Proteine di interesse terapeutico

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1 Proteine di interesse terapeutico Proteine come farmaci (es. insulina, anticorpi, ormoni, anticoagulanti, fattori della coagulazione) Proteine come antigeni per la produzione di vaccini (es. HBsAg) La produzione industriale di proteine terapeutiche richiede l uso della tecnologia del DNA ricombinante per ottenere le elevate quantità di proteina necessarie

2 Caratteristiche dei sistemi di produzione di proteine terapeutiche

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4 Biosintesi dell insulina nelle cellule b del pancreas Catena A Catena B 21 aa 30 aa Unite da due ponti S-S ESONE 1 ESONE 2 PREPROINSULINA Peptide segnale PROINSULINA C B A INSULINA Nell apparato di Golgi un enzima rimuove 33 aa che costituiscono il peptide C

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6 PRODUZIONE DI INSULINA RICOMBINANTE IN BATTERI - Plasmidi separati codificano per la catena A e B in ceppi di E. coli separati - Le catene A e B sono prodotte sotto il controllo del promotore lac come proteine di fusione con la regione N-terminale di LacZ - Le sequenze LacZ sono eliminate con trattamento con bromuro di cianogeno (scinde legami Met-X) - Le catene A e B sono mescolate assieme e tramite un processo chimico in condizioni ossidanti si formano i ponti S-S e viene purificata la forma nativa

7 Produzione di insulina ricombinante nel lievito Saccharomyces cerevisiae (via della proinsulina) Pro-insulina fusa al peptide segnale dell a-factor per produrre insulina secreta. Processamento mediato dalla proteasi Kex2, mini-peptide C, catena B mancante di Thr30 (che viene aggiunta in un secondo momento mediante transpeptidazione). Espressione costitutiva sotto il controllo del promotore TPI (triosofosfato isomerasi)

8 Schema del processo industriale di produzione dell insulina ricombinante mediante la via della proinsulina.

9 Analoghi dell insulina approvati per l uso come farmaci

10 Proprietà farmacocinetiche degli analoghi dell insulina

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12 Eritropoietina L eritropoietina (EPO) è un ormone che stimola la produzione di globuli rossi. E una glicoproteina di 165 aa con 4 catene di carboidrati (3 N- e 1 O-glicosilazione). La N-glicosilazione è necessaria per la secrezione e la stabilità dell EPO nel plasma. La O- glicosilazione non sembra avere influenza sull attività biologica dell EPO. EPO ricombinante prodotta in CHO e in lievito

13 Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Espressione sotto il controllo del promotore AOX1, segnale di secrezione a-factor, induzione per 40 ore, resa 50 mg/l (12-13 copie del vettore integrate nel genoma)

14 Harvested Fermentation Broth Centrifugation Produzione di eritropoietina umana in Pichia pastoris Microfiltration Ultrafiltration #1 Blue-dye Chromatography Hydroxyapatite Chromatography * Cation Exchange Chromatography #1 Ultrafiltration #2 PEGylation Cation Exchange Chromatography #2 Ultrafiltration #3 Sterile Filtration Final Product *This step was only applied at scales larger than 40 liters

15 Struttura degli anticorpi In base al tipo di catena pesante: IgG, IgE, IgD monomeriche IgA dimeriche IgM pentameriche Ponti disolfuro Glicosilazione

16 Risposta immunitaria e organizzazione genica delle IgG

17 Anticorpi monoclonali Linee cellulari stabilizzate - linfociti + cellule di mieloma HGPRT - in presenza di un agente di fusione -crescita su terreno selettivo HAT (ipoxantina, aminopterina, timina) -L aminopterina è un antibiotico che inibisce la sintesi de novo degli acidi nucleici. Ipoxantina e timina permettono di sopravvivere a cellule HGPRT +, che possono usare le vie di recupero HGPRT è un enzima della via di recupero delle purine.

18 Produzione di anticorpi nel lievito Pichia pastoris Ceppo ingegnerizzato per produrre oligosaccaridi del tipo Man 5 GlcNAc 2 Espressione sotto il controllo del promotore AOX1 Resa 1.26 g/l dopo 146 ore di coltura con biomassa circa 400 g/l peso fresco di cellule (8.6 mg/l/ora)

19 Utilizzo di anticorpi in terapia Campi di applicazione clinica Malattie cardiovascolari Malattie infiammatorie e autoimmuni Immunosoppressione Neoplasie ematologiche ed epiteliali Uso in terapia anticancro: proprietà dell antigene bersaglio Espressione stabile e omogenea nelle cellule tumorali, trascurabile in cellule sane Elevata densità di espressione Mancanza di forme circolanti Capacità di attivare i processi di morte cellulare

20 Anticorpi chimerici (80% umani): i domini costanti della molecola murina sono stati sostituiti con le loro rispettive controparti umane prendendo le sequenze geniche della catena leggera k e della catena pesante delle IgG1, le Ig più efficienti ad attivare il complemento e la citotossicità delle cellule effettrici Anticorpi umanizzati (95% umani): le CDR murine sono state inserite in anticorpi umani Murino Chimerico Umanizzato

21 Anticorpi: come uccidono le cellule tumorali Azione diretta Citotossicità complementomediata quando proteine del complemento legano la Fc dell anticorpo che si è legato alla cellula bersaglio, la cellula va incontro a lisi Citotossicità cellulare anticorpodipendente la Fