per l armonizzazione del dosaggio e campioni nativi, i cui risultati sono attesi a breve. La determinazione dell epcidina urinaria può essere allettante, soprattutto per l utilizzo in ricerca e l esecuzione dell esame nei bambini e nei pazienti di paesi in via di sviluppo, in quanto questa matrice consente di raccogliere il campione in maniera non invasiva. Tuttavia, sebbene sia stata trovata una correlazione significativa tra le concentrazioni di epcidina in campioni siero-urina appaiati di controlli sani e di pazienti con disordini del metabolismo del ferro (12, 29, 107), le concentrazioni di epcidina urinaria non sempre riflettono accuratamente le concentrazioni di epcidina nel siero. L interpretazione dei dati di epcidina urinaria è difficile perchè la concentrazione urinaria dipende anche da filtrazione glomerulare, riassorbimento tubulare, produzione topica a livello delle cellule epiteliali tubulari (25) e produzione da parte delle cellule infiammatorie interstiziali (108). Questi problemi rendono piuttosto svantaggiosa la determinazione dell epcidina nelle urine rispetto al siero, implicando che, 114 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

8 per un interpretazione attendibile della concentrazione di epcidina urinaria come alternativa alla sua concentrazione sierica, sono necessarie informazioni sulla produzione e le trasformazioni che l epcidina subisce a livello renale. Inoltre, in uno studio precedente abbiamo trovato una variabilità preanalitica relativamente alta nella determinazione dell epcidina urinaria (107). Un altro potenziale svantaggio della determinazione dell epcidina nelle urine è la sua suscettibilità all ossidazione (30) e la concentrazione relativamente elevata delle isoforme più piccole dell epcidina, che non si riescono a distinguere dall epcidina-25 con la maggior parte degli immunosaggi. In generale, ci si dovrebbe ricordare di queste limitazioni durante l interpretazione dei dati di epcidina urinaria e prima di decidere di sviluppare strumenti point-of-care dedicati alla sua determinazione. Intervalli di riferimento dell epcidina sierica Piccoli e grandi studi su controlli sani hanno rivelato una considerevole variabilità interindividuale della concentrazione di epcidina, che esita in intervalli di riferimento ampi (12, 29, 96, 97, 107, 109). Questa situazione suggerisce che l impiego di intervalli di riferimento possa mostrare dei limiti quando utilizzati per l interpretazione della concentrazione di epcidina nel singolo individuo. Ne consegue che i valori di epcidina, come quelli di altri ormoni, dovrebbero essere interpretati nel contesto di altri indici del metabolismo del ferro. Ad esempio, è possibile che una concentrazione normale di epcidina in corso di anemia da carenza di ferro (IDA) sia in realtà inappropriatamente elevata e mantenga nel tempo la restrizione di ferro. Gli ampi intervalli di riferimento si possono attribuire, almeno in parte, all aumento delle concentrazioni di epcidina durante il giorno (12, 29, 96, 97, 107). Questo apparente ritmo circadiano delle concentrazioni di epcidina è forse regolato da fattori di trascrizione, come le proteine USF ( upstream stimulatory factors ) e c- Myc/Max, che si legano con sequenze simmetriche di DNA, dette E-boxes (110). I geni che vengono regolati mediante queste sequenze E-boxes, comprendenti i geni clock responsabili del ritmo circadiano, quali l omologo del gene period 1 (Drosofila) (PER1), l omologo del gene timeless (Drosofila) (TIMELESS) e l omologo del gene clock (topo) (CLOCK), tendono a essere sotto controllo di trascrizione ritmico circadiano. Tuttavia, la variazione circadiana nelle concentrazioni di epcidina potrebbe essere anche secondaria, in quanto influenzata dall introduzione di ferro durante il giorno. Pertanto, negli studi clinici che si avvalgono di determinazioni di epcidina, raccomandiamo di standardizzare l ora del prelievo per ridurre al minimo la variabilità intra-individuale e preanalitica. Finora non sono state rilevate differenze sistematiche nella concentrazione di epcidina tra i sessi (12, 29, 85, 96, 97, 107). Abbiamo recentemente definito per l epcidina sierica gli intervalli di riferimento stratificati per sesso ed età in un gruppo di riferimento selezionato a partire da un ampio e fenotipicamente ben definito campione di popolazione generale della città olandese di Nimega (109). Abbiamo osservato concentrazioni di epcidina sierica più basse nelle donne in premenopausa che nelle donne in menopausa (mediana, 4,1 nmol/l vs. 8,5 nmol/l) (109). Negli uomini, le concentrazioni di epcidina si mantenevano costanti a tutte le età (mediana, 7,8 nmol/l). In questo studio l epcidina sierica era strettamente associata con la ferritina sierica sia negli uomini che nelle donne, confermando i riscontri di precedenti studi più piccoli (29, 30, 107, 111, 112). La concentrazione di epcidina non è stata sistematicamente confrontata tra le diverse etnie ed esistono pochi studi nei bambini ( ). A quanto ci risulta, sono disponibili in letteratura due studi sulla concentrazione di epcidina nelle donne gravide; entrambi hanno dimostrato che la concentrazione di epcidina nelle gravide anemiche è più bassa che nelle gravide senza anemia, ma non correla con l epcidina del sangue di cordone o del neonato o con altri parametri del ferro fetale (114, 121). Come precedentemente discusso, le concentrazioni basali di epcidina dipendono molto dal metodo utilizzato per la sua determinazione (105). Questa situazione implica che, fino a quando non si raggiungerà un armonizzazione dei risultati, si dovrebbero utililizzare intervalli di riferimento e livelli decisionali metodospecifici. L armonizzazione dei metodi mediante l impiego di calibratori affidabili o di altri materiali utili all armonizzazione permetterrà agli esperti di medicina traslazionale e ai clinici di definire insieme a livello internazionale i criteri per l utilizzo dei saggi di epcidina nella diagnosi, stadiazione, monitoraggio e valutazione delle indicazioni al trattamento dei disturbi del metabolismo del ferro. L EPCIDINA NEI DISORDINI DEL METABOLISMO DEL FERRO Lo sviluppo e la validazione dei metodi per la misura dell epcidina hanno preparato la strada a un ampio numero di studi sull uomo, che hanno considerevolmente aumentato le nostre conoscenze della fisiologia e della fisiopatologia dell omeostasi del ferro e, inoltre, hanno dimostrato promettenti applicazioni diagnostiche per l epcidina in medicina (Tabella 1). Disturbi associati a carenza di epcidina Emocromatosi ereditaria L emocromatosi ereditaria (HH) comprende diversi disturbi genetici dell omeostasi del ferro caratterizzati da un eccesso di ferro nell organismo. Questo causa un sovraccarico di ferro corporeo, che può progredire verso un danno d organo, come fibrosi e cirrosi epatica (122). I pazienti con la maggior parte delle forme di HH mostrano incapacità di sovraregolare adeguatamente la sintesi di epcidina in risposta all aumento dei depositi di biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

9 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS ferro. Questa mancanza di regolazione è causata da difetti di certi geni che codificano per proteine che regolano positivamente l epcidina (HFE, TfR2, HJV) o, raramente, del gene stesso dell epcidina [peptide antimicrobico epcidina (HAMP)] (123, 124). In questi pazienti, la condizione di epcidina bassa rispetto alla ferritina determina un incremento dell assorbimento intestinale di ferro e un sovraccarico di ferro corporeo ( ). La concentrazione di epcidina in pazienti con rare forme giovanili di HH non trattate tende a essere bassissima (127). Anche mutazioni del gene che codifica per la ferroportina, proteina che trasporta il ferro fuori dalla cellula, possono causare HH. Tuttavia, ci sono due classi di mutazioni della ferroportina con differenti conseguenze a livello di fenotipo: perdita di regolazione dell epcidina e perdita di funzione della ferroportina (36, ). Il primo difetto porta a un aumentata attività della ferroportina e quindi viene spesso descritto come mutazione della ferroportina con guadagno funzionale. Come atteso, i pazienti con queste mutazioni hanno un fenotipo simile alla HH classica. Tuttavia, poiché il difetto è a valle dell epcidina, questi pazienti non hanno concentrazioni di epcidina basse. Si è scoperto che questi pazienti, dopo un salasso terapeutico che normalizzava i depositi di ferro (come documentato dalla ferritina sierica), avevano nel siero concentrazioni di epcidina o valori del rapporto epcidina/ferritina entro o al di sopra degli intervalli di riferimento (128, 131). Le concentrazioni di epcidina relativamente elevate in alcuni pazienti potevano essere una conseguenza della saturazione della Tf, che rimaneva elevata nonostante il salasso. Al contrario, le mutazioni genetiche che determinano una perdita di funzione della ferroportina causano un sovraccarico di ferro cellulare dovuto alla compromissione del trasporto del ferro all esterno. Tali pazienti, quindi, hanno alcune caratteristiche fenotipiche che variano rispetto a quelle della HH classica ed è stato descritto che, qualora non siano trattati, presentano elevate concentrazioni di epcidina urinaria (127). E stato dimostrato che i pazienti con la mutazione C282Y del gene HFE carenti di ferro hanno bassissime concentrazioni di epcidina sierica, che riflettono gli effetti combinati della mutazione HFE e del salasso terapeutico sull espressione