Identificazione delle specie fungine su dipinti mobili su tela mediante tecniche tradizionali di coltivazione microbica.

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1 Rivista on line Associazione Itatialiana in Diagnostica Applicata ai Beni Culturali Identificazione delle specie fungine su dipinti mobili su tela mediante tecniche tradizionali di coltivazione microbica. (a cura di Nicoletta Barbabietola) Opere analizzate: Madonne Incoronate. Sono state analizzate sette opere pittoriche facenti parte dell ampia collezione Madonne Incoronate dei depositi della Fabbrica di San Pietro in Vaticano. Le opere, di difficile attribuzione, eseguite mediante tecnica ad olio su tela e realizzate tutte nel XVIII secolo, sono il frutto di una tradizione molto radicata nel culto mariano. Nel corso dei secoli, come segno tangibile della devozione e della gratitudine verso la Madonna sono state realizzate, attraverso svariate tecniche artistiche, principalmente statuaria e disegno, diversi manufatti raffiguranti la Vergine Maria. Tali immagini, situate in diversi luoghi quali: chiese, cappelle, grotte ma anche angoli delle strade urbane e rurali, sono state associate ad apparizioni, guarigioni e miracoli, suscitando nei fedeli un intenso culto, divenendo meta di ininterrotti pellegrinaggi provenienti da ogni parte. Per queste icone, con decreto del Vaticano, viene concessa la solenne incoronazione. Questa consacrazione, ripetibile nel tempo, consiste nell imposizione sul capo della Vergine di una corona, alla cerimonia presiede la competente autorità religiosa e l autorità pubblica. Viene incoronato anche il Bambin Gesù se presente nell icona. Il rito per essere espletato richiede che la comunità, in possesso dell immagine, oltre ad una offerta, realizzi, a proprie spese, una riproduzione della Madonna da incoronare, che sarà inviata al Vaticano. Tale copia ha valore di testimonianza storica che certifica lo status ante la coronazione. In passato l unico strumento con finalità informative prettamente grafiche, avente il valore di documento era la pittura. Tale mezzo esprimeva la realtà visiva attraverso la soggettività dell autore. Quindi queste opere sono simili ma non identiche alle icone originali della Vergine sparse nell intero territorio nazionale. Stato di conservazione dei dipinti analizzati Il Dipinto La Madonna di Otranto

2 Questo dipinto si presentava completamente ricoperto da una patina bianca, uniforme, di aspetto polveroso, che oscurava fortemente il disegno sottostante. L attacco fungino è iniziato direttamente dalla superficie del dipinto, senza intaccare minimamente il retro di questo. Tale condizione è piuttosto insolita nel degrado dei dipinti e avviene principalmente quando le condizioni termoigrometriche dell ambiente in cui si trova l oggetto sono estreme. I dipinti infatti erano conservati nei magazzini della Fabbrica di S. Pietro in Vaticano, in luoghi estremamente umidi e non completamente isolati dall esterno, accessibili anche ad uccelli, data la presenza di loro escrementi sui molti dipinti ed oggetti ivi conservati. Figura. SEQ Figura \* ARABIC 1 Foto del dipinto La Madonna di Otranto prima dell intervento di restauro. Il dipinto è interamente ricoperto dalla patina biologica di degrado. Figura.2 Dettaglio del prelievo effettuato dalla superficie del dipinto La Madonna di Otranto Il dipinto La vergine incoronata Questo dipinto, a differenza del precedente, presentava un forte attacco biologico sul retro. Si potevano osservare delle muffe dall aspetto lanuginoso prevalentemente bianche e solo alcune nere, raggruppate in ampie colonie disperse lungo la superficie della tela. Anche la superficie del dipinto presentava un attacco biologico meno evidente di quello presente sul retro. In questo caso la patina biologica di degrado si presentava, come nel dipinto precedente, sotto forma di polvere bianca che ricopriva interamente la superficie, modificando leggermente la tonalità cromatica dei pigmenti, ma, a differenza del primo dipinto, permettendo comunque la visione del disegno sottostante.

