UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI ROMA TOR VERGATA. Facoltà di Medicina e Chirurgia anno accademico 2007/2008 VIROLOGIA GENERALE T.G.

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI ROMA TOR VERGATA Facoltà di Medicina e Chirurgia anno accademico 2007/2008 VIROLOGIA GENERALE T.G.

2 La scoperta dei virus Prima descrizione di patologia di origine virale: Vaiolo in Cina nel X secolo a.c. Alterazioni simil-vaiolose nella mummia del faraone Ramsete II (circa 2000a.C.). Tentativi di prevenzione e cura di patologie di origine virale in atto prima della scoperta dei virus stessi (Jenner, vaccinazione antivaiolosa alla fine del 700). Prima identificazione di virus: fine dell 800 da parte di Loeffler (afta epizootica).

3 Virus: proprietà distintive Agenti patogeni in grado di infettare cellule animali, vegetali e batteriche. Le particelle virali complete, virioni, sono caratterizzate da dimensioni estremamente modeste: nm. Sono definiti parassiti endocellulari obbligati perché possono replicarsi soltanto all interno di cellule viventi: essi non sono in grado di produrre e di immagazzinare energia né di provvedere alla replicazione delle proprie unità costitutive. Sono caratterizzati da una semplicità di organizzazione strutturale. Possiedono particolari modalità di replicazione.

4 Virus: proprietà distintive I virus rappresentano la forma vivente piu semplice. Non hanno una compartimentazione di tipo cellulare. Sono, a tutti gli effetti, dei semplici aggregati macromolecolari forniti di, ed in grado di trasferire, informazioni genetiche. Alcuni agenti infettanti subvirali (viroidi) sono costituiti da solo materiale genetico (RNA) senza guscio proteico. Altri, i prioni, sarebbero costituiti da soli frammenti glicoproteici autoreplicanti, senza acido nucleico. Alcuni di essi colpiscono il sistema nervoso, determinando malattie mortali tutt oggi incurabili (kuru, scrapie, malattia di Creutzfeld-Jacob). Sono al limite tra forma vivente e non vivente. Electron micrograph of PRION PROTEIN (scrapie associated fibrils) Bar=100nm (Courtesy of Dr. A.C. Scott of Central Veterinary Laboratory, UK)

5 Virus: proprietà distintive Date le loro caratteristiche, i virus sono assolutamente incapaci di replicarsi al di fuori delle cellule bersaglio. Sopravvivono un tempo limitato (pochi minuti o alcuni giorni, a seconda del tipo virale) nell ambiente extracellulare, senza mai replicarsi fuori dalle cellule. Come parassiti intracellulari obbligati, i virus necessitano non solo degli elementi nutritivi prodotti dalle cellule ospiti, ma soprattutto dei sistemi di trascrizione e traduzione di tali cellule. Contengono enzimi propri indispensabili per il ciclo replicativo (polimerasi, proteasi, ecc). Tutti gli altri enzimi sono resi disponibili dalla cellula ospite.

6 Organizzazione del poliomavirus

7 Virus: proprietà distintive I virus attraversano i comuni filtri, sono invisibili al microscopio ottico (con l eccezione di alcuni virus particolarmente grandi, quali i poxvirus) ma visibili al microscopio elettronico (meglio a trasmissione). Determinano spesso, nelle cellule infettate, la presenza di corpi inclusi intranucleari o citoplasmatici. Micrografo con i virus numerosi di rabbia (piccolo scuro-grigio asta-come le particelle) ed i corpi di Negri, più grandi inclusioni cellulari tipiche dell'infezione di rabbia.

8 Crescita

9 Virus: proprietà distintive Sono coltivabili in vitro in cellule isolate da organismi, o in batteri (a seconda del tipo virale). Alcuni (Orthomyxovirus, paramyxovirus) possono essere coltivabili con facilita in uova embrionate. Hanno resistenza variabile al ph. Questo regola la loro patogenicita - Es. Rinovirus sono distrutti a ph3 (ph gastrico di circa 1) e pertanto sono non patogeni per l apparato gastrointestinale. - Altri picornavirus sono resistenti al ph gastrico e pertanto patogeni (enterovirus).

10 Virus: proprietà distintive I virus rappresentano un sistema altamente sofisticato di trasferimento genetico da cellula a cellula. Tramite i virus, e possibile modificare il corredo genetico (e quindi fenotipico) di una cellula, favorendone, quindi, l acquisizione di nuovi caratteri. Data questa loro caratteristica naturale, sono usati, nella manipolazione genetica, come vettori finalizzati al trasferimento di nuovi caratteri a cellule infettabili da un determinato virus.

11 Virus: proprietà distintive Sono concentrabili in vitro solo con l uso delle ultracentrifughe (20000 e piu giri al minuto). La ultracentrifugazione su gradiente di densità permette di separare particelle virali della stessa specie virale, ma aventi densità leggermente diversa a causa di quantità diverse di proteine o di acido nucleico presente. L esame al microscopio elettronico permette sia la conta delle particelle virali, sia la loro caratterizzazione morfologica. Human immunodeficiency viral particles are seen at medium magnification in this electron micrograph.

12 Virus: proprietà distintive A seconda del loro specifico tropismo, possono infettare cellule vegetali (virus del tabacco, della patata, ecc), batteri (batteriofagi, ognuno specifico per una determinata specie batterica), e cellule animali (virus di insetti, pesci, uccelli, mammiferi). Electron micrograph of TMV particles VIRUS H5N1 O BATTERIOFAGO INFLUENZA AVIARIA

13 Virus: proprietà distintive I VIRUS SONO INSENSIBILI AGLI ANTIBIOTICI

14 Costituenti virali Core Capside Capsomero Acido nucleico più ogni molecola che ne determina la stabilità Struttura proteica che racchiude l acido nucleico o il core Unità proteica che, ripetuta, forma il capside icosaedrico Nucleocapside Acido nucleico più capside Envelope Peplomeri Virione Involucro lipoglicoproteico esterno Proiezioni superficiali che protrudono dall envelope Particella virale completa come si può osservare al di fuori della cellula

15 Composizione chimica Virus nudi acido nucleico proteine Virus rivestiti (con envelope) acido nucleico proteine lipidi carboidrati Lipidi e carboidrati sono contenuti nella membrana limitante esterna: sono identici a quelli della cellula ospite e non sono codificati dal virus

16 Proteine virali Si distinguono: Proteine funzionali che permettono ad es. all acido nucleico virale di replicarsi (DNA-o RNA-polimerasi) Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle virali come costituenti del capside o come strutture particolari (es. le emoagglutinine) presenti nell envelope Proteine che alterano alcune funzioni e strutture della cellula ospite Proteine strettamente associate agli acidi nucleici Proteina di matrice o M

17 MORFOLOGIA VIRALE I virus, nella loro forma extracellulare (virione), hanno una struttura cristallizzata tipica Di contro, all interno delle cellule in cui si replicano, non sono mai reperibili in forma completa, eccetto che poco prima della loro uscita dalla cellula (fase di gemmazione) Di norma, all interno delle cellule e possibile trovare materiale genetico del virus, e proteine virali piu o meno assemblate

18 HIV

19 Morfologia virale La struttura di base dei virus consiste nell acido nucleico e in un rivestimento proteico detto capside. Il genoma contiene tutta l informazione genetica necessaria per la replicazione; è molto labile ad agenti denaturanti (nucleasi, esterasi, forza ionica ecc.) e non può da solo penetrare nella cellula ospite. La quantità di acido nucleico è indice della complessità strutturale del virione. Il capside costituisce una struttura continua e impermeabile agli agenti esterni e protegge l acido nucleico. Alcune proteine che lo compongono possiedono una specifica affinità per particolari recettori della membrana citoplasmatica della cellula ospite. Queste strutture permettono il legame del virus alla cellula e la penetrazione dell acido nucleico. Alcuni virus posseggono una membrana limitante esterna detta envelope, (o pericapside o peplos). I virus con il solo capside vengono definiti nudi, quelli con envelope vengono definiti rivestiti. I virus più grandi possono avere una struttura più complessa.

20 Pericapside (peplos, envelope) Strato lipidico (in alcuni casi glicoproteico) esterno all involucro, presente solo in alcune famiglie di virus (orthomyxovirus, herpesvirus, retrovirus, poxvirus, ecc.). E costituito da lipidi della membrana della cellula infettata, rimasti intorno al virus vero e proprio al momento della fuoriuscita dalla cellula stessa ( budding ). Contiene anche alcune glicoproteine virali, che fungono da primo recettore virale nei confronti delle cellule bersaglio. Svolge funzione di protezione, di riconoscimento antigenico (emoagglutinina del virus influenzale) e di penetrazione nella cellula ospite tramite il meccanismo di fusione con la membrana cellulare. La presenza del pericapside rende ragione della sensibilita di alcuni virus ai disinfettanti organici (eteri, alcooli) in grado di sciogliere i lipidi.

21 Componenti dell involucro virale (envelope) La base di tutti gli involucri virali è una membrana lipidica acquisita dalla cellula ospite durante l assemblaggio. Proteine virali vengono inserite nella membrana lipidica. La grande maggioranza di queste sono glicoproteine (oligomeri).

22 Funzioni delle proteine dell involucro Aggancio, fusione ed entrata (es. HA) Attività enzimatica (es. NA) Canale ionico (es. M2) Antigeni principali (es. HA, NA) Orthomyxovirus

23 Virus con involucro semplice Contatto diretto tra proteine esterne e capside Sezione equatoriale di un Togavirus con ricostruzione dell immagine

24 Virus con involucro a livelli proteici addizionali Struttura di un herpesvirus

25 Capside E proprio del virus, e geneticamente determinato e costituito da subunità proteiche disposte in modo regolare, codificate dal genoma virale. Dato il limitatissimo patrimonio genetico dei virus, le proteine costituenti i capsomeri (unità base del capside) sono molto poche, specifiche del virus, e in grado di interagire con i componenti sulla superficie cellulare fungendo da recettori. Conferisce resistenza al materiale genetico virale nei confronti delle nucleasi presenti nei fluidi.

26 Il capside è costituito da proteine codificate dal genoma virale la cui ridotta lunghezza permette una sintesi limitata di proteine. Il capside in genere è quindi costituito da unità ripetitive di una o poche proteine. Le proteine destinate a formare il capside sono capaci di autocombinarsi (assemblaggio) seguendo due schemi fondamentali definiti: -a simmetria elicoidale Simmetrie del capside -a simmetria cubica (detta anche icosaedrica)

27 La simmetria virale, dovuta all interazione genoma-proteine, puo essere: a. Elicoidale, quando l acido nucleico si avvolge sulla struttura proteica di base, determinando, al microscopio elettronico, una forma oblunga (virus del mosaico del tabacco, orthomyxovirus, rhabdovirus., ecc). Tutte le subunita proteiche sono identiche tra loro b. Icosaedrica, quando i capsomeri (unita base dell icosaedro costituente il capside) sono organizzati a costituire una struttura poliedrica regolare con 20 facce costituite da triangoli equilateri. All interno e situato il nucleocapside, aderente in alcuni punti ai capsomeri. E presente nella maggioranza dei virus c. Complessa, A struttura non classificabile secondo canoni ristretti: batteriofagi, poxvirus, ecc. Tutti i virus di un determinato tipo saranno assolutamente uguali tra loro

28 Virus a simmetria elicoidale Le sub-unità proteiche, dette protomeri, si dispongono lungo un asse elicoidale intorno all acido nucleico a formare il nucleocapside che assume struttura tubulare. Nella maggior parte dei casi i virus animali con questa simmetria possiedono l envelope. Vari nucleocapsidi si differenziano per lunghezza, diametro, passo dell elica e numero di protomeri per spira. Gli involucri pericapsidici conferiscono ai virioni forma pleiomorfa.

29 Influenza virus

30 Virus della rabbia Rabdovirus yemando de una inclusión (cuerpo de Negri) hacia el retículo endoplásmico en una célula del sistema nervioso. A. Cuerpo de Negri. B. Note la abundante ribonucleoproteína en la inclusión. C. Rabdovirus yemando. CDC Rabdovirus en una célula epitelial de un pez Dennis Kunkel Microscopy, Inc

31 Virus a simmetria icosaedrica Il capside in questo caso costiuisce una sorta di guscio per il genoma. Le sub-unità proteiche costituite da una singola molecola polipeptidica o da un aggregato di molecole peptidiche si riuniscono a formare le unità morfologiche, dette capsomeri, del capside. I capsomeri si combinano a formare solidi regolari. L icosaedro è un solido costituito da 20 facce triangolari e 12 vertici. I vari virus con questa simmetria si differenziano per numero e distribuzione dei capsomeri. Alcuni sono virus nudi, altri posseggono l envelope.

32 Ricostruzione di differenti particelle virali a simmetria icosaedrica

33 Caratteristiche virali Elementi caratterizzanti alcune famiglie di virus: a. Rotavirus: doppio capside (struttura a ruota). b. Adenovirus: estroflessione dal capside che funge da recettore virale sulla superficie cellulare. c. Arenavirus: aspetto sabbioso determinato dall inglobamento di ribosomi durante il ciclo replicativo intracellulare. Arenavirus Electron micrograph of human adenovirus Electron micrograph of rotavirus from stool sample

34 Struttura dei capsidi virali Simmetria complessa poxvirus

35 Simmetria complessa

36 Batteriofago T4: simmetria complessa

37 Core (o nucleocapside) Area interna del virus, in cui si trova il materiale genetico del virus (a RNA o a DNA, a seconda del tipo virale), frammisto a proteine anch esse proprie del virus, in parte strutturali (che impacchettano e stabilizzano il genoma) e in parte funzionali (polimerasi, proteasi, ecc.). Puo essere compatto (Alfavirus), Filamentoso (Paramyxovirus), multisegmentato (Ortomyxovirus).

38 Perché la costruzione di una sub-unità Auto assemblamento Capside virale è comune a tutti i virus? Nel 1955, Fraenkel-Conrat e Williams dimostrarono che quando miscele di RNA di virus del mosaico del tabacco purificato (TMV) e proteina coat venivano incubate insieme, si formavano particelle di virus elicoidale. Questo indica che la particella di virus si ordina da sola e predispone la struttura con la minima energia libera, ad es. la più stabile. Incorporare copie multiple di una o diverse sub-unità è presumibilmente un modo semplice per portare a termine tutto ciò.

39 Capside virale I virus nudi di origine animale hanno una simmetria esclusivamente di tipo icosaedrico. I virus con envelope possono avere il nucleocapside sia a simmetria elicoidale sia a struttura icosaedrica. I virus più grandi (come i Poxvirus) possono avere una struttura morfologica più complessa.

40 Genoma virale Tutti i virus contengono un solo tipo di acido nucleico. Quelli a RNA, in particolare, rappresentano un eccezione in natura, in quanto la loro informazione genetica non e contenuta nel DNA. A seconda del tipo virale, il genoma codifica per un numero diverso di proteine, da un minimo di 3 a un massimo di alcune centinaia. A seconda dei vari tipi di virus, il genoma (DNA o RNA) puo essere a singolo o doppio filamento, lineare o segmentato in varie porzioni (es. virus influenzale) ognuna codificante per una proteina. Tra i virus a RNA, alcuni hanno il filamento cosiddetto positivo (che funge anche da RNA messaggero), altri hanno il filamento negativo (che deve sintetizzare, sul suo stampo, un filamento complementare di RNA che fungera da messaggero).

41 Genoma dell epatite B

42 Genoma virale E costituito da un solo tipo di acido nucleico: DNA o RNA Virus a RNA: Ribovirus Possiedono un RNA a singola elica (tranne la famiglia dei Reovirus che ha un RNA a doppia elica), del peso di circa 2-10 x 10 6 daltons, a volte (orthomyxovirus) diviso in frammenti. Nei reovirus e a doppio filamento segmentato (piu resistente del singolo filamento all RNAsi e ai disinfettanti).

43 VIRUS AD RNA Si dividono in 2 sottoclassi: Virus con RNA a polarità positiva (+) che può fungere nella cellula direttamente da RNA messaggero. Virus con RNA a polarità negativa (-) che funge da stampo per la sintesi dell RNA messaggero- questi virus hanno l enzima RNA polimerasi RNA dipendente associato al virione. I Reovirus e alcune famiglie di virus a RNA a polarità negativa hanno un genoma con sequenze indipendenti di RNA (virus influenzale con 8 frammenti, bunyavirus con 3, Reovirus con 12).

44 Genoma virale Virus a DNA: Deossiribovirus Normalmente hanno un DNA a doppia elica con filamento unico e lineare. Alcuni virus (Papovavirus ed Hepadnavirus) contengono DNA circolare e altri (Parvovirus) hanno un DNA monocatenario. La grandezza del genoma dà la misura della complessità del virus e della sua replicazione (più evidente nei virus a DNA rispetto ai virus a RNA).

45 VIRUS A DNA DNA: La molecola di DNA e unica, del peso da 1,5 x 10 6 daltons (parvovirus, gran parte dei batteriofagi) a 200 x 10 6 daltons (poxvirus), solitamente a doppio filamento lineare, con l eccezione dei parvovirus (singolo), papovavirus (doppio filamento circolare), hepadnavirus (doppio filamento incompleto, circolare). Il contenuto in guanina-citosina nei retrovirus (che si integrano nel genoma delle cellule ospiti) e simile a quello riscontrato nelle cellule stesse (circa 50% del totale), e questo probabilmente favorisce l interazione tra i due DNA.