di epcidina (125, 132). Questi pazienti hanno dimostrato dopo carico orale di ferro un incremento esagerato della sideremia (132). Questa osservazione pone ulteriormente l attenzione sul fatto che nei pazienti con HH la riduzione della concentrazione di epcidina da salasso possa esacerbare la condizione fisiopatologica sottostante, esasperando l eccessivo rilascio di ferro in circolo, con un conseguente circolo vizioso che rende necessari salassi Tabella 1 Applicazioni diagnostiche più promettenti della determinazione dell epcidina nel siero Malattia Concentrazione attesa di epcidina Potenziale valore aggiunto della determinazione dell epcidina Emocromatosi ereditaria classica Anemia con accumulo di ferro Bassa (nel tempo può essere compensata dall accumulo di ferro) Bassa (nel tempo può essere compensata dall accumulo di ferro trasfusionale) Screening Predire quali omozigoti sono a rischio di sovraccarico di ferro Determinare l intervallo tra i salassi Stabilire una priorità tra i geni da investigare Identificare i pazienti con forme più severe Predire e monitorare l accumulo di ferro (parenchimale) Forme acquisite di sovraccarico di ferro Variabile Marcatore di perdita della regolazione del metabolismo del ferro IDA refrattaria al ferro Inappropriatamente alta Selezionare il difetto primario di regolazione dell epcidina Infiammazione e infezione Alta Diagnosi differenziale tra ACD e IDA Guida alla terapia di supplementazione con ferro Malattia renale cronica Alta, scende in trattamento con EPO Predire la risposta all EPO Guida al trattamento con EPO e ferro per via endovena Danno renale acuto Bassa (urine) Diagnosi di danno renale acuto Trattamento con antagonisti e agonisti dell epcidina Dipende dalla patologia ACD, anemia da malattia cronica; IDA, anemia da carenza di ferro; EPO, eritropoietina. Monitorare e valutare le indicazioni terapeutiche 116 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

10 di mantenimento più frequenti (125, 126). Prevediamo le seguenti potenziali applicazioni della determinazione di epcidina nei pazienti con conferma o sospetto diagnostico di HH: a) selezionare la presenza di HH nei pazienti con concentrazioni di ferritina elevate, b) definire la priorità dei geni da indagare (una concentrazione di epcidina molto bassa indirizza verso forme di HH giovanile), c) predire quali pazienti omozigoti per la mutazione C282Y saranno a rischio di sovraccarico di ferro e d) monitorare il trattamento con salassi (123, 133). Anemie con accumulo di ferro Nelle anemie congenite con accumulo di ferro, come la β-talassemia (maggiore e intermedia) e l anemia diseritropoietica congenita I e II, ma anche nelle forme acquisite come la sindrome mielodisplastica tipo RA (anemia refrattaria) e tipo RARS (RA con sideroblasti ad anello), l eritrone patologico induce la perdita della regolazione dell omeostasi del ferro inibendo la sintesi di epcidina, anche in presenza di accumulo di ferro ( ). Si è scoperto anche che il rapporto epcidina/ferritina è basso nei pazienti con questi disturbi (135, 137, 138, ). Sembra quindi che le conseguenze di un eritropoiesi inefficace sull espressione di epcidina siano più forti delle conseguenze dell eccesso di scorte di ferro. Nell anemia falciforme, i pazienti mostrano l ulteriore fattore confondente dell infiammazione. Potrebbe darsi che l aumento di epcidina conseguente ai segnali di infiammazione attenui la tossicità del ferro rispetto a quanto sarebbe altrimenti osservato nei pazienti con anemia falciforme (141, 143). Nei pazienti con forme ereditarie di anemia, l informazione relativa alle concentrazioni di epcidina potrebbe avere valore per identificare i pazienti affetti dalle forme più severe e per predire e monitorare l accumulo di ferro nei parenchimi. Forme acquisite di sovraccarico di ferro Numerose epatopatie non ereditarie, come l eccessivo consumo di alcol, la steatosi non alcolica e la steatoepatite non alcolica, si associano a un moderato sovraccarico di ferro epatico. In queste malattie, cosiddette da sovraccarico di ferro non da emocromatosi, la concentrazione di epcidina è aumentata, ma rimane relativamente bassa rispetto al grado di sovraccarico di ferro suggerendo un inefficace rilevazione del ferro epatico. In queste condizioni, l alterata regolazione della sintesi di epcidina per effetto delle specie reattive dell ossigeno, dello stress del reticolo endoplasmatico e della via mediata dalla citochina fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) può contribuire a ridurre relativamente la sintesi di epcidina e ad accumulare ferro (59, 67-70, 144). La determinazione dell epcidina nel siero può risultare utile come marcatore di alterata regolazione del ferro in queste forme di sovraccarico di ferro. Anemie da carenza di ferro Nei pazienti con IDA, e anche nei pazienti senza anemia ma con basse concentrazioni di ferritina secondarie a perdite di sangue o insufficiente apporto dietetico, si sono trovate concentrazioni di epcidina molto basse, spesso inferiori al limite di rilevabilità dei saggi utilizzati per la sua determinazione (13, 29). Effetto della somministrazione di ferro sulle concentrazioni di epcidina Numerosi studi hanno valutato la relazione tra assorbimento del ferro e concentrazione di epcidina. In soggetti volontari sani l epcidina aumentava nel siero e nelle urine dopo una dose di ferro per os, benchè siano stati descritti soggetti non responsivi (29, 59, 112, ). Alcuni studi riportano una debole ma significativa correlazione negativa tra concentrazioni di epcidina nel siero e assorbimento di ferro (112, 146, 147). Questi risultati suggeriscono che la quantificazione delle concentrazioni sieriche di epcidina potrebbe essere predittiva dell effetto terapeutico della somministrazione di ferro per os. Inoltre, la risposta dell epcidina al ferro orale potrebbe risultare un utile esame per valutare l assorbimento del ferro in presenza di carenza di ferro. Disturbi associati a eccesso di epcidina IDA refrattaria al ferro La maggior parte dei pazienti con IDA refrattaria al ferro sono resistenti alla supplementazione alimentare di ferro a causa di un difetto del gene TMPRSS6 che codifica per la matriptasi-2. D altro canto, è stato segnalato che ripetute somministrazioni endovenose di ferro aumentano (parzialmente) l emoglobina e il volume globulare medio (119, 120, ). La perdita di attività di matriptasi-2 determina un incapacità di ridurre la sintesi di epcidina in presenza di carenza di ferro (49). Di conseguenza, i pazienti hanno un innato aumento delle concentrazioni di epcidina e, come risultato di questo aumento, percentuali di saturazione della Tf estremamente basse e concentrazioni di ferritinemia comprese nella parte inferiore dell intervallo di riferimento ( , ). Pertanto, la determinazione della concentrazione di epcidina può servire a escludere o a porre il sospetto di carenza di matriptasi-2 in corso di IDA non spiegabile e quindi aiutare a evitare il moltiplicarsi di esami diagnostici e un trattamento tardivo o inefficace. Malattie infettive e infiammatorie Le infezioni sono associate a marcate variazioni dell omeostasi del ferro (152). L anemia associata alla malaria si associa a ridotta sideremia e aumentate concentrazioni di epcidina, determinando il trattenimento del ferro nel sistema RE che, in ultima analisi, porta a un eritropoiesi ferro-carente (115, 118, ). È possibile che questo incremento delle concentrazioni di epcidina risulti vantaggioso perché protettivo contro la biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

11 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS crescita extracellulare di microrganismi a causa della riduzione delle scorte extracellulari di ferro. D altra parte, un aumento delle concentrazioni di epcidina può indurre carenza di ferro e limitare l efficacia dei programmi di fortificazione di ferro riducendone l assorbimento (157). Al contrario, le aumentate concentrazioni di epcidina osservate in corso di infiammazione potrebbero aumentare la virulenza dei batteri, che dipendono dal ferro dei macrofagi per la loro proliferazione all interno di queste cellule (ad es., Salmonella e Micobatteri). Tali patogeni sono comuni nelle regioni a malaria endemica. Forse, in queste zone, una supplementazione di ferro non mirata tra i bambini non carenti di ferro potrebbe causare severi effetti collaterali aumentando la proliferazione di patogeni latenti (158). É stato dimostrato che l epcidina è importante anche nella patogenesi di altri agenti infettivi. Nei pazienti con epatite da virus C, si è osservato un aumento sia della saturazione della transferrina che delle concentrazioni di ferritina sierica e di ferro epatico. Coerentemente con questo accumulo di ferro, in questi pazienti è stata trovata una bassa concentrazione di epcidina insieme ad altre modifiche nell espressione dei geni del trasporto del ferro (159). In uno studio pediatrico non è stata trovata alcuna relazione tra infezione da Helicobacter pylori ed epcidina, né tra le concentrazioni di citochine ed epcidina, indicando che, in età pediatrica, l infiammazione indotta da Helicobacter non influenza lo stato marziale mediante aumento della produzione di epcidina (118). In corso di ACD, IL-6 e altre citochine inducono un aumento delle concentrazioni di epcidina, determinando il sequestro di ferro nei macrofagi con conseguente iposideremia. Successivamente, la disponibilità di ferro per l eritrone diviene un fattore limitante che contribuisce allo sviluppo di ACD (59, 75, 81, 160, 161). I soggetti anziani spesso soffrono di anemia. In un recente studio, la presenza di anemia in individui anziani ( 65 anni) non si è potuta attribuire a un aumento delle concentrazioni di epcidina, in quanto la concentrazione di epcidina urinaria era significativamente più bassa tra i partecipanti allo studio con infiammazione, anemia e carenza di ferro in confronto ai controlli non anemici (162). Questo riscontro aumenta la possibilità che, in questa popolazione, meccanismi indipendenti dall epcidina possano causare iposideremia e anemia da infiammazione e/o che anche concentrazioni di epcidina altrimenti normali siano sufficienti a sostenere l anemia una volta che questa si è instaurata (162). Al momento, non esiste alcun esame di laboratorio che da solo sia in grado di differenziare in via definitiva ACD da IDA (160, 163). La diagnosi differenziale tra queste condizioni è spesso raggiunta combinando vari marcatori biochimici del metabolismo del ferro. Gli studi per delineare il ruolo dell epcidina nella ACD sono complicati dalla mancanza di un criterio diagnostico assoluto. Ne deriva che gli esiti degli studi per definire il valore diagnostico dell epcidina si sono basati in larga misura sulla definizione di criteri surrogati. Alcuni studi hanno dimostrato che l epcidina è un marcatore appropriato per la diagnosi differenziale tra ACD e IDA/ACD, ma non tra IDA e IDA/ACD (75), mentre altri studi hanno riportato che l epcidina permetteva di distinguere IDA da IDA/ACD, ma non ACD da IDA/ACD (13, 164). I risultati di un altro studio hanno suggerito che le concentrazioni di epcidina possono servire come marcatore appropriato per differenziare tra loro tutti e tre i gruppi di patologie (165). Sembra che la determinazione di epcidina rivesta una potenziale utilità negli algoritmi diagnostici per distinguere IDA da ACD e dalla presenza combinata di IDA/ACD. Ulteriori studi nei quali si utilizzasse la risposta dell epcidina alla supplementazione di ferro come criterio surrogato di stato marziale potrebbero essere informativi. La determinazione dell epcidina può anche risultare utile nel predire gli effetti della supplementaztione di ferro nelle malattie infettive e infiammatorie. Malattie renali L introduzione degli ESA, come ad esempio l EPO, ha permesso di trattare efficacemente l anemia nei pazienti con CKD. Tuttavia, la concentrazione di emoglobina da utilizzare come obiettivo ottimale è ancora dibattuta e molti pazienti diventano resistenti agli ESA. Subito dopo la sua scoperta e durante gli anni a seguire, l epcidina venne riconosciuta come potenzialmente importante nella CKD, in quanto può essere la responsabile dello squilibrio tra omeostasi del ferro e resistenza agli ESA che si osserva frequentemente in questi pazienti (50, 166). Perciò l epcidina fu descritta come un promettente marcatore diagnostico d accompagnamento per predire la responsività agli ESA e guidare il trattamento con ESA e ferro endovena. Inoltre, la potenzialità che l epcidina divenisse un bersaglio per il trattamento fu rapidamente riconosciuta. Queste promesse prendevano corpo da un ampia serie di studi che avevano esaminato le concentrazioni di epcidina in pazienti con CKD. In generale, questi studi avevano riportato un aumento delle concentrazioni di epcidina nei pazienti con CKD in confronto ai controlli sani (15, 16, 29, 31, 32, 88, 89, 96, ). Poiché questi pazienti tendono a essere anemici, anche un moderato eccesso di epcidina si può considerare ingiustificatamente alto per il loro grado di anemia. Praticamente tutti gli studi sull epcidina in pazienti con CKD hanno dimostrato una robusta correlazione positiva tra concentrazioni di epcidina e ferritina. Alcuni di questi studi hanno anche dimostrato che l epcidina correla con la sideremia o con la saturazione della Tf (169, 170). L epcidina nella CKD è stata anche associata a eritropoiesi ferro-carente, come rispecchiato dalla relazione tra epcidina ed emoglobina e/o conta reticolocitaria più basse (31, 169, 171). Inoltre, si è visto che nell ambito dell insufficienza renale CRP e IL-6 erano marcatori predittivi meno adeguati (16, 170, ). Si è scoperto che la somministrazione di ferro endovena non influenzava la concentrazione di epcidina 118 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

12 in pazienti in emodialisi (HD) che erano stati esclusi dalla terapia a base di ferro ed ESA nelle due settimane precedenti lo studio (169), mentre la aumentava in pazienti con CKD mai trattati con ferro (31, 96). Nei pazienti in HD in terapia con ESA, l epcidina non risultava predittiva di quali pazienti avrebbero aumentato la loro emoglobina dopo carico di ferro (17). Come detto precedentemente, numerosi ricercatori hanno descritto una riduzione delle concentrazioni di epcidina dopo somministrazione di EPO (31, 50, 169, 170). Questi riscontri suggeriscono una volta di più che la richiesta di ferro dal compartimento eritroide potrebbe essere un regolatore dell espressione dell epcidina più potente della formazione di epcidina indotta dall infiammazione o dal ferro stesso. Per giungere a una corretta interpretazione dell effetto dello stimolo eritropoietico sulla produzione di epcidina, le concentrazioni di EPO ed epcidina dovrebbero essere valutate simultaneamente in pazienti selezionati con anemia da CKD. E interessante notare che l epcidina è stata valutata anche come marcatore predittivo della risposta agli ESA in parecchi, anche se relativamente piccoli, studi condotti sull uomo. Uno studio ha rivelato che le concentrazioni di epcidina dei soggetti responsivi all EPO non differivano da quelle dei soggetti scarsamente responsivi (176), mentre studi osservazionali trasversali su pazienti in HD e uno studio prospettico su pazienti con CKD e insufficienza cardiaca cronica hanno rivelato che i non responsivi avevano basse concentrazioni di epcidina (32, 170, 177). Forse in questi pazienti si dovrebbe considerare l epcidina come un marcatore di risposta piuttosto che di resistenza al trattamento con ESA. Benchè l epcidina sia un promettente ausilio diagnostico per la terapia con ESA, i pazienti con insufficienza renale sono una popolazione piuttosto complessa, sulla quale è difficile ottenere risultati consistenti (175). Stabilità clinica, momento del campionamento in relazione alla terapia con ferro ed ESA, posologia del ferro e dell EPO e regimi dialitici differiscono tra uno studio e l altro e probabilmente influenzano i risultati. Pertanto, c è bisogno di ulteriori studi che valutino la concentrazione sierica di epcidina in più ampie e ben definite popolazioni per risolvere le discrepanze sopra menzionate presenti in letteratura. Oltre alle sue potenzialità come marcatore del metabolismo del ferro nei pazienti con CKD, la combinazione delle concentrazioni di epcidina sierica e urinaria può servire come marcatore della malattia renale di per sé. Per esempio, studi indicano che incrementi di epcidina urinaria più piccoli rispetto a quelli attesi in base alle concentrazioni di epcidina sierica possono associarsi con un rischio maggiore di danno renale acuto dopo un intervento di bypass dell arteria coronarica in pazienti con funzione renale stabile (178, 179). In uno studio su marcatori urinari in pazienti con nefrite lupica, le concentrazioni urinarie di epcidina, forse secreta dalle cellule infiammatorie interstiziali, erano identificate come marcatore di recrudescenza renale della nefrite lupica (108). Malattie correlate all obesità Il tessuto adiposo è un organo endocrino attivo che rilascia diverse citochine e adipochine, che contribuiscono allo sviluppo di infiammazione sistemica di basso grado. Inoltre, anche il tessuto adiposo può produrre epcidina (21). L infiammazione a basso grado nei pazienti obesi e in quelli con sindrome da sovraccarico di ferro associata alle malattie dismetaboliche (caratterizzata dall associazione di aumento dei depositi di ferro corporeo con alterazioni metaboliche) si associa con elevate concentrazioni di epcidina, che inducono uno scarso assorbimento di ferro e causano ACD (116, 117, 180, 181). In individui con perdita di peso si è osservata una ridotta concentrazione sierica di epcidina e un aumento dello stato marziale e dell assorbimento intestinale del ferro (182, 183). Quindi, in condizioni di moderata infiammazione cronica, quali obesità o sindrome metabolica, anche un moderato eccesso di epcidina può essere sufficiente a sbilanciare l equilibrio tra perdita e acquisizione di ferro verso la carenza di ferro. Malattie cardiache L anemia da insufficienza cardiaca cronica è associata a basse concentrazioni di epcidina, per cui è poco probabile che l infiammazione (di basso grado) sia l unico meccanismo sottostante (184, 185). Uno studio sull ischemia miocardica acuta ha dimostrato un aumento transitorio della concentrazione sierica di epcidina-20 nella maggior parte dei pazienti studiati, mentre l epcidina-25 rimaneva elevata per sette giorni dopo l evento. Gli autori concludevano che l epcidina-20, piuttosto che l epcidina-25, potrebbe essere d aiuto per la diagnosi di IMA (14). Numerosi lavori suggeriscono l uso potenziale della determinazione di epcidina nella definizione del rischio cardiovascolare. Si è ipotizzato che elevate concentrazioni di epcidina possano aumentare il rischio cardiovascolare incrementando la concentrazione di ferro intracellulare nei macrofagi e quindi il loro potenziale aterogenico ( ). Inoltre, studi recenti hanno dimostrato un aumentata produzione di epcidina in pazienti con infiammazione (di basso grado), obesità e steatosi epatica non alcolica, condizioni tradizionalmente associate alla malattia cardiovascolare (21, 144, 190, 191). Altri dati indicano un attività aterogenica dell epcidina in uno studio che rivelava che il trattamento ex vivo con epcidina-25 di monociti in differenziazione prelevati da pazienti con sindrome metabolica induceva la proteina-1 chemoattrattiva dei monociti (192). In questi pazienti le concentrazioni di epcidina si associavano con elevate concentrazioni di proteina-1 chemoattrattiva dei monocliti e con danno vascolare. Queste osservazioni supportano la possibilità che l epcidina possa rappresentare un nuovo determinante del rischio di malattia cardiovascolare. biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

13 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS Tumori maligni I pazienti affetti da cancro spesso soffrono di anemia, generalmente in associazione con altri indicatori di infiammazione. Studi su pazienti affetti da mieloma multiplo suggeriscono che in questi pazienti l epcidina sia sovraregolata da parte di meccanismi sia dipendenti che indipendenti dall IL-6, che possono rivestire un ruolo anche nell anemia frequentemente osservata in questi pazienti. La via indipendente dall IL-6 si può attribuire alle elevate concentrazioni di BMP2, che, come è stato suggerito, agiscono in maniera sinergistica con IL-6 nell induzione della sintesi epatica di epcidina (193, 194). Abbiamo recentemente dimostrato che nel linfoma di Hodgkin l elevata produzione di IL-6 si associa all induzione di epcidina che contribuisce all ACD ferrolimitata frequentemente osservata alla diagnosi (195). Tuttavia, in questo studio l elevata concentrazione di epcidina non sembrava sufficiente a sviluppare anemia, indicando che la compensazione dell aumento di attività eritropoietica attraverso l incremento della produzione di EPO potrebbe spiegare la mancanza di anemia nei pazienti neoplastici nonostante l aumento delle concentrazioni di epcidina (196). In uno studio su pazienti neoplastici anemici in terapia con ESA, quelli con concentrazioni basali di epcidina relativamente basse mostravano una risposta migliore (197). Sorprendentemente, questi risultati non sono del tutto coerenti con quelli rilevati in pazienti con CKD, ma indicano che le concentrazioni basali di epcidina potrebbero rivestire il ruolo potenziale di marcatore predittivo nell identificare sia i pazienti che risponderanno adeguatamente alla terapia con EPO, che quelli che devono essere esclusi dal trattamento dell anemia con ESA a causa della bassa probabilità di risposta. Benchè il numero di studi sul ruolo dell epcidina nell anemia in pazienti neoplastici sia limitato, questi studi hanno contribuito alla nostra conoscenza dei meccanismi coinvolti. In futuro sono necessari studi che definiscano il ruolo dell epcidina nell assunzione delle decisioni cliniche in questi pazienti. Medicina dello sport Neglii atleti si registra un elevata prevalenza di carenza di ferro. Un insieme di meccanismi generati dall esercizio, che comprendono emolisi, ematuria, sudorazione e stillicidio gastrointestinale, può contribuire a questo ridotto stato marziale (198). Recentemente, la maggior parte degli studi ( ), ma non tutti (202), ha dimostrato un incremento delle concentrazioni di epcidina urinaria dopo esercizio fisico. Questi riscontri di incremento delle concentrazioni di epcidina hanno indotto Peeling a proporre che gli aumenti di emolisi e di espressione dell epcidina indotti dall esercizio possano avere due effetti (203). Primo, la captazione di ferro libero da parte dei macrofagi del sistema RE dopo l esecizio porterebbe all intrappolamento di ferro all interno di queste cellule a causa dell azione dell epcidina sul trasporto mediato da ferroportina, influendo così sul ricircolo di ferro nel torrente circolatorio. Secondo, l elevata attività di epcidina dopo esecizio potrebbe ridurre l assorbimento del ferro alimentare (203). L epcidina potrebbe dunque essere un mediatore dell elevata incidenza di carenza di ferro tra gli atleti. SOSTANZE CHE MODULANO L EPCIDINA Terapie mirate sull epcidina possono migliorare le opzioni terapeutiche per i pazienti che soffrono di disordini del metabolismo del ferro. Benché specifiche terapie mirate non siano ancora disponibili, sono in fase di sviluppo diverse sostanze che funzionano come agonisti o antagonisti dell epcidina ( ). Gli agonisti dell epcidina potrebbero risultare utili nella prevenzione dell accumulo di ferro causato dalla carenza di epcidina, come avviene nella HH e soprattutto nella β-talassemia e nelle altre anemie con accumulo di ferro, e forse in alcune forme acquisite di malattie da sovraccarico di ferro non dipendendente dall emocromatosi. D altro canto, ci si potrebbe aspettare che degli antagonisti dell epcidina beneficino i pazienti con malattie da eccesso di epcidina che si manifestano con anemia ferro-carente e carenza sistemica di ferro, quali ad esempio IDA refrattaria al ferro, ACD (da malattie reumatiche, infiammatorie intestinali, autoimmuni), CKD, mieloma multiplo e altre neoplasie, carenza di ferro correlata all obesità e malattia cardiovascolare. Agonisti dell epcidina Studi preclinici e alcuni studi clinici hanno fornito la dimostrazione che epcidina-25 sintetica, piccoli peptidi di epcidina (le cosiddette miniepcidine ), agonisti di BMP e antagonisti di HIF possono prevenire l accumulo di ferro attribuito alla carenza di epcidina. E stato dimostrato che nei topi i piccoli peptidi di epcidina agiscono in vivo come agonisti per mezzo del loro dominio amminoterminale (206). Gardenghi et al. hanno segnalato che, in topi con β-talassemia intermedia, la sovraespressione transgenica di epcidina riduceva l accumulo di ferro e migliorava anche l eritropoiesi inefficace (207). Si può anche indurre l epcidina e aumentare la sua concentrazione utilizzando come bersaglio la via della BMP (Figura 4). Si è scoperto che, nei topi, la somministrazione di BMP2 aumenta l espressione di epcidina nel fegato e riduce la concentrazione sierica di ferro in vivo (208). E stato anche descritto che, in un modello murino di emocromatosi HFE, dosi sovrafisiologiche di BMP6 esogena per 10 giorni miglioravano la carenza di epcidina, riducendo la sideremia e ridistribuendo il ferro tissutale alle sedi di deposito appropriate (macrofagi del RE, milza) (209). Gli antagonisti di HIF sono utilizzati in oncologia per inibire l angiogenesi tumorale (210). Il blocco di HIF potrebbe essere anche utile per aumentare le concentrazioni di epcidina nelle malattie da accumulo di ferro. 120 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

14 Antagonisti dell epcidina Studi preclinici e clinici hanno dimostrato che antagonisti dell epcidina, quali anticorpi anti-epcidina, antagonisti di BMP, anticorpi anti-recettore delle citochine e stabilizzatori di HIF, possono ridurre l espressione di epcidina e correggere le anomalie del ferro (208, ). In uno studio preclinico su modelli animali, Sasu et al. hanno neutralizzato l epcidina con un anticorpo monoclonale in un modello murino di Brucella abortus con anemia da infiammazione e hanno scoperto che questo ristabiliva la responsività all EPO (211). Il risultato di questo studio indica che la somministrazione di terapie anti-epcidina da sole o in combinazione con ESA può migliorare la risposta eritropoietica dei pazienti e permette di utilizzare dosi più basse di EPO per evitare l effetto potenzialmente dannoso di alte concentrazioni di EPO. Va sottolineato che il monitoraggio nel siero dell epcidina biologicamente attiva durante il trattamento con questi antagonisti dell epcidina sembra essere complicato dall interferenza di queste sostanze sui saggi utilizzati (219). Numerosi composti possono interferire con la via BMP/SMAD. Nel topo, la somministrazione di dorsomorfina, un inibitore del segnale di BMP di piccole dimensioni, preveniva l induzione di epcidina da parte del ferro (212). GDF15 e TWSG1 sono entrambi antagonisti di BMP prodotti dagli eritroblasti e componenti putative del cosiddetto regolatore eritroide (l insieme di segnali solubili che mettono in comunicazione midollo e mucosa duodenale, NdT) che possono inibire l espressione di epcidina in vitro. Benché rimanga da definire l esatto ruolo fisiologico di GDF15 e TWSG1, queste proteine potrebbero possedere delle potenzialità terapeutiche. La HJV solubile, che a sua volta agisce come antagonista dei meccanismi di segnale di BMP, nei topi riduce l espressione basale di epcidina, mobilizza i depositi di ferro del sistema RE (milza), aumenta il contenuto di ferro nel fegato e allo stesso tempo, la sua concentrazione sierica (208). Ancora, è stato recentemente dimostrato che l eparina e i suoi derivati inibiscono l espressione di epcidina in vitro e in vivo interferendo con i meccanismi di segnale di BMP (218). E stato dimostrato che nella malattia di Castleman (un raro disordine con infiammazione sistemica e anemia), l anticorpo anti-recettore di IL-6 (tocilizumab) sopprime la produzione di epcidina indotta da IL-6 e (in scimmie artritiche) migliora l anemia ( ). Gli inibitori dei promotori chiave della risposta all ipossia cellulare, come la prolil-idrossilasi, prevengono l inattivazione e la degradazione di HIF e, pertanto, possono essere efficaci soppressori dell epcidina e ristabilire la naturale regolazione del ferro in corso di anemia (220, 221). Vi è una crescente richiesta di strumenti preclinici per definire l efficacia delle terapie correlate all epcidina. Pertanto, la gamma di sistemi diagnostici per la determinazione del peptide epcidina nei modelli animali dovrebbe essere migliorata e ampliata (75, 219, 222). Inoltre, sono necessari ampi e ben progettati studi clinici, che definiscano la sicurezza e l efficacia a lungo termine, per chiarire i rischi e i benefici delle terapie mirate sull epcidina. NOTE CONCLUSIVE Dalla scoperta dell epcidina 10 anni fa, molti studi hanno contribuito alla comprensione della regolazione dell epcidina e delle sue proprietà funzionali. I primi metodi affidabili per quantificare l epcidina nei fluidi biologici umani sono stati sviluppati di recente e studi condotti su modelli animali e nell uomo hanno posto l accento sull epcidina come innovativo, promettente strumento diagnostico in ambito medico. Tuttavia, l utilizzo di differenti tecnologie di analisi per la determinazione delle concentrazioni di epcidina nei pazienti con disordini del metabolismo del ferro rende difficile interpretare i risultati di molti studi pubblicati. Per esempio, l accumulo di isoforme epcidina-22 e -20 può sollevare delle perplessità negli studi che hanno utilizzato alcuni saggi immunoassistiti sull interpretazione che la concentrazione misurata di epcidina riflettesse l epcidina-25 biologicamente attiva. Inoltre, c è bisogno di armonizzazione tra i vari saggi per permettere di stabilire intervalli di riferimento e livelli decisionali clinici comuni. Studi ampi e ben progettati, che sfruttino saggi armonizzati, sono necessari per stabilire in modo più rigoroso il ruolo diagnostico dell epcidina in medicina. Ancora, siccome l ambito specialistico si muove verso l utilizzo di terapie correlate all epcidina, si dovrebbe comprendere che, in corso di terapia anti-epcidina, il risultato dei saggi utilizzati per monitorare l epcidina può essere inficiato da sostanze che interferiscono con il dosaggio. Nei casi in cui si sia registrata un interferenza, i metodi devono essere rivalidati per questa specifica applicazione prima di trarre conclusioni definitive sull efficacia della terapia. In conclusione, l epcidina è un promettente strumento diagnostico, ma, prima che la sua determinazione possa essere inserita a pieno titolo nella pratica clinica, devono essere intrapresi ulteriori sforzi per valutare quanto è rilevante misurare specificatamente l epcidina-25, per armonizzare i risultati dei saggi commerciali, definire i limiti decisionali clinici e rendere i metodi utilizzabili dai laboratori clinici. BIBLIOGRAFIA 1. Krause A, Neitz S, Magert HJ, et al. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett 2000;480: Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. A new mouse liverspecific gene, encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload. J Biol Chem 2001;276: Jordan JB, Poppe L, Haniu M, et al. Hepcidin revisited, disulfide connectivity, dynamics, and structure. J Biol Chem 2009;284: Farnaud S, Patel A, Evans RW. Modelling of a metal- biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

15 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS containing hepcidin. Biometals 2006;19: Farnaud S, Rapisarda C, Bui T, et al. Identification of an iron-hepcidin complex. Biochem J 2008;413: Gerardi G, Biasiotto G, Santambrogio P, et al. Recombinant human hepcidin expressed in Escherichia coli isolates as an iron containing protein. Blood Cells Mol Dis 2005;35: Melino S, Garlando L, Patamia M, et al. A metal-binding site is present in the amino terminal region of the bioactive iron regulator hepcidin-25. J Pept Res 2005;66: Tselepis C, Ford SJ, McKie AT, et al. Characterization of the transition-metal-binding properties of hepcidin. Biochem J 2010;427: Schranz M, Bakry R, Creus M, et al. Activation and inactivation of the iron hormone hepcidin: biochemical characterization of prohepcidin cleavage and sequential degradation to N-terminally truncated hepcidin isoforms. Blood Cells Mol Dis 2009;43: Valore EV, Ganz T. Posttranslational processing of epcidin in human hepatocytes is mediated by the prohormone convertase furin. Blood Cells Mol Dis 2008;40: Park CH, Valore EV, Waring AJ, et al. Epcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J Biol Chem 2001;276: Kemna EH, Tjalsma H, Podust VN, et al. Mass spectrometry-based hepcidin measurements in serum and urine: analytical aspects and clinical implications. Clin Chem 2007;53: Kroot JJC, Laarakkers CM, Geurts-Moespot AJ, et al. Immunochemical and mass-spectrometry-based serum hepcidin assays for iron metabolism disorders. Clin Chem 2010;56: Suzuki H, Toba K, Kato K, et al. Serum hepcidin-20 is elevated during the acute phase of myocardial infarction. Tohoku J Exp Med 2009;218: Tomosugi N, Kawabata H, Wakatabe R, et al. Detection of serum hepcidin in renal failure and inflammation by using ProteinChip System. Blood 2006;108: Peters HP, Laarakkers CM, Swinkels DW, et al. Serum hepcidin-25 levels in patients with chronic kidney disease are independent of glomerular filtration rate. Nephrol Dial Transplant 2010;25: Tessitore N, Girelli D, Campostrini N, et al. Hepcidin is not useful as a biomarker for iron needs in haemodialysis patients on maintenance erythropoiesis-stimulating agents. Nephrol Dial Transplant 2010;25: Rivera S, Nemeth E, Gabayan V, et al. Synthetic hepcidin causes rapid dose-dependent hypoferremia and is concentrated in ferroportin-containing organs. Blood 2005;106: Nemeth E, Preza GC, Jung CL, et al. The N-terminus of hepcidin is essential for its interaction with ferroportin: structure-function study. Blood 2006;107: Peyssonnaux C, Zinkernagel AS, Datta V, et al. TLR4- dependent hepcidin expression by myeloid cells in response to bacterial pathogens. Blood 2006;107: Bekri S, Gual P, Anty R, et al. Increased adipose tissue expression of hepcidin in severe obesity is independent from diabetes and NASH. Gastroenterology 2006;131: Nguyen NB, Callaghan KD, Ghio AJ, et al. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006;291:L Merle U, Fein E, Gehrke SG, et al. The iron regulatory peptide hepcidin is expressed in the heart and regulated by hypoxia and inflammation. Endocrinology 2007;148: Kulaksiz H, Fein E, Redecker P, et al. Pancreatic betacells express hepcidin, an iron-uptake regulatory peptide. J Endocrinol 2008;197: Kulaksiz H, Theilig F, Bachmann S, et al. The ironregulatory peptide hormone hepcidin: expression and cellular localization in the mammalian kidney. J Endocrinol 2005;184: Gnana-Prakasam JP, Martin PM, Mysona BA, et al. Hepcidin expression in mouse retina and its regulation via lipopolysaccharide/toll-like receptor-4 pathway independent of Hfe. Biochem J 2008;411: Isoda M, Hanawa H, Watanabe R, et al. Expression of the peptide hormone hepcidin increases in cardiomyocytes under myocarditis and myocardial infarction. J Nutr Biochem 2010;21: Peslova G, Petrak J, Kuzelova K, et al. Hepcidin, the hormone of iron metabolism, is bound specifically to alpha-2-macroglobulin in blood. Blood 2009;113: Ganz T, Olbina G, Girelli D, et al. Immunoassay for human serum hepcidin. Blood 2008;112: Swinkels DW, Girelli D, Laarakkers C, et al. Advances in quantitative hepcidin measurements by time-of-flight mass spectrometry. PLoS ONE 2008;3:e Ashby DR, Gale DP, Busbridge M, et al. Plasma hepcidin levels are elevated but responsive to erythropoietin therapy in renal disease. Kidney Int 2009;75: Costa E, Swinkels DW, Laarakkers CM, et al. Hepcidin serum levels and resistance to recombinant human erythropoietin therapy in haemodialysis patients. Acta Haematol 2009;122: Sumboonnanonda A, Malasit P, Tanphaichitr VS, et al. Renal tubular function in beta-thalassemia. Pediatr Nephrol 1998;12: Wan L, Bellomo R, Di GD, et al. The pathogenesis of septic acute renal failure. Curr Opin Crit Care 2003;9: Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science 2004;306: De Domenico I, Ward DM, Nemeth E, et al. The molecular basis of ferroportin-linked hemochromatosis. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: Delaby C, Pilard N, Goncalves AS, et al. The presence of the iron exporter ferroportin at the plasma membrane of macrophages is enhanced by iron loading and downregulated by hepcidin. Blood 2005;106: Ramey G, Deschemin JC, Durel B, et al. Hepcidin targets ferroportin for degradation in hepatocytes. Haematologica 2010;95: Sow FB, Florence WC, Satoskar AR, et al. Expression and localization of hepcidin in macrophages: a role in host defense against tuberculosis. J Leukoc Biol 2007;82: De Domenico I, Zhang TY, Koening CL, et al. Hepcidin mediates transcriptional changes that modulate acute cytokine-induced inflammatory responses in mice. J Clin Invest 2010;120: Theurl I, Theurl M, Seifert M, et al. Autocrine formation of hepcidin induces iron retention in human monocytes. Blood 2008;111: Keel SB, Abkowitz JL. The microcytic red cell and the anemia of inflammation. N Engl J Med 2009;361: De Domenico I, Nemeth E, Nelson JM, et al. The hepcidinbinding site on ferroportin is evolutionarily conserved. Cell Metab 2008;8: Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, et al. Two to tango: regulation of Mammalian iron metabolism. Cell 2010;142: Ramos E, Kautz L, Rodriguez R, et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and 122 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

