TRATTAMENTO E CONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE PER TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA

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1 OSPEDALE SAN CARLO Azienda Ospedaliera Regionale-Potenza DIP. MATERNO INFANTILE Dir.: Dott. Sergio Schettini Lab. Di Biologia della Riproduzione Resp.: Angela Ferri TRATTAMENTO E CONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE PER TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA Laboratorio Biologia della Riproduzione

2 Ripetere Per conferma Variabili Laboratorio Variazioni Individuali SPERMIOGRAMMA Normale Ripetere Patologico Anamnesi Esame obiettivo Alterazione del Liquido seminale Patologico Permette la valutazione della qualità del seme Esame cardine per una corretta diagnostica in campo seminologico Decisivo per l iter terapeutico della coppia infertile Azoospermia Dispermia Aspermia Ripetere Almeno 3 controlli (Ricerca spermatozoi nel sedimento) Oligo Asteno Terato spermia si Spermatozoi Nelle urine no TESE TESA Eiaculazione retrograda Aneiaculazione

3 Caratteri Macroscopici Motilità Conta Nemaspermica SPERMIOGRAMMA 2 ore 4 ore Concentrazione/ml Cocentrazione/eiaculato Volume ph Viscosità Aspetto Fluidificazione Morfologia Forme Normali Forme Anomale Leucociti Cellule Germinali Zone di Spermioagglutinazione Cellule di Sfaldamento

4 SPERMIOGRAMMA Volume 2.0 ml ph VALORI DI RIFERIMENTO WHO 2000 Leucociti /ml Concentrazione /ml Oligozoospermia Concentrazione < /ml CONDIZIONI PATOLOGICHE Numero totale di Spermatozoi /ml Motilità 50%(a+b) Astenozoospermia Motilità < 50%(a+b) < 25%(progr.lin.) Morfologia * (WHO) 14%(Kruger) Teratozoospermia Morfologia <30% forme norm.

5 Analisi quantitative Biochimiche Swelling test Indagini Genetiche (Cariotipo, Delezioni cromosoma Y) SPERMIOGRAMMA Eosin test Mar test IBT test Indagini ormonali (LH,FSH) Studio della Frammentazione

6 PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE Razionale: Il liquido seminale deve essere trattato allo scopo di indurre in vitro la capacitazione; solo gli spermatozoi attivati (reazione acrosomiale) saranno in grado di fecondare gli ovociti maturi. La scelta del metodo deve basarsi sulle caratteristiche del campione: Eliminazione del plasma seminale ed incrementare le forme dotate di migliore motilità e morfologia; Concentrazione di spermatozoi mobili; Volume; Presenza di elementi e detriti cellulari,agglutinazioni; La scelta della tecnica da utilizzare deve essere: La meno traumatica per la cellula nemaspermica, La più idonea per il tipo di situazione seminale da affrontare, Selezionare gli spermatozoi con buona motilità aumentandone la cinetica e conservandola nel tempo, Selezionare gli spermatozoi adatti a fecondare e con un corretto assetto cromosomico aploide..e tener conto della caratteristiche del campione

7 METODICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE SWIM UP (sfrutta la capacità degli spermatozoi di migrare nel mezzo di coltura) STANDARD Da PELLET Indicate per parametri seminali normali GRADIENTI DI DIVERSE DENSITA (separazione differenziata per centrifugazione/ sedimentazione) Indicato per alterazioni dei parametri seminali MEDIO/SEVERE SPERM WASHING (semplici migrazione degli spermatozooi) Indicato per alterazioni dei parametri seminali SEVERE

8 METODICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA I LIVELLO IUI TECNICHE FIVET II /III LIVELLO ICSI ICSI (TeSE) GIFT La conoscenza degli eventi legati alla capacitazione ed alla fecondazione Tecniche di preparazione per la PMA

9 IN QUALI CASI VENGONO CONSIGLIATE LE VARIE TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA FIVET VS ICSI E consigliata nei casi di: - Fattore tubo-peritoneale: patologia tubarica acquisita o congenita; - Infertilità maschile di grado moderato; - Endometriosi di III o IV grado; - Infertilità inspiegata se il trattamento precedente(iui) non ha dato risultati; - Seme crioconservato ; - Fallimento dell iter terapeutico di tecniche di I E consigliata nei casi di: - Infertilità maschile di grado severo; - Azoospermia ostruttiva e secretiva (spermatozoi testicolari o epididimari); - Mancata o ridotta fertilizzazione in precedenti cicli di fertilizzazione in vitro (FIV); - Ovociti scongelati; - Ridotto numero di ovociti; - Seme crioconservato in relazione alla qualità seminale successiva allo scongelamento.

10 FIVET Fertilizzazione In Vitro Embryo Transfer La FIVET consiste nel far entrare in contatto in laboratorio (in vitro) i gameti femminili (ovociti( ovociti) ) e i gameti maschili (spermatozoi( spermatozoi) eiaculati

11 ICSI Intra Cytoplasmatic Sperm Injection ovocita Singolo spermatozoo La ICSI comporta l iniezione diretta di un singolo spermatozoo all interno del citoplasma ovocitario.

12 TECNICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE DOPO Te.S.E. Recupero del frammento testicolare; Dissezione con 2 vetrini sterili; Verifica al microscopio; Centrifugazione; Coltura degli spermatozoi in terreno tamponato; Eventuale congelamento (non concomitanza pick-up);

13 CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI La motilità dello spermatozoo è un indicatore di vitalità Se non vi sono spermatozoi mobili: Swelling Test con utilizzo degli stessi per Icsi Uso della Pentoxifillina:riconoscimento degli spermatozoi vitali tra quelli immobili inducendone la motilità. La qualità dello spermatozoo microiniettato è determinante nei processi di fertilizzazione e divisione embrionaria cosi come nella trasmissione di eventuali anomalie genetiche o cromosomiche. Solo gli spermatozoi che hanno completato la maturazione cellulare (citoplasmatica e nucleare) sono in grado di legarsi al terreno di coltura a base di ACIDO IALURONICO (HA). Una goccia di liquido seminale (1-2ul), concentrato secondo l abituale protocollo di laboratorio, viene deposta in modo da toccare la goccia di HA. METODO CON PENTOXIFILLINA METODO CON ACIDO IALURONICO Terreno tamponato per alloggiare gli ovociti spermatozoi migrati sul bordo della goccia Sperm slow Zona d intersezione spermatozoi P V P Terreno tamponato + pentoxifillin a Terreno contenenti ovociti

14 L Acido Ialuronico (HA) ricopre un ruolo fondamentale nella selezione degli spermatozoi. Gli spermatozoi maturi posseggono una glicoproteina di membrana,detta PH20, che svolge un ruolo bifunzionale: prima della reazione acrosomiale presenta attività ialuronidasica consentendo l attraversamento delle cellule del cumulo, dopo la reazione acrosomiale interviene nel legame secondario tra lo spematozoo e la zona pellucida.

15 CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI Un metodo alternativo per selezionare gli spermatozoi per la ICSI è rappresentato dalla valutazione della morfologia spermatica ad altissimo ingrandimento (IMSI). Mediante sistemi di amplificazione d immagine digitali in combinazione con specifici obiettivi (6600x), è possibile osservare gli spermatozoi ad alto ingrandimento permettendo così di esaminare la morfologia degli organelli spermatici(acrosoma,nucleo,mitocondri, cappuccio,coda.); Motile Sperm Organellar Morphology Examination (MSOME).

16 CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI Uno spermatozoo mancante di solo uno di questi organelli viene escluso dalla inseminazione. La normale morfologia dell intera cellula spermatica è stata correlata positivamente con i tassi di fertilizzazione e di gravidanza rispetto all ICSI tradizionale.(b.bartow et al.2003) La microiniezione di spermatozoi vacuolizzati sembra ridurre il tasso di gravidanza ed è associato ad aborti precoci. Indicazioni all IMSI: ripetuti fallimenti di ICSI convenzionale