46 Enzimi virali

47 Altri componenti virali

48 Proteine non strutturali Aiutano la replicazione virale ma non sono incorporate nel virione Enzimi necessari per la sintesi e la replicazione del DNA (es. RNR, TK, DNA polimerasi di Herpesviruses) Proteine che influiscono sulla fisiologia della cellule (es. E6/E7 di papillomavirus umani) Proteine che sopprimono le difese della cellula ospite (es. Inibitori della presentazione di antigeni)

49 Alcune forme virali Adenovirus

50 Alcune forme virali Papillomavirus

51 Alcune forme virali Herpesvirus

52 Alcune forme virali Paramyxovirus Orthomyxovirus

53 Alcune forme virali Vesicular stomatitis virus

54 Alcune forme virali Human immunodeficiency virus

55 Alcune forme virali Ebola virus

56 Classificazione virale Si basa su criteri morfologici, strutturali, chimici e replicativi: forma,dimensioni, tipo e struttura del genoma, strategia replicativa In base a queste caratteristiche i virus vengono suddivisi in: Famiglie (con suffisso viridae) Sottofamiglie (generalmente con suffisso virinae) Generi (con suffisso virus) Specie Ulteriori suddivisioni in sottospecie, tipi, ceppi ecc. vengono di volta in volta stabilite da apposite commissioni per la nomenclatura in base a criteri che risultino via via accettati.

57 Classificazione virale Nella pratica medica si continuano a indicare i virus secondo la nomenclatura comune: con il nome virus seguito da quello della malattia che determina nell ospite principale (per es. virus del morbillo, dell influenza, della poliomielite ecc.) oppure con il nome che gli è stato attribuito al momento dell isolamento (per es. virus Ebola, di Epstein-Barr, Norwalk ecc.).

58 L attuale classificazione si basa: sul tipo di genoma (DNA o RNA) e la sua configurazione (mono o bicatenario, lineare o circolare, monofilamento o segmentato, a polarità positiva o negativa) sul tipo di simmetria sulla presenza di involucro pericapsidico sul meccanismo di replicazione Classificazione virale Molti virus non sono stati ancora classificati oppure lo sono solo provvisoriamente Per alcuni agenti non è ancora stata accertata la natura virale (per es. gli agenti delle encefaliti spongiformi dell uomo e di vari animali)

59 Classificazione dei virus

60 Criteri di classificazione International Committee on Taxonomy of Viruses Ospiti: animali, piante, batteri. Natura dell acido nucleico nel virione : RNA o DNA Simmetria del capside: icosaedrico, elicoidale o complesso Presenza o assenza di un involucro Architettura del genoma: ds, ss, frammentato, dimensione Omologia di sequenza Strategie di replicazione

61 Nomenclatura: alcune regole basilari Ordine ( - virales) Famiglia ( - viridae) Sottofamiglia ( -virinae) Genere ( - virus) Specie (common names)

62 Nomenclatura: alcune regole basilari Picornaviridae famiglia genere o sottofamiglia enterovirus cardiovirus rhinovirus aphthovirus hepatovirus specie poliovirus mengovirus rinovirus FMDV-C virus dell epatite A 67 sierotipi > 100 sierotipi

63 Schemi di classificazione per virus animali

64

65 Classificazione basata sulla sequenza Basata sulla % di identità delle sequenze genomiche Consente la costruzione di un albero filogenetico Consente una comprensione migliore della relazione filogenetica tra gli ordini inferiori

66 < 60% > 60% < 70% > 70% < 90% > 90% < 100%

67 Albero filogenetico contenente le sequenze di 118 tipi di papillomavirus

68 Il sistema di classificazione Baltimore Basato sulla natura e polarità dei genomi virali Descrive le relazioni obbligatorie tra il genoma virale e il suo mrna

69 Il sistema di classificazione Baltimore Class I ds DNA

70 Il sistema di classificazione Baltimore Class II ss DNA Class I and VII ds DNA

71 Il sistema di classificazione Baltimore Class II ss DNA Class I and VII ds DNA Class III ds RNA (+/-)

72 Il sistema di classificazione Baltimore Class II ss DNA Class I and VII ds DNA Class IV ss RNA (+) Class III ds RNA (+/-)

73 Il sistema di classificazione Baltimore Class II ss DNA Class I ds DNA Class IV ss RNA (+) Class V ss RNA (-) Class III ds RNA (+/-)

74 Il sistema di classificazione Baltimore Class II ss DNA Class I ds DNA Class VI ss RNA (+) Class IV ss RNA (+) Class V ss RNA (-) Class III ds RNA (+/-)

75 Il sistema di classificazione Baltimore Class I ds DNA Picornavirus Flavivirus Togavirus Class II ss DNA Adenovirus Herpesvirus Papovavirus Poxvirus Orthomyxovirus Paramyxovirus Rhabdovirus Parvovirus (B19) Retrovirus Reovirus Class VI ss RNA (+) Class IV ss RNA (+) Class V ss RNA (-) Class III ds RNA (+/-)