3 Figura.3 Foto del retro del dipinto La Vergine Incoronata. La tela è interamente ricoperta da colonie fungine lanuginose di colore prevalentemente bianco e in parte nero, diffuse in modo disomogeneo lungo la superficie. Figura.4 Superficie del dipinto La Vergine Incoronata. La superficie appare velata leggermente da una patina biologica di degrado di colore bianco. Figura.5 Dettaglio dei prelievi effettuati dal dipinto La Vergine Incoronata. A destra il prelievo dalla colonia nera, al centro dalla colonia bianca e a sinistra dalla superficie. Il dipinto La Madonna con Bambino Questo dipinto presentava un attacco biologico solo sulla superficie. La patina biologica di degrado aveva un aspetto polveroso ed era di colore bianco. A differenza del dipinto La Madonna di Otranto, non offuscava il disegno sottostante ed era distribuita in maniera non uniforme sulla superficie del dipinto.

4 Figura.7 Dettaglio del prelievo effettuato dalla superficie del dipinto La Madonna con Bambino. Figura.6 Fotografia del della superficie del dipinto La Madonna con Bambino. La superficie appare velata da una patina bianca, di aspetto polveroso, disomogenea. ATTIVITA SVOLTA: MATERIALI E METODI. L identificazione delle specie fungine è stata realizzata mediante tecniche tradizionali di coltivazione microbica, allestendo terreni adatti alla loro crescita, al fine di evidenziare quelle strutture, quali conidi e spore, fondamentali per il riconoscimento della specie in esame e per analizzare le differenti capacità metaboliche. Oltre la preparazione di piastre di colture pure, sono stati allestiti dei vetrini per poter meglio osservare i campioni su di un solo piano al microscopio ottico. Al fine di evidenziarne le strutture si è proceduto, inoltre, alla colorazione dei microrganismi in esame. La caratterizzazione è stata poi, per alcune specie, completata mediante fotografie al microscopio elettronico a scansione, per analizzare con maggior definizione le strutture rappresentative delle differenti specie. Terreni utilizzati I terreni utilizzati per queste prime analisi sono stati dei terreni complessi, tali da permettere la crescita della maggior parte degli organismi eterotrofi, non conoscendo la specie fungina presente sul dipinto. I terreni utilizzati sono: Brain Heart Infusion Agar(BHI) e il Sabouraud Dextrose Agar (SDA). La composizione del BHI è: Brain heart infusion agar...52g Acqua distillata ml Gli ingredienti sono stati dapprima fatti bollire e successivamente introdotti in una beuta di vetro chiusa mediante

5 carta stagnola. L ampolla è stata poi introdotta in autoclave per essere sterilizzata. Dopo 15 minuti a 1 atm e 121 C, il contenitore è stato prelevato dall autoclave e il suo contenuto versato nelle piastre. Lo stesso procedimento è stato effettuato con il secondo tipo di terreno: Sabouraud Dextrose Agar (SDA), uno dei terreni maggiormente utilizzati nella crescita fungina, permette anche la crescita di attinomiceti aerobi. La composizione è : Destrosio...20g Peptone...10g Agar...17g Acqua distillata ml Metà del terreno così preparato, sia per il BHI sia per l SDA, è stato modificato dall aggiunta di 50 µg / ml dell antibiotico, cloramfenicolo (Cm), con il fine di inibire la crescita di eventuali batteri. Allestimento dei preparati per osservazione al microscopio ottico I campioni sono stati prelevati con una punta da bisturi sterile. Questa viene delicatamente appoggiata sulla superficie del dipinto, nel punto in cui si vuole effettuare il prelievo e si scarifica leggermente la patina di degrado. Il materiale biologico in questo modo rimane adeso alla lama metallica e quindi viene introdotto sulla piastra Petri, facendovi una piccola incisione e distribuendo su questa il campione contenuto sulla lama. Per ogni campione prelevato è stato usato lo stesso procedimento, utilizzando lame differenti, in modo da non avere traccia dei microrganismi precedentemente prelevati. Le capsule sono state portate in laboratorio ed incubate per circa una settimana a 25 C. Una piastra non seminata è stata trattata nelle medesime condizioni. I microrganismi che si sono sviluppati dopo il tempo di incubazione, sono stati nuovamente isolati in colture pure con il procedimento seguente. Gli stessi terreni usati per l espansione delle colonie fungine presenti nei preparati biologici, sono stati utilizzati per la preparazione di colture pure, al fine di isolare ogni singola specie cresciuta sulle piastre di partenza. Per realizzare le nuove colture di isolamento si è proceduto allestendo sia delle nuove piastre che dei vetrini. L allestimento dei vetrini è stato realizzato per poter meglio analizzare le strutture dei funghi dal punto di vista microscopico. I vetrini permettono di visualizzare su un solo piano tutte le strutture del microrganismo, mentre, a volte, l analisi microscopica delle colture su piastra, a causa dell eccessivo spessore di queste, può risultare più difficoltosa. La messa a fuoco di alcuni particolari, infatti, porta alla perdita di definizione di altri, costituendo un impedimento soprattutto alla realizzazione di fotografie digitali dei microrganismi osservati. Per l allestimento delle colture pure è stato prelevato un piccolo campione della colonia fungina sviluppatasi sulla capsula di incubazione di partenza. Il prelievo è stato effettuato utilizzando un ansa, con la quale si effettuano delle

