Denaturazione riduttiva / rinaturazione

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1 Protein Folding

2 Denaturazione riduttiva / rinaturazione ossidativa di RNase A. Page 277

3 Meccanismo di scambio di ponti S-S catalizzato t da tioli o da enzimi. i Page 278 Protein Disulfide Isomerase: PDI Protein Disulfide Isomerase: PDI Riaggiustamento dei ponti S-S in RNAsi A in 2 min

4 Page 278 Proinsulina porcina. L insulina matura e inibita nella sua attivita dal trattamento con PDI

5 Fattori determinanti il folding proteico α-eliche e foglietti-β β (60% in media) riempiono il volume proteico efficientemente Le principali fasi del folding sono guidate da residui interni (eff. Idrofobico) Tolleranza alle mutazioni Le strutture 3D delle proteine sono organizzate gerarchicamente (domini, sottodomini compatti, motivi,...)

6 Fattori determinanti il folding proteico Le proteine si adattano: il fold determina i contatti tra residui; i contatti tti tra residui i NON determinano il fold Esistono molti modi secondo cui i residui i interni in una proteina possono datattare il loro impaccamento T4-phage lysozyme: 164 res. >300 mutazioni

7 La struttura secondaria puo dipendere dalle proprieta dell intorno! dominio GB1 della proteina G di streptococco Residui verde (AATAEKFVFQY) α Residui cyan (EWTYDDATKTF) β sostituiti alternativamente con AWTVEKAFKTF 280 Page Le proteine risultanti mantengono il fold, e una denaturazione reversibile Il peptide Il peptide AWTVEKAFKTF isolato non e strutturato in soluzione

8 Struttura X-Ray di Rop, una proteina omodimerica composta da motivi αα associati in 4-helix bundle 281 Page Mutazione (guidata sulla base di propensioni dei residui) del 50% dei residui di GB1 (ottenendo un omologia di sequenza del 41% con Rop) converte la proteina nel fold di Rop

9 Paradosso di Levinthal Proteina di 100 residui Due gradi di liberta torsionali/residuo (phi,psi) 3 conformazioni accessibili per ogni grado di liberta torsionale 3 2x100 possibili conformazioni esplorate/sec Tempo richiesto per esplorare tutte le conformazioni: t = 20 x 10 9 anni! Le proteine si devono ripiegare seguendo un cammino definito, caratterizzato da conformazioni via via piu stabili (diminuizione di G)

10 Strumento per analisi stopped-flow 282 Page Tempo-morto: 50 μs 0.5 ms Uso di T-jump (10-30 C in 100 ns) Segnali spettroscopici: UV, CD Uso di scambio H/D pulsato, abbinato ad NMR

11 Page 282 Spettri di assorbimento UV di Phe, Trp, Tyr

12 Page 283 Spettri di dicroismo circolare (CD) di polipeptidi p p tipici

13 Scambio pulsato H/D (principio) Usato per seguire il corso del processo di folding di residui individuali nelle proteine Scambio di H + (debolmente acidi) in gruppi NH 2, -NH, -OH, con D 2 O I protoni impegnati in strutture secondarie, o nel cuore della proteina non scambiano con D 2 O

14 Scambio pulsato H/D (applicazione) i Proteina denaturata (es. urea) in D 2O refolding per diluizione (stp.flow) in H 2 O (a ph acido, dove non si ha H/D exchange) Dopo un dato Δt di refolding: aumento di ph, per favorire H/D exchange (scambieranno solo i D + ancora accessibili) Blocco dello scambio H/D (ph acido) Analisi NMR della proteina refolded per individuare i protoni scambiati nell intervallo Δt.

15 Fasi del folding Fase veloce burst iniziale: buona parte delle strutture tt secondarie sono realizzate entro pochi millisec dall inizio del folding. Guidata dal collasso idrofobico, che espelle molecole d acqua dal core della proteina in ripiegamento (misurato con fluorescenza di ANS, CD, maggiore protezione nello scambio H/D). Il burst porta al molten globule, contenente buona parte della struttura tt secondaria attesa, e con raggio di girazione 5-15% maggiore di quello della proteina folded. Catene laterali relativamente libere.

16 Fasi del folding Stabilizzazione delle strutture secondarie, e formazione dei proto-domini ( ms). Strutture ancora in parte fluttuanti; conformeri in interscambio. Stabilizzazione della struttura terziaria finale; espulsione definitiva di molecole d acqua; formazione di tutti i legami idrogeno... (richiede diversi i secondi; a seconda della complessita della proteina). Il processo di folding e considerato gerarchico, nella sua essenza. ΔG folding caratterizzato da valori bassi (-5, -10 kcal/mol)

17 Page 285 Folding Landscape. (a) An idealized funnel landscape.

18 Page 285 Folding funnels. (b) The Levinthal golf course landscape.

19 Page 285 Folding funnels. (c) Classic folding landscape.

20 Page 285 Folding funnels. (d) Rugged energy surface. La rappresentazione considerata piu verosimile

21 Page 286 Scheletro polipeptidico e ponti S-S in BPTI

22 Page 287 Rinaturazione di BPTI attraverso intermedi nonnativi

23 PDI ridotta catalizza il riarrangiamento di ponti S-S non-nativi Page 288 Chapt.9 Anim.Fig.18

24 Page 288 Sintesi di ponti S-S facilitata dalla forma ossidata di PDI.

25 Struttura 3D della forma ossidata della catena PDI(a) Page 289 -Cys-Gly-His-Cys-

26 Struttura 3D della forma ossidata della catena PDI(a) 289 Cys36 Page

27 FOLDING ASSISTITO DA CHAPERONINE

28 Diverse classi di Chaperon Heat-shock proteins (Hsp) Hsp70 Hsp40 procariotiche e eucariotiche (in E. coli DnaK DnaJ) ATP-driven refolding processes Chaperonine... Hsp90 folding di proteine della trasduzione del segnale e di recettori degli ormoni steroidei Nucleoplasmine, refolding/assembly dei nucleosomi Alcune classi di chaperon lavorano in concerto

29 Electron micrograph-derived 3D image of the Hsp60 chaperonin from the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. Page 291

30 X-Ray structure of GroEL (E.coli). Side view perpendicular to the 7-fold axis D. apicale D. interm. ATPγS D. equat. 7 x 2 x 547 res. Simm. D 7 (72) Page 292

31 X-Ray structure of GroEL. Top view along the 7-fold axis. 45 Angstroem Page 292

32 X-Ray structure of GroES as viewed along its 7-fold axis. 7 x 97 res. C 7 7 Page 293

33 Apical domain of GroEL in complex with a tight-binding 12-residue polypeptide (SWMTTPWGFLHP). Mutations abolishing binding of unfolded polypeptides (and of GroES) map at hydrophobic residues of the rim of the apical domain Page 295

34 X-Ray structure of the GroEL-Gro-ES-(ADP) 7 complex. cis-ring 7 ADP e 293 Page trans-ring

35 e 293 Page X-Ray structure of the GroEL-Gro-ES-(ADP) 7 complex.

36 X-Ray structure of the GroEL-Gro-ES-(ADP) 7 complex Å 3 Page Å 3

37 Il sistema GroEL/GroEs ha attivita ATPasica essenziale per il refolding delle proteine substrato

38 Domain movements in GroEL. (a) Ribbon diagram of a single subunit of GroEL in the X-ray structure of GroEL alone. Page 294

39 Page 294 Domain movements in GroEL. (b) A GroEL subunit in the X-ray structure of GroEL-GroES-(ADP) 7.

40 Page 294 Domain movements in GroEL. (c) Schematic diagram indicating the conformational changes in GroEL when it binds GroES.

41 Page 295 Apical domain of GroEL in complex with a tight-binding 12-residue polypeptide (SWMTTPWGFLHP).

42 Movements of the polypeptide-binding helices of GroEL. Page 295 (a) (b)

43 Reaction cycle of the GroEL/ES chaperonin system in protein folding. Le pareti della camera centrale (Anfinsen cage) sono idrofiliche (13 secondi) Page 296

44 298 Page 2 Schematic diagram of the mechanism of stretch-induced hydrogen exchange by the GroEL/ES system.

45 Rate of hydrogen-tritium exchange of tritiated RuBisCO. Page 297 Nero: curva di scambio T/H in RubisCO in soluzione (misurata in assenza del sistema GroEL-GroES-ATP) Rosso: curva di scambio T/H in RubisCO in soluzione (teorica) Blu: curva di scambio T/H in RubisCO calcolata per un sistema GroEL- GroES-ATP che rilascia RubisCO ad ogni ciclo.

46 Quante proteine si servono di GroEl/GroES ES in E. coli? Circa 300 (rispetto a 2500 proteine citoplasmatiche identificate nell esperimento) Labeling con 35 S-Met Ricerca della radioattivita associata alla chaperonina a tempi diversi Proteine kda, due o piu α/β domains (l (slow fld folders: assembly of sheets; easy misfolding) Le proteine che non legano GroEL probabilmente raggiungono lo stato folded rapidamente, e non lasciano patches idrofobici esposti per il legame con GroEL

47 Trends Biochem.Sci (1998) 23, 138.

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