Microbiologia Clinica

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Lorenza Mattei
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1 Microbiologia Clinica Diagnostica delle malattie da infezione Obiettivo : determinazione quali-quantitativa dell agente causa di una patologia

2 Microbiologia classica Ricerca Diretta Ricerca Indiretta Test di emoagglutino-inibizione inibizione virale

3 Principi generali della diagnosi microbiologica delle malattie causate da batteri L'esame batteriologico: dal prelievo al referto

4 RUOLO DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA CLINICA Studio della etiopatogenesi della malattia da infezione attraverso tecniche in grado di fornire informazioni sull esito dell interazione ospite -parassita Perché l indagine microbiologica?

attraverso tecniche in grado di fornire informazioni sull

5 RUOLO DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA CLINICA * Diagnosi etiologica * Valutazione della progressione della malattia * Efficacia dei farmaci antimicrobici * Epidemiologia e prevenzione * Eradicazione del patogeno

della malattia * Efficacia dei farmaci antimicrobici

6 M E D I C O M I C R O B I O L O G O Indagini microbiologiche Diagnosi clinica Sospetto eziologico Ipotesi diagnostica Scelta del campione Diagnosi eziologica Isolamento del patogeno Reattività immunologica Evoluzione della malattia Monitoraggio farmaci Statistiche epidemiologiche iter diagnostico Attendibilità del risultato

Isolamento del patogeno Reattività immunologica Evoluzione della malattia

7 Valutazione della progressione della malattia

Farmaco+ambiente+patogeno sede infezione concentraz. farm.

8 EFFICACIA DELL ANTIBIOTICO in vitro in vivo Vantaggio per il farmaco..... vantaggio per il patogeno farmaco + patogeno Farmaco+ambiente+patogeno sede infezione concentraz. farm. natura infezione biologia del patogeno manovre strumentali altre terapie condizioni del paziente effetto post-antibiotico.

9 Epidemiologia e prevenzione Identificazione dei ceppi più virulenti Studio della fonte del contagio (umana, animale, etc.) Modalità di trasmissione dell agente infettante Valutazione di ceppi per lo sviluppo di vaccini Controlli pre- post-vaccinali Prevenzione dei contagi Monitoraggio degli ambienti

) Modalità di trasmissione dell agente infettante Valutazione di ceppi per

10 OBIETTIVO: Eradicazione del patogeno Terapia empirica [Ragionata] Terapia mirata [Prove di sensibilità in vitro ] Terapia personalizzata [Monitoraggio]

11 Campione DIAGNOSI ETIOLOGICA Osservazione microscopica Isolamento in coltura del patogeno Identificazione del patogeno Prove di sensibilità in vitro Sierologia (Antigeni e Anticorpi) Genomica (Biologia molecolare DNA, RNA-)

patogeno Prove di sensibilità in vitro Sierologia

12 La finalità delle indagini microbiologiche, comprensive di metodiche dirette e/o colturali, è quella di ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili del processo infettivo Duplice scopo: identificarli e, ove indicato, di determinare la sensibilità ai farmaci Per garantire la significatività dei risultati il microbiologo deve poter disporre di campioni biologici idonei, che contengono tutti e soltanto i microrganismi responsabili del processo patologico

di determinare la sensibilità ai farmaci Per garantire la significatività dei risultati il microbiologo deve poter

13 Punti critici: Tempi di raccolta dei campioni Prelievo dalla sede anatomica del processo patologico Contaminazioni Trasporto Compilazione modulo di richiesta

14 Tecniche batteriologiche

15 Diagnosi di infezione Raccolta e conservazione dei campioni Esame microscopico Esame colturale Sierologia Identificazione Antibiogramma Tecniche di amplificazione genica

16 Raccolta del campione Tampone faringeo Espettorato Broncoaspirato Feci Urine Tampone da ferita infetta Sangue Liquor

17 Il prelievo per l esame batteriologico

18 Esame batteriologico Esame virologico Il prelievo per l esame microbiologico Esame micologico Esame parassitologico

19 Criteri generali La raccolta deve avvenire prima dell inizio della terapia e nei periodi ottimali per lo stadio dell infezione La raccolta deve essere effettuata nella sede anatomica dell infezione, prelevando una quantità sufficiente di materiale Evitare contaminazioni esogene ed endogene Utilizzare appropriati sistemi di raccolta Identificare il campione (dati paziente, natura e origine del campione) Pronta consegna al laboratorio Fornire adeguate notizie cliniche

di materiale Evitare contaminazioni esogene ed endogene Utilizzare appropriati sistemi di raccolta Identificare il

20 L emocoltura Laddove la terapia antibiotica sia già in atto, è comunque possibile effettuare l esame emocolturale grazie alla diluizione del sangue nel terreno di coltura e ad alcuni substrati (resine o carbone), presenti nel flacone, in grado di adsorbire le molecole antibiotiche.

diluizione del sangue nel terreno di coltura e ad alcuni substrati

21 Quando raccogliere il campione? Esame batteriologico: Feci: Nel momento acuto del processo infettivo, nel periodo di diarrea attiva, al più presto entro l insorgere dei sintomi (entro 4 giorni) Emocoltura: Praticare tre prelievi consecutivi ad intervalli di min dall inizio del brivido o del rialzo febbrile Es. parassitologico: Urine: Ricerca uova di Schistosoma: 50 ml di urine del mitto terminale meridiano (picco di escrezione 12-15) Sangue:Plasmodium spp: la raccolta del campione va effettuata dopo 2 ore dal rialzo febbrile Microfilarie: periodicità di esposizione al vettore Esame virologico: Fattori condizionanti: agente etiologico sospettato materiale da prelevare tecnica diagnostica da utilizzare

22 Tampone rettale: pulire la zona anale con acqua calda senza usare disinfettanti, inserire il tampone per 2 cm e ruotarlo contro le pareti delle mucose per 30. Tampone faringeo Inserire il tampone tra i pilastri tonsillari e dietro l ugola; strofinare le zone tonsillari e qualsiasi sede con segno di flogosi. Evitare il contatto del tampone con la lingua, le guance o le arcate dentarie e le contaminazioni da saliva Tampone vaginale: Prelievo dal fornice posteriore mediante introduzione di uno speculum sterile. Si raccomanda l uso di cytobrush per ottenere materiale con ricca cellularità per la ricerca di Chlamydia Esame micologico: capelli: Strappare capelli dall area infetta o asportarli con la lama di un bisturi unghie: Detergere con alcool etilico al 70%.Scarificare in profondità cercando di ottenere lamine sottili o polvere

23 Esempi di modalità di prelievo (1) Urine da mitto intermedio Detergere con sapone lavare e asciugare l area periuretrale. Dopo aver scartato il primo getto si raccoglie direttamente nel recipiente sterile la seconda parte delle urine emesse. Urine da catetere Clampare il catetere immediatamente a valle del dispositivo di prelievo Disinfettare con un impacco di alcool al 70% il dispositivo del catetere predisposto per il prelievo Aspirare con una siringa la quantità di urina necessaria e dispensarla nell apposito contenitore sterile Espettorato Il prelievo va effettuato dopo gargarismo con acqua distillata e rimozione delle protesi dentarie mobili.

24 Esempi di modalità di prelievo (2) Lesioni aperte Piaghe, ulcere, ferite: detergere la cute con sol. fisiologica sterile Non utilizzare soluzione disinfettante Lesioni chiuse Vescicole, pustole, foruncoli:disinfettare la zona prima del prelievo Ferite profonde, ascessi, aspirati tessuti molli: aspirare asetticamente con siringa ed inviare al laboratorio dopo aver tappato la siringa stessa. Es. micologico: Detergere ove possibile l area con disinfettanti non fungicidi (alcool etilico 70%) o sol. fisiologica

25 Tamponi La fibra che costituisce il tampone è di rilevante importanza nella fase preanalitica E opportuno utilizzare tamponi in dacron o rayon su asta di plastica o metallo Non utilizzare alginato di calcio (interferisce con HSV,virus con capside, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum e Nesseria gonorrhoeae) Il legno risulta tossico per le colture cellulari per la possibile presenza di formaldeide

26 Tamponi I tamponi secchi vanno utilizzati solo se la semina in coltura è immediatamente successiva al prelievo Terreni di trasporto (Stuart, Amies, Cary-Blair): Proteggono i batteri da: acidi grassi tossici ph sfavorevoli Non incrementano la crescita danno e da la O 2 moltiplicazione atmosferico batterica Provetta disegnata secondo il sistema Venturi

27 Contenitori sterili Per una più agevole raccolta del campione è preferibile utilizzare contenitori ad apertura larga

28 Tempi di consegna al laboratorio Esame batteriologico e micologico Coprocoltura: Mescolare ad un terreno di trasporto (Cary-Blair o soluzione glicerosalina tamponata), refrigerare fino alla semina (per più di 3 giorni, congelamento immediato a -20 C. i campioni congelati possono essere esaminati fino a 7 gg dalla raccolta) Urinocoltura: Conservare in frigo a 4 C per un massimo di 12-24h. Raccogliere il campione in appositi contenitori con conservante (acido borico) Tampone faringeo: L utilizzo di tamponi con mezzo di trasporto permette il trattamento del campione al massimo dopo 48 h a temperatura ambiente Esame micologico: Il campione dovrebbe essere umidificato per impedirne l essiccamento. E possibile conservare il campione a 4 C per qualche ora (eccetto Zigomiceti): sangue e liquor a 30-37, i campioni dermatologici a C

29 Tempi di consegna al laboratorio Esame parassitologico Feci: Campioni liquidi: esaminare entro 30 Campioni non formati: entro 1h Campioni formati: entro 12h Se il campione non può giungere entro 6-12 ore in laboratorio è opportuno miscelarlo nella proporzione di 1:3 con sostanza conservanti quali: Formalina (5-10%) no colorazioni permanenti SAF (sodio acetato, acido acetico e formaldeide) colorazioni PVA (acido polivinilico) colorazioni no concentrazione MIF (mertiolato, iodio e formalina) concentrazione no colorazioni concentrazione

30 Conclusioni L esito dell esame microbiologico è fortemente condizionato dalla qualità del campione Un campione non idoneo può determinare il mancato isolamento dei microrganismi veri responsabili dell infezione.

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