6 piccole incisioni, mettendo, così, in evidenza la porzione di colonia da prelevare. L ansa viene fatta penetrare appena al di sotto della colonia, tentando di prelevare solo la parte di agar in cui sia presente il micelio del fungo. Il materiale biologico così asportato è stato poi inoculato sulla superficie delle nuove piastre già approntate. Per l allestimento dei vetrini si è proceduto come segue: è stata prelevata con una pipetta una goccia del terreno agarizzato, allo stato liquido, alla temperatura di 60 C. Sullo stesso vetrino portaoggetti, sono state poste due gocce, distanziate l una dall altra, una prelevata dal terreno di base e l altra dal terreno addizionato con il cloramfenicolo. Per ogni specie fungina da isolare, sono stati preparati due vetrini: uno contenente una goccia di terreno BHI e una goccia di BHI + Cm e l altro, due gocce contenenti rispettivamente il terreno SDA e il terreno SDA + Cm. Una volta solidificata, ogni goccia è stata tagliata in due parti con l uso di un ansa e seminata con i funghi prelevati dalle piastre di partenza. I vetrini sono stati, poi, introdotti all interno di piastre vuote e sono stati incubati a 25 C, insieme alle piastre di coltura preparate come descritto sopra. Dopo l incubazione iniziale i terreni sono stati controllati ogni due o tre giorni, in quanto i funghi presentano modalità e tempi di crescita che variano enormemente da specie a specie: alcune specie hanno una crescita molto rapida e possono apparire sul terreno di coltura dopo il primo o secondo giorno, mentre altre possono impiegare anche due, tre o più settimane. Allestimento preparati per osservazione al microscopio elettronico Sono state preparate delle nuove piastre con gli stessi tipi di terreno utilizzati precedentemente. I campioni sono stati prelevati dalle piastre di partenza, sulle quali sono stati seminati i microrganismi seguendo la procedura sperimentale descritta prima ed fatti aderire su di una base metallica. Per poter essere osservati al SEM sono stati metallizzati con uno sputter d oro. In questo modo la superficie del campione viene resa conduttrice e può essere esplorata dal fascio di elettroni primario emesso dallo strumento. Colorazione dei preparati La colorazione dei preparati biologici viene realizzata per poterne evidenziare determinate strutture. Nel nostro caso la colorazione, effettuata sui vetrini, è stata eseguita per mettere in risalto le spore dei funghi coltivati, in modo da poterle analizzare in dettaglio. La colorazione effettuata è una colorazione di tipo Gram, solitamente utilizzata per distinguere i batteri gram positivi dai batteri gram negativi. Nonostante le numerose differenze tra batteri e funghi, quest ultimi reagiscono positivamente alla colorazione di Gram, comportandosi come dei batteri gram positivi; pertanto questo tipo di colorazione può essere utilizzato per studiarne le strutture. I campioni per essere colorati devono prima essere disidratati. Per questo motivo vengono interamente ricoperti con dell alcool, che si lascia agire per circa 20 secondi prima di essere lavato via con acqua. A questo punto è possibile iniziare la colorazione, che viene realizzata tramite una serie di passaggi in cui il campione viene trattato con coloranti differenti, i quali vengono lasciati agire a contatto con il campione per venti secondi. Dopo ogni