16 chronic iron loading in mice. Hepatology 2011;53: Corradini E, Meynard D, Wu Q, et al. Serum and liver iron differently regulate the bone morphogenetic protein 6 (BMP6)-SMAD signaling pathway in mice. Hepatology 2011;54: Babitt JL, Huang FW, Wrighting DM, et al. Bone morphogenetic protein signaling by hemojuvelin regulates hepcidin expression. Nat Genet 2006;38: Finberg KE, Whittlesey RL, Fleming MD, et al. Downregulation of BMP/SMAD signaling by TMPRSS6 is required for maintenance of systemic iron homeostasis. Blood 2010;115: Silvestri L, Pagani A, Nai A, et al. The serine protease matriptase-2 (TMPRSS6) inhibits hepcidin activation by cleaving membrane hemojuvelin. Cell Metab 2008;8: Nicolas G, Viatte L, Bennoun M, et al. Hepcidin, a new iron regulatory peptide. Blood Cells Mol Dis 2002;29: Pinto JP, Ribeiro S, Pontes H, et al. Erythropoietin mediates hepcidin expression in hepatocytes through EPOR signaling and regulation of C/EBPalpha. Blood 2008;111: Ashby DR, Gale DP, Busbridge M, et al. Erythropoietin administration in humans causes a marked and prolonged reduction in circulating hepcidin. Haematologica 2010;95: Vokurka M, Krijt J, Sulc K, et al. Hepcidin mrna levels in mouse liver respond to inhibition of erythropoiesis. Physiol Res 2006;55: Pak M, Lopez MA, Gabayan V, et al. Suppression of hepcidin during anemia requires erythropoietic activity. Blood 2006;108: Tanno T, Bhanu NV, Oneal PA, et al. High levels of GDF15 in thalassemia suppress expression of the iron regulatory protein hepcidin. Nat Med 2007;13: Tanno T, Porayette P, Sripichai O, et al. Identification of TWSG1 as a second novel erythroid regulator of hepcidin expression in murine and human cells. Blood 2009;114: Chou ST, Weiss MJ. Diseased red blood cells topple iron balance. Nat Med 2007;13: Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia, hypoxia, and inflammation. J Clin Invest 2002;110: Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J Clin Invest 2004; 113: Peyssonnaux C, Zinkernagel AS, Schuepbach RA, et al. Regulation of iron homeostasis by the hypoxia-inducible transcription factors (HIFs). J Clin Invest 2007;117: Silvestri L, Pagani A, Camaschella C. Furin-mediated release of soluble hemojuvelin: a new link between hypoxia and iron homeostasis. Blood 2008;111: Lakhal S, Schoedel J, Townsend AR, et al. Regulation of type II transmembrane serine proteinase TMPRSS6 by hypoxia-inducible factors: new link between hypoxia signalling and iron homeostasis. J Biol Chem 2011;286: Mastrogiannaki M, Matak P, Keith B, et al. HIF-2alpha, but not HIF-1alpha, promotes iron absorption in mice. J Clin Invest 2009;119: Wrighting DM, Andrews NC. Interleukin-6 induces hepcidin expression through STAT3. Blood 2006;108: Verga Falzacappa MV, Vujic SM, Kessler R, et al. STAT3 mediates hepatic hepcidin expression and its inflammatory stimulation. Blood 2007;109: Pietrangelo A, Dierssen U, Valli L, et al. STAT3 is required for IL-6-gp130-dependent activation of hepcidin in vivo. Gastroenterology 2007;132: Vecchi C, Montosi G, Zhang K, et al. ER stress controls iron metabolism through induction of hepcidin. Science 2009;325: Oliveira SJ, Pinto JP, Picarote G, et al. ER stress-inducible factor CHOP affects the expression of hepcidin by modulating C/EBPalpha activity. PLoS ONE 2009;4:e Bridle K, Cheung TK, Murphy T, et al. Hepcidin is downregulated in alcoholic liver injury: implications for the pathogenesis of alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res 2006;30: Harrison-Findik DD. Role of alcohol in the regulation of iron metabolism. World J Gastroenterol 2007;13: Kemna EH, Kartikasari AE, van Tits LJ, et al. Regulation of hepcidin: insights from biochemical analyses on human serum samples. Blood Cells Mol Dis 2008;40: Lasocki S, Millot S, Andrieu V, et al. Phlebotomies or erythropoietin injections allow mobilization of iron stores in a mouse model mimicking intensive care anemia. Crit Care Med 2008;36: Huang H, Constante M, Layoun A, et al. Contribution of STAT3 and SMAD4 pathways to the regulation of hepcidin by opposing stimuli. Blood 2009;113: Darshan D, Frazer DM, Wilkins SJ, et al. Severe iron deficiency blunts the response of the iron regulatory gene Hamp and pro-inflammatory cytokines to lipopolysaccharide. Haematologica 2010;95: Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. Blood 2009;113: Roy CN, Custodio AO, de Graaf J, et al. An Hfe-dependent pathway mediates hyposideremia in response to lipopolysaccharide-induced inflammation in mice. Nat Genet 2004;36: Constante M, Jiang W, Wang D, et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;291:G van Deuren M, Kroot JJ, Swinkels DW. Time-course analysis of serum hepcidin, iron and cytokines in a C282Y homozygous patient with Schnitzler's syndrome treated with IL-1 receptor antagonist. Haematologica 2009;94: Hunter HN, Fulton DB, Ganz T, et al. The solution structure of human hepcidin, a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J Biol Chem 2002;277: Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, et al. Pro-hepcidin: expression and cell specific localisation in the liver and its regulation in hereditary haemochromatosis, chronic renal insufficiency, and renal anaemia. Gut 2004;53: Kemna E, Pickkers P, Nemeth E, et al. Time-course analysis of hepcidin, serum iron, and plasma cytokine levels in humans injected with LPS. Blood 2005;106: Brookes MJ, Sharma NK, Tselepis C, et al. Serum prohepcidin: measuring active hepcidin or a non-functional precursor? Gut 2005;54: Roe MA, Spinks C, Heath AL, et al. Serum prohepcidin concentration: no association with iron absorption in biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

17 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS healthy men; and no relationship with iron status in men carrying HFE mutations, hereditary haemochromatosis patients undergoing phlebotomy treatment, or pregnant women. Br J Nutr 2007;97: Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, et al. Novel urine hepcidin assay by mass spectrometry. Blood 2005;106: Murphy AT, Witcher DR, Luan P, et al. Quantitation of hepcidin from human and mouse serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Blood 2007;110: Murao N, Ishigai M, Yasuno H, et al. Simple and sensitive quantification of bioactive peptides in biological matrices using liquid chromatography/selected reaction monitoring mass spectrometry coupled with trichloroacetic acid clean-up. Rapid Commun Mass Spectrom 2007;21: Kobold U, Dulffer T, Dangl M, et al. Quantification of hepcidin-25 in human serum by isotope dilution micro- HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2008;54: Bansal SS, Abbate V, Bomford A, et al. Quantitation of hepcidin in serum using ultra-high-pressure liquid chromatography and a linear ion trap mass spectrometer. Rapid Commun Mass Spectrom 2010;24: Li H, Rose MJ, Tran L, et al. Development of a method for the sensitive and quantitative determination of hepcidin in human serum using LC-MS/MS. J Pharmacol Toxicol Methods 2009;59: Campostrini N, Castagna A, Zaninotto F, et al. Evaluation of hepcidin isoforms in hemodialysis patients by a proteomic approach based on SELDI-TOF MS. J Biomed Biotechnol 2010;2010: Anderson DS, Heeney MM, Roth U, et al. High-throughput matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry method for quantification of hepcidin in human urine. Anal Chem 2010;82: Crockett DK, Kushnir MM, Phillips JD, et al. Time-of-flight mass spectrometry analysis of the ferroportin-hepcidin binding domain complex for accurate mass confirmation of bioactive hepcidin 25. Clin Chim Acta 2010;411: Bansal SS, Halket JM, Bomford A, et al. Quantitation of hepcidin in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal Biochem 2008;384: Altamura S, Kiss J, Blattmann C, et al. SELDI-TOF MS detection of urinary hepcidin. Biochimie 2009;91: Ward DG, Roberts K, Stonelake P, et al. SELDI-TOF-MS determination of hepcidin in clinical samples using stable isotope labelled hepcidin as an internal standard. Proteome Sci 2008;6: Busbridge M, Griffiths C, Ashby D, et al. Development of a novel immunoassay for the iron regulatory peptide hepcidin. Br J Biomed Sci 2009;66: Grebenchtchikov N, Geurts-Moespot AJ, Kroot JJ, et al. High-sensitive radioimmunoassay for human serum hepcidin. Br J Haematol 2009;146: Koliaraki V, Marinou M, Vassilakopoulos TP, et al. A novel immunological assay for hepcidin quantification in human serum. PLoS ONE 2009;4:e Schwarz P, Strnad P, von FG, et al. A novel monoclonal antibody immunoassay for the detection of human serum hepcidin. J Gastroenterol 2011;46: Butterfield AM, Luan P, Witcher DR, et al. A dualmonoclonal sandwich ELISA specific for hepcidin-25. Clin Chem 2010;56: Kiernan UA, Tubbs KA, Gruber K, et al. High-throughput protein characterization using mass spectrometric immunoassay. Anal Biochem 2002;301: Nicolardi S, Palmblad M, Dalebout H, et al. Quality control based on isotopic distributions for high-throughput MALDI- TOF and MALDI-FTICR serum peptide profiling. J Am Soc Mass Spectrom 2010;21: Bruns DE. The STARD initiative and the reporting of studies of diagnostic accuracy. Clin Chem 2003;49: ICH Steering Committee. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: ICH harmonised tripartite guideline text on validation of analytical procedures %20ICH%20Q2A%20for%20CD.pdf 105. Kroot JJ, Kemna EH, Bansal SS, et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica 2009;94: Forest JC, Burtis CA. Development of reference methods and reference materials. index.asp?cat=publications&scat=ejifcc_&suba =Vol_13_No_3&subx=Development_Of Reference_ Methods_And_Reference_Materials_by_Jean- C l a u d e _ F o r e s t _ C a r l _ A _ B u r t i s & z i p = 1 &dove=1&zona=full&numero=&aq= Kroot JJ, Hendriks JC, Laarakkers CM, et al. (Pre)analytical imprecision, between-subject variability, and daily variations in serum and urine hepcidin: implications for clinical studies. Anal Biochem 2009;389: Zhang X, Jin M, Wu H, et al. Biomarkers of lupus nephritis determined by serial urine proteomics. Kidney Int 2008;74: Galesloot TE, Vermeulen SH, Geurts-Moespot AJ, et al. Serum hepcidin: reference ranges and biochemical correlates in the general population. Blood 2011;117:e Bayele HK, McArdle H, Srai SK. Cis and trans regulation of hepcidin expression by upstream stimulatory factor. Blood 2006;108: Bozzini C, Campostrini N, Trombini P, et al. Measurement of urinary hepcidin levels by SELDI-TOF-MS in HFEhemochromatosis. Blood Cells Mol Dis 2008;40: Roe MA, Collings R, Dainty JR, et al. Plasma hepcidin concentrations significantly predict interindividual variation in iron absorption in healthy men. Am J Clin Nutr 2009;89: Semrin G, Fishman DS, Bousvaros A, et al. Impaired intestinal iron absorption in Crohn's disease correlates with disease activity and markers of inflammation. Inflamm Bowel Dis 2006;12: Rehu M, Punnonen K, Ostland V, et al. Maternal serum hepcidin is low at term and independent of cord blood iron status. Eur J Haematol 2010;85: de Mast Q, Syafruddin D, Keijmel S, et al. Increased serum hepcidin and alterations in blood iron parameters associated with asymptomatic P. falciparum and P. vivax malaria. Haematologica 2010;95: del Giudice EM, Santoro N, Amato A, et al. Hepcidin in obese children as a potential mediator of the association between obesity and iron deficiency. J Clin Endocrinol Metab 2009;94: Aeberli I, Hurrell RF, Zimmermann MB. Overweight children have higher circulating hepcidin concentrations and lower iron status but have dietary iron intakes and bioavailability comparable with normal weight children. Int J Obes 2009;33: Cherian S, Forbes DA, Cook AG, et al. An insight into the relationships between hepcidin, anemia, infections and inflammatory cytokines in pediatric refugees: a crosssectional study. PLoS ONE 2008;3:e Altamura S, D'Alessio F, Selle B, et al. A novel TMPRSS6 124 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

18 mutation that prevents protease auto-activation causes IRIDA. Biochem J 2010;431: Tchou I, Diepold M, Pilotto PA, et al. Haematologic data, iron parameters and molecular findings in two new cases of iron-refractory iron deficiency anaemia. Eur J Haematol 2009;83: Van Santen S, de Mast Q, Luty AJ, et al. Iron homeostasis in mother and child during placental malaria infection. Am J Trop Med Hyg 2011;84: van Bokhoven MA, van Deursen CT, Swinkels DW. Diagnosis and management of hereditary haemochromatosis. Br Med J 2011;342:c Swinkels DW, Janssen MC, Bergmans J, et al. Hereditary hemochromatosis: genetic complexity and new diagnostic approaches. Clin Chem 2006;52: Lee PL, Beutler E. Regulation of hepcidin and ironoverload disease. Annu Rev Pathol 2009;4: van Dijk BA, Laarakkers CM, Klaver SM, et al. Serum hepcidin levels are innately low in HFE-related haemochromatosis but differ between C282Yhomozygotes with elevated and normal ferritin levels. Br J Haematol 2008;142: Piperno A, Girelli D, Nemeth E, et al. Blunted hepcidin response to oral iron challenge in HFE-related hemochromatosis. Blood 2007;110: Papanikolaou G, Tzilianos M, Christakis JI, et al. Hepcidin in iron overload disorders. Blood 2005;105: Sham RL, Phatak PD, Nemeth E, et al. Hereditary hemochromatosis due to resistance to hepcidin: high hepcidin concentrations in a family with C326S ferroportin mutation. Blood 2009;114: Drakesmith H, Schimanski LM, Ormerod E, et al. Resistance to hepcidin is conferred by hemochromatosisassociated mutations of ferroportin. Blood 2005;106: Mayr R, Janecke AR, Schranz M, et al. Ferroportin disease: a systematic meta-analysis of clinical and molecular findings. J Hepatol 2010;53: Wijngaarden P, Hoskam J, Koeken A, et al. Primaire hemochromatose door ferroportinegenmutaties: is er een plaats voor hepcidine in de diagnostiek? Ned Tijdschr Klin Chem Labgeneesk 2011;36: Girelli D, Trombini P, Busti F, et al. A time course of hepcidin response to iron challenge in patients with HFE and TfR2 haemochromatosis. Haematologica 2010;96: Swinkels DW, Fleming RE. Novel observations in hereditary hemochromatosis: potential implications for clinical strategies. Haematologica 2011;96: Kattamis A, Papassotiriou I, Palaiologou D, et al. The effects of erythropoietic activity and iron burden on hepcidin expression in patients with thalassemia major. Haematologica 2006;91: Gardenghi S, Marongiu MF, Ramos P, et al. Ineffective erythropoiesis in beta-thalassemia is characterized by increased iron absorption mediated by down-regulation of hepcidin and up-regulation of ferroportin. Blood 2007;109: Kearney SL, Nemeth E, Neufeld EJ, et al. Urinary hepcidin in congenital chronic anemias. Pediatr Blood Cancer 2007;48: Origa R, Galanello R, Ganz T, et al. Liver iron concentrations and urinary hepcidin in beta-thalassemia. Haematologica 2007;92: Tamary H, Shalev H, Perez-Vraham G, et al. Elevated growth differentiation factor 15 expression in patients with congenital dyserythropoietic anemia type I. Blood 2008;112: Malcovati L, Porta MGD, Laarakkers CM, et al. Erythroid activity, transfusion iron overload, and hepcidin levels in patients with myelodysplastic syndrome. ASH Annu Meeting Abstracts 2008;112: Casanovas G, Swinkels DW, Altamura S, et al. Growth differentiation factor 15 in patients with congenital dyserythropoietic anaemia (CDA) type II. J Mol Med 2011;89: Kroot JJ, Laarakkers CM, Kemna EH, et al. Regulation of serum hepcidin levels in sickle cell disease. Haematologica 2009;94: Cuijpers ML, Raymakers RA, Mackenzie MA, et al. Recent advances in the understanding of iron overload in sideroblastic myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 2010;149: Porter JB. Pathophysiology of transfusional iron overload: contrasting patterns in thalassemia major and sickle cell disease. Hemoglobin 2009;33(suppl 1):S Swinkels DW, Drenth JP. Hepcidin in the management of patients with mild non-hemochromatotic iron overload: fact or fiction? J Hepatol 2008;49: Lin L, Valore EV, Nemeth E, et al. Iron transferrin regulates hepcidin synthesis in primary hepatocyte culture through hemojuvelin and BMP2/4. Blood 2007;110: Young MF, Glahn RP, Riza-Nieto M, et al. Serum hepcidin is significantly associated with iron absorption from food and supplemental sources in healthy young women. Am J Clin Nutr 2009;89: Zimmermann MB, Troesch B, Biebinger R, e al. Plasma hepcidin is a modest predictor of dietary iron bioavailability in humans, whereas oral iron loading, measured by stable-isotope appearance curves, increases plasma hepcidin. Am J Clin Nutr 2009;90: Finberg KE, Heeney MM, Campagna DR, et al. Mutations in TMPRSS6 cause iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA). Nat Genet 2008;40: Melis MA, Cau M, Congiu R, et al. A mutation in the TMPRSS6 gene, encoding a transmembrane serine protease that suppresses hepcidin production, in familial iron deficiency anemia refractory to oral iron. Haematologica 2008;93: Hartman KR, Barker JA. Microcytic anemia with iron malabsorption: an inherited disorder of iron metabolism. Am J Hematol 1996;51: Beutler E, Van GC, te Loo DM, et al. Polymorphisms and mutations of human TMPRSS6 in iron deficiency anemia. Blood Cells Mol Dis 2010;44: Oppenheimer SJ. Iron and its relation to immunity and infectious disease. J Nutr 2001;131:616S 33S de Mast Q, Nadjm B, Reyburn H, et al. Assessment of urinary concentrations of hepcidin provides novel insight into disturbances in iron homeostasis during malarial infection. J Infect Dis 2009;199: de Mast Q, van Dongen-Lases EC, Swinkels DW, et al. Mild increases in serum hepcidin and interleukin-6 concentrations impair iron incorporation in haemoglobin during an experimental human malaria infection. Br J Haematol 2009;145: Howard CT, McKakpo US, Quakyi IA, et al. Relationship of hepcidin with parasitemia and anemia among patients with uncomplicated Plasmodium falciparum malaria in Ghana. Am J Trop Med Hyg 2007;77: Nweneka CV, Doherty CP, Cox S, et al. Iron delocalisation in the pathogenesis of malarial anaemia. Trans R Soc Trop Med Hyg 2010;104: Cercamondi CI, Egli IM, Ahouandjinou E, et al. Afebrile Plasmodium falciparum parasitemia decreases absorption of fortification iron but does not affect systemic iron biochimica clinica, 2013, vol. 37, n