17 LA CRIOCONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE Gestione interna Materiali e metodi Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme: La crioconservazione di liquido seminale rappresenta una valida tecnica alternativa di autoconservazione( previo congelamento in azoto liquido a -196 C ) le cui finalità sono rivolte a: Liquido Seminale Prevenire la sterilità Eseguire una Fecondazione assistita E possibile crioconservare Spermatozoi da prelievo epididimario Programma Gestione pazienti Prelievo bioptici testicolari Pz che accedono alla Banca del Seme Analisi da effettuare pre-criocons. Consensi informati per la gestione del paziente e del seme crioconservato Tempo di durata del deposito del seme

18 FASE PRE-CONGELAMENTO Esecuzione dello spermiogramma per la valutazione delle caratteristiche del seme (numero, morfologia, motilità e vitalità) Il paziente deve sottoporsi ad alcuni esami sierologici per evidenziare l eventuale presenza di patologie infettive in atto (HBV, HCV, HIV, VDRL). Medium di coltura sperm freezing (glicerolo) Cryovials o vials da 1,8 ml idonei al congelamento Provette sterili Guanti criogenici Occhiali di protezione STRUMENTI Cappa a flusso laminare Centrifuga Cane (stecche portafiale in alluminio) Tank o criobanca (contenitore criobiologico in alluminio, che viene costantemente alimentato ad Azoto Liquido)

19 Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme Tipologia pazienti Pz affetti da patologie che necessitano di terapie inducenti danni alla spermatogenesi (patologie neoplastiche, autoimmuni, ecc.) Pz affetti da patologie che necessitano di interventi chirurgici all apparato uro-genitale che possono ledere la funzione eiaculatoria Soggetti che si sottopongono a vasectomia Soggetti che per motivi di lavoro sono esposti a sostanze potenzialmente genotossiche. Pz con OAT che presentano transitori miglioramenti della qualità del seme Pz che mostrano un severo e progressivo peggioramento della qualità del seme Pz criptozoospermici Pz che hanno difficoltà a raccogliere il liquido seminale il giorno del prelievo ovocitario (difficoltà psicologiche o logistiche)

20 Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme Età Prima Dopo due anni dalla fine Astinenza Crioconservazione GESTIONE DEL PAZIENTE Requisiti Raccolta Terapie Terapia antiblastica e radioterapia induttori di danno genotossico Analisi Nel caso di utilizzo di farmaci che non agiscono sul ciclo cellulare Accertamento d identità Crioconservazione Dopo tre mesi dalla Fine del trattamento

21 Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme Epatite B HBsAg (Antigene Australia) HBsAb (Anticorpi anti HBs) GESTIONE DEL PAZIENTE Markers Infettivologici Epatite C Citomegalovirus Anticorpi anti HCV HCV-RNA Qualitativo (nel caso di anticorpi positivi) Anticorpi anti IgG Anticorpi anti IgM No crioconservazione HIV Anticorpi anti - HIV di liquido seminale o di tessuto testicolare in assenza di markers infettivologici per pazienti infettivi se la banca non è attrezzata con percorsi e contenitori dedicati ad ogni singolo virus

22 Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme E necessario un consenso per ogni campione seminale crioconservato GESTIONE DEL PAZIENTE CONSENSI INFORMATI Per il rinnovo della crioconservazione Per l eliminazione del campione Per il ritiro Di tutto il campione Di una o più paillettes

23 LIQUIDO SEMINALE Valutazione CONCLUSIONI Applicazione di Tecniche Selettive Diagniostica (relazionata studio partner) In base alla Tecnica Swim - up Gradienti Lavaggio Eventuale Crioconservazione IUI ICSI FIVET HA Pentoxi fillina IMSI LA LEGGE 40/2004 DEL CODICE CIVILE ITALIANO IMPONE CHE NON PIU DI TRE OVOCITI POSSONO ESSERE FECONDATI AL FINE DI OTTENERE UN NUMERO MASSIMO DI TRE EMBRIONI, IN RELAZIONE A QUESTA CONDIZIONE E IMPORTANTISSIMA LA SELEZIONE DEGLI UNICI TRE OVOCITI E LA SELEZIONE DEI MIGLIORI SPERMATOZOI. ORA VALUTAZIONE CLINICA DI ALCUNE CONDIZIONI SPECIFICHE ALLA LUCE DELLA SENTENZA DELLA CORTE COSTITUZIONALE DEL I APRILE 2009 (sent. n 151 pubblicato su GURI del 13 maggio 2009)