7 trattamento, il vetrino viene lavato con acqua. Dopo la prima colorazione effettuata con il cristal violetto, i campioni sono stati analizzati per vedere se la reazione con il colorante fosse avvenuta. I campioni, dopo questa prima colorazione, apparivano al microscopio colorati in rosa. A questo punto è stato possibile procedere con il secondo colorante, una soluzione Gram di iodio, depositato sul vetrino dopo averlo lavato abbondantemente con acqua per eliminare il colorante precedente. I vetrini sono stati, poi, decolorati velocemente con una soluzione in parti uguali di acetone ed etanolo al 95%. Infine il campione è stato trattato con un terzo tipo di colorante, la safranina, responsabile del colore finale che assumono i campioni trattati. In questo caso, comportandosi come dei batteri gram positivi, i funghi si coloreranno di viola. I coloranti utilizzati in questo procedimento appartengono alla categoria dei coloranti cationici. La loro reazione con le strutture cellulari avviene in quanto le superfici delle cellule hanno generalmente carica negativa e quindi possono legarsi facilmente con le cariche positive dei reagenti utilizzati. Risultati Sulle piastre e i vetrini contenti i terreni SDA e BHI privi di antibiotico e seminati con il preparato biologico come descritto prima, si è potuto osservare una crescita di comuni batteri ambientali. Tali terreni, infatti, essendo molto ricchi di sostanze nutritive rappresentano un ottima sorgente di crescita per la maggior parte dei batteri. Solo i terreni su cui era presente il cloramfenicolo hanno permesso la crescita e il successivo isolamento delle specie fungine candidate ad essere responsabili del biodeterioramento. Lo studio delle colonie fungine prevede una prima fase in cui si procede all osservazione delle colonie, della loro forma, del loro colore, della superficie e anche del colore del retro della colonia stessa. Dopo l esame macroscopico, le colture sono state analizzate microscopicamente, osservando direttamente i campioni al microscopio ottico. Sia le piastre che i vetrini vengono posizionati sulla piattaforma dello strumento e possono essere studiati senza la necessità di aprire le capsule, utilizzando un obiettivo 10x e 40x. Successivamente l analisi microscopica dei campioni è stata completata con il microscopio elettronico a scansione per poter analizzare in dettaglio e con maggior definizione le strutture delle colonie. Il Dipinto: La Madonna di Otranto. Le specie fungine che risultano dall identificazione morfologica delle colture sono due : Penicillium spp e Trichoderma spp. Trichoderma spp

8 Caratteristiche macroscopiche. Le colonie crescono velocemente alla temperatura di 25 C e maturano in cinque giorni. All inizio si presentano bianche e lanuginose, poi si sviluppano sotto forma di ciuffi compatti di colore marrone giallo, presenti solo in piccole aree o in zone concentriche a forma di anello sulla superficie dell agar. Dal retro della piastre, appaiono di colore giallognolo. Figura.a.1 Foto di una piastra di Trichoderma Figura.a.2 Fotografia della specie fungina Trichoderma al microscopio ottico presa da una piastra di coltura. Figura.a.3 Fotografia della specie fungina Trichoderma al microscopio ottico presa da un vetrino dopo colorazione Gram. Caratteristiche microscopiche I conidiofori sono ampiamente ramificati, spesso si articolano in distinti anelli concentrici o vengono sorretti lungo l ifa aerea. I rami principali dei conidiofori producono rami laterali. Al termine dei conidiofori si osservano delle strutture irregolari, ricurve, divergenti, a forma di fiasco, definite fialidi, che sono trasparenti. I conidi sono generalmente verdi, con pareti liscie o ruvide e si raggruppano alla cima delle fialidi. Nella figura.a.3 è possibile osservare una fotografia al microscopio ottico di trichoderma isolato dal dipinto in cui sono messe in evidenza le ife settate, da cui si dipartono i conidiofori che sorreggono i conidi. Penicillium spp

9 Caratteristiche macroscopiche Le colonie crescono rapidamente a 25 C, sviluppandosi già dopo due giorni di incubazione.esse si presentano di aspetto vellutato e leggermente polveroso. In un primo tempo si presentano di colore bianco e successivamente assumono un colore verde grigio. Osservata dal retro la colonia appare di colore tendente al giallo. Figura.a.4 Fotografia di una piastra di Penicillium Figura.a.6 Fotografia della specie Penicillium al microscopio ottico presa da un vetrino dopo colorazione Gram Figura.a.5 Fotografia della specie fungina Penicillium al microscopio ottico. Caratteristiche microscopiche Sul preparato ottenuto da l dipinto è possibile, a maggior ingrandimento, osservare le ife settate, ialine. Da queste si dipartono i conidiofori ramificati. Al termine di ogni conidioforo, sono visibili le fialidi a forma di fiasco. L organizzazione delle fialidi nella specie Penicillium è caratteristica, in quanto esse formano dei raggruppamenti a forma di pennello definiti penicilli. I conidi sono disposti a catena all estremità delle fialidi e si presentano di forma sferica e unicellulari.

10 Figura.a.7 Fotografie al SEM dei conidi della specie fungina Penicillium II Dipinto «La Vergine Incoronata» Su questo dipinto sono state identificate tre specie fungine: Alternaria spp, Acremonium spp e Stemphylium spp. Alternaria spp Caratteristiche macroscopiche Le colonie crescono velocemente alla temperatura di 25 C e dopo sette giorni di incubazione si estendono quasi sull intera superficie della piastra di terreno agarizzato. Le colonie si presentano di aspetto vellutato e all inizio sono di colore bianco-grigiastro, che scurisce nel tempo prendendo un colore nero oliva tendente al verde. Il retro è tipicamente di colore marrone, nero per la produzione di pigmenti. Caratteristiche microscopiche Le ife sono settate e di colore marrone. Da queste si dipartono i conidiofori, anch essi marroni e settati, visibili a maggiore ingrandimento. All estremità dei conidiofori si trovano i conidi. Questi sono si forma ovale o ellittica, di colore marrone scuro e presentano dei setti trasversali e longitudinali. I conidi si presentano disposti in catene di quattro o cinque elementi, gli uni dietro gli altri. L estremità del conidio più vicina ai conidiofori è rotonda, mentre la parte opposta si presenta allungata. Questo fa assumere al conidio la tipica forma a becco. Figura.b.1 Foto di una piastra di Alternaria

11 Figura.b.2 Fotografia della specie fungina presa da un vetrino; a sinistra da un vetrino dopo Alternaria al microscopio ottico: a destra la fotografi colorazione Gram. Acremonium spp Figura.b.3 Foto di una piastra di Acremonium Caratteristiche macroscopiche Le colonie hanno una crescita moderata, maturando entro cinque giorni. Esse si presentano compatte e umide all inizio, poi diventano polverose, vellutate o lanuginose. Il colore delle colonie è bianco grigio pallido, mentre il retro è incolore. Caratteristiche microscopiche Le ife sono ialine, settate, solitamente sottili e molto ravvicinate. All apice dell ifa, separate da un setto, si formano le fialidi; queste sono, erette e non ramificate. Le fialidi producono dei conidi, unicellulari, ialini, dalla forma cilindrica. Questi si aggregano a formare delle strutture più complesse di forma sferica. Solitamente i conidi appaiono circondati da un materiale gelatinoso.

12 Figura.b.4 Fotografia della specie fungina un vetrino dopo colorazione Gram Acremonium al microscopio ottico presa da Stemphylium spp Caratteristiche macroscopiche Le colonie crescono rapidamente alla temperatura di 25 C e maturano in cinque giorni. Si presentano dall aspetto vellutato o lanuginoso e di colore marrone scuro. Il retro appare nero. Caratteristiche microscopiche Le ife sono settate e di colore marrone chiaro. Da queste si dipartono i conidiofori, poco ramificati. All estremità dei conidiofori, tramite una cicatrice, proliferano i conidi. Questi sono di un colore che va dal marrone chiaro a quello scuro e presentano un tipico restringimento nel setto centrale. Essi hanno una forma ovale e sono singoli al termine di ogni conidioforo. Questa caratteristica differenzia questo microrganismo da Alternaria nella quale è tipica la presenza di tre o quattro conidi in successione.