19 CLINICAL CHEMISTRY HIGHLIGHTS utilization: a double stable-isotope study in young Beninese women. Am J Clin Nutr 2010;92: Sazawal S, Black RE, Ramsan M, et al. Effects of routine prophylactic supplementation with iron and folic acid on admission to hospital and mortality in preschool children in a high malaria transmission setting: community-based, randomised, placebo-controlled trial. Lancet 2006;367: Drakesmith H, Prentice A. Viral infection and iron metabolism. Nat Rev Microbiol 2008;6: Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005;352: Fleming RE, Sly WS. Hepcidin: a putative iron-regulatory hormone relevant to hereditary hemochromatosis and the anemia of chronic disease. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98: Ferrucci L, Semba RD, Guralnik JM, et al. Proinflammatory state, hepcidin, and anemia in older persons. Blood 2010;115: Andrews NC. Anemia of inflammation: the cytokinehepcidin link. J Clin Invest 2004;113: Thomas C, Kobold U, Balan S, et al. Serum hepcidin-25 may replace the ferritin index in the Thomas plot in assessing iron status in anemic patients. Int J Lab Hematol 2010;33: Sasu BJ, Li H, Rose MJ, et al. Serum hepcidin but not prohepcidin may be an effective marker for anemia of inflammation (AI). Blood Cells Mol Dis 2010;45: Swinkels DW, Wetzels JF. Hepcidin: a new tool in the management of anaemia in patients with chronic kidney disease? Nephrol Dial Transplant 2008;23: Viatte L, Vaulont S. Hepcidin, the iron watcher. Biochimie 2009;91: Zaritsky JJ, Young BY. The utility of multivariate analysis in the study of hepcidin. Kidney Int 2009;76: Weiss G, Theurl I, Eder S, et al. Serum hepcidin concentration in chronic haemodialysis patients: associations and effects of dialysis, iron and erythropoietin therapy. Eur J Clin Invest 2009;39: van der Putten K, Jie KE, van den Broek D, et al. Hepcidin-25 is a marker of the response rather than resistance to exogenous erythropoietin in chronic kidney disease/chronic heart failure patients. Eur J Heart Fail 2010;12: Valenti L, Girelli D, Valenti GF, et al. HFE mutations modulate the effect of iron on serum hepcidin-25 in chronic hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol 2009;4: Kuragano T, Shimonaka Y, Kida A, et al. Determinants of hepcidin in patients on maintenance hemodialysis: role of inflammation. Am J Nephrol 2010;31: Zaritsky J, Young B, Wang HJ, et al. Hepcidin a potential novel biomarker for iron status in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2009;4: Zaritsky J, Young B, Gales B, et al. Reduction of serum hepcidin by hemodialysis in pediatric and adult patients. Clin J Am Soc Nephrol 2010;5: Ford BA, Eby CS, Scott MG, et al. Intra-individual variability in serum hepcidin precludes its use as a marker of iron status in hemodialysis patients. Kidney Int 2010; 78: Kato A, Tsuji T, Luo J, et al. Association of prohepcidin and hepcidin-25 with erythropoietin response and ferritin in hemodialysis patients Am J Nephrol 2008;28: Bratescu LO, Barsan L, Munteanu D, et al. Is hepcidin-25 a clinically relevant parameter for the iron status in hemodialysis patients? J Ren Nutr 2010;20:S Ho J, Lucy M, Krokhin O, et al. Mass spectrometry-based proteomic analysis of urine in acute kidney injury following cardiopulmonary bypass: a nested case-control study. Am J Kidney Dis 2009;53: Prowle JR, Westerman M, Bellomo R. Urinary hepcidin: an inverse biomarker of acute kidney injury after cardiopulmonary bypass? Curr Opin Crit Care 2010;16: Tussing-Humphreys LM, Nemeth E, Fantuzzi G, et al. Elevated systemic hepcidin and iron depletion in obese premenopausal females. Obesity 2010;18: Ruivard M, Laine F, Ganz T, et al. Iron absorption in dysmetabolic iron overload syndrome is decreased and correlates with increased plasma hepcidin. J Hepatol 2009;50: Tussing-Humphreys LM, Nemeth E, Fantuzzi G, et al. Decreased serum hepcidin and improved functional iron status 6 months after restrictive bariatric surgery. Obesity 2010;18: Amato A, Santoro N, Calabro P, et al. Effect of body mass index reduction on serum hepcidin levels and iron status in obese children. Int J Obes 2010;34: Matsumoto M, Tsujino T, Lee-Kawabata M, et al. Iron regulatory hormone hepcidin decreases in chronic heart failure patients with anemia. Circ J 2010;74: Divakaran V, Mehta S, Yao D, et al. Hepcidin in anemia of chronic heart failure. Am J Hematol 2011;86: Kraml PJ, Klein RL, Huang Y, et al. Iron loading increases cholesterol accumulation and macrophage scavenger receptor I expression in THP-1 mononuclear phagocytes. Metabolism 2005;54: Lapenna D, Pierdomenico SD, Ciofani G, et al. Association of body iron stores with low molecular weight iron and oxidant damage of human atherosclerotic plaques. Free Radic Biol Med 2007;42: Sullivan JL. Macrophage iron, hepcidin, and atherosclerotic plaque stability. Exp Biol Med 2007;232: Sullivan JL. Iron in arterial plaque: modifiable risk factor for atherosclerosis. Biochim Biophys Acta 2009;1790: Barisani D, Pelucchi S, Mariani R, et al. Hepcidin and ironrelated gene expression in subjects with dysmetabolic hepatic iron overload. J Hepatol 2008;49: Aigner E, Theurl I, Theurl M, et al. Pathways underlying iron accumulation in human nonalcoholic fatty liver disease. Am J Clin Nutr 2008;87: Valenti L, Dongiovanni P, Motta BM, et al. Serum hepcidin and macrophage iron correlate with MCP-1 release and vascular damage in patients with metabolic syndrome alterations. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011;31: Sharma S, Nemeth E, Chen YH, et al. Involvement of hepcidin in the anemia of multiple myeloma. Clin Cancer Res 2008;14: Maes K, Nemeth E, Roodman GD, et al. In anemia of multiple myeloma, hepcidin is induced by increased bone morphogenetic protein 2. Blood 2010;116: Hohaus S, Massini G, Giachelia M, et al. Anemia in Hodgkin's lymphoma: the role of interleukin-6 and hepcidin. J Clin Oncol 2010;28: Zucker SD. The swinging pendulum of the anemia of cancer: erythropoietin trumps hepcidin. J Clin Oncol 2011;29:e Ukarma L, Johannes H, Beyer U, et al. Hepcidin as a predictor of response to epoetin therapy in anemic cancer patients. Clin Chem 2009;55: Peeling P, Dawson B, Goodman C, et al. Athletic induced iron deficiency: new insights into the role of inflammation, cytokines and hormones. Eur J Appl Physiol 2008;103: biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 2

20 199. Roecker L, Meier-Buttermilch R, Brechtel L, et al. Ironregulatory protein hepcidin is increased in female athletes after a marathon. Eur J Appl Physiol 2005;95: Peeling P, Dawson B, Goodman C, et al. Cumulative effects of consecutive running sessions on hemolysis, inflammation and hepcidin activity. Eur J Appl Physiol 2009;106: Peeling P, Dawson B, Goodman C, et al. Training surface and intensity: inflammation, hemolysis, and hepcidin expression. Med Sci Sports Exerc 2009;41: Troadec MB, Laine F, Daniel V, et al. Daily regulation of serum and urinary hepcidin is not influenced by submaximal cycling exercise in humans with normal iron metabolism. Eur J Appl Physiol 2009;106: Peeling P. Exercise as a mediator of hepcidin activity in athletes. Eur J Appl Physiol 2010;110: Nemeth E. Targeting the hepcidin-ferroportin axis in the diagnosis and treatment of anemias. Adv Hematol 2010; 2010: Pietrangelo A. Hepcidin in human iron disorders: therapeutic implications. J Hepatol 2011;54: Nemeth E. Hepcidin biology and therapeutic applications. Expert Rev Hematol 2010;3: Gardenghi S, Ramos P, Marongiu MF, et al. Hepcidin as a therapeutic tool to limit iron overload and improve anemia in beta-thalassemic mice. J Clin Invest 2010;120: Babitt JL, Huang FW, Xia Y, et al. Modulation of bone morphogenetic protein signaling in vivo regulates systemic iron balance. J Clin Invest 2007;117: Corradini E, Schmidt PJ, Meynard D, et al. BMP6 treatment compensates for the molecular defect and ameliorates hemochromatosis in Hfe knockout mice. Gastroenterology 2010;139: Semenza GL. Development of novel therapeutic strategies that target HIF-1. Expert Opin Ther Targets 2006;10: Sasu BJ, Cooke KS, Arvedson TL, et al. Antihepcidin antibody treatment modulates iron metabolism and is effective in a mouse model of inflammation-induced anemia. Blood 2010;115: Yu PB, Hong CC, Sachidanandan C, et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol 2008;4: Fatih N, Camberlein E, Island ML, et al. Natural and synthetic STAT3 inhibitors reduce hepcidin expression in differentiated mouse hepatocytes expressing the active phosphorylated STAT3 form. J Mol Med 2010;88: Song SN, Tomosugi N, Kawabata H, et al. Downregulation of hepcidin resulting from long-term treatment with an anti-il-6 receptor antibody (tocilizumab) improves anemia of inflammation in multicentric Castleman disease. Blood 2010;116: Hashizume M, Uchiyama Y, Horai N, et al. Tocilizumab, a humanized anti-interleukin-6 receptor antibody, improved anemia in monkey arthritis by suppressing IL-6-induced hepcidin production. Rheumatol Int 2010;30: Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, et al. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood 2005;106: Kawabata H, Tomosugi N, Kanda J, et al. Anti-interleukin 6 receptor antibody tocilizumab reduces the level of serum hepcidin in patients with multicentric Castleman's disease. Haematologica 2007;92: Poli M, Girelli D, Campostrini N, et al. Heparin: a potent inhibitor of hepcidin expression in vitro and in vivo. Blood 2011;117: Xiao JJ, Krzyzanski W, Wang YM, et al. Pharmacokinetics of anti-hepcidin monoclonal antibody Ab 12B9m and hepcidin in cynomolgus monkeys. AAPS J 2010;12: Braliou GG, Verga Falzacappa MV, Chachami G, et al. 2- Oxoglutarate-dependent oxygenases control hepcidin gene expression. J Hepatol 2008;48: Klaus S, Langsetmo I, Spong S, et al. Induction of erythropoiesis and iron utilization by the HIF prolyl hydroxylase inhibitor FG J Am Soc Nephrol 2005;16:49A Tjalsma H, Laarakkers CM, van Swelm RP, et al. Mass spectrometry analysis of hepcidin peptides in experimental mouse models. PLoS ONE 2011;6:e Janssen MC, Swinkels DW. Hereditary haemochromatosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2009;23: biochimica clinica, 2013, vol. 37, n