13 Figura.b.5 Fotografia della specie fungina Stemphylium al microscopio ottico presa da una piastra di coltura Figura.b.6 Fotografia della specie fungina Stemphylium al microscopio ottico presa da un vetrino dopo colorazione Gram Figura.b.7 Fotografia al SEM di un conidio della specie fungina Stemphylium Il dipinto La Madonna con Bambino Da questo dipinto è stato isolato un fungo di cui non è stata possibile l identificazione, in quanto non si sono sviluppati i conidi, necessari al riconoscimento della specie microbica in esame. Specie non caratterizzata Figura.c.1 Foto di una piastra del fungo non identificato Caratteristiche macroscopiche La colonia si sviluppa molto rapidamente, sviluppandosi abbondantemente già dopo due giorni di incubazione. Essa ha un aspetto lanuginoso e si presenta di colore bianco. Il retro appare incolore. Caratteristiche microscopiche Al microscopio ottico le uniche strutture visibili sono le ife. Queste sono ialine, settate e molto ramificate. Una caratteristica presente in tutte le piastre di coltura seminate con questo fungo è la presenza di gocce di acqua condensata, che vengono assorbite dalle ife del microrganismo durante

14 la crescita. Al microscopio a scansione non è stata visualizzata alcuna struttura Figura.c.2 Fotografia al microscopio ottico della specie fungina non identificata presa da un vetrino. Figura.c.3 Fotografia della specie non caratterizzata al microscopio ottico presa da un vetrino dopo colorazione Gram Conclusioni Tramite tecniche tradizionali di coltivazione delle specie fungine in laboratorio è stato possibile identificare cinque funghi, due provenienti dal dipinto La Madonna di Otranto e tre provenienti dal dipinto La Vergine incoronata. La specie proveniente dal dipinto La Madonna con Bambino non è stata identificata. Per quanto riguarda il primo dipinto (La Madonna di Otranto) entrambe le specie identificate sono state prelevate in diversi punti di campionamento dalla superficie del dipinto, la quale risultava uniformemente ricoperta da una patina bianca, di aspetto polveroso. Esse si sviluppano sulle piastre di coltura già dopo due o tre giorni dall incubazione e crescono velocemente a 25 C. In particolare la specie Penicillium mostra una velocità di crescita estremamente rapida, rispetto all altra specie isolata, Trichoderma. Il secondo dipinto (La Vergine Incoronata) presentava un attacco biologico da tre specie fungine: la specie prelevata dalla patina nera presente sul retro del dipinto è stata identificata come Alternaria, quella prelevata dalla patina bianca, anch essa presente sul retro, è stata identificata come Stemphylium, mentre Acremonium è la specie fungina isolata dalla superficie. In questo dipinto, a differenza del precedente, l attacco biologico era maggiormente evidente sul retro, in cui si potevano notare delle muffe lanuginose, di colore prevalentemente bianco e in parte nero, diffuse abbondantemente sulla tela. Tra le specie isolate, Acremonium, dimostra una velocità di crescita più moderata, sviluppandosi sui terreni di coltura dopo circa cinque giorni di incubazione. Questi riscontri sono in accordo con quelli riportati in letteratura, in quanto le specie fungine identificate sono tra le maggiori responsabili del biodeterioramento dei dipinti mobili su tela. Infine il terzo dipinto, La Madonna con Bambino, presentava una patina biologica solo sulla superficie, anch essa di colore

15 bianco e di aspetto polveroso, senza offuscare completamente il disegno sottostante. La patina biologica era diffusa in maniera meno omogenea di quella presente sul dipinto La Madonna di Otranto. In questo caso la specie fungina isolata era quella che presentava in assoluto delle modalità di crescita più rapide rispetto a tutte le altre specie identificate. La coltivazione in laboratorio di questa specie non ha portato alla sua identificazione, in quanto non si sono sviluppati i conidi e le spore, fondamentali per il riconoscimento e la ricostruzione tassonomica dei microrganismi. Al microscopio ottico, infatti, l unica struttura osservabile sono le ife settate e ialine, non caratteristiche per l identificazione. Non è stato possibile invece osservare la specie al microscopio elettronico, in quanto, anche dopo la metallizzazione, il microrganismo appariva come un corpo informe, non conduttore, in cui non era possibile evidenziare nessuna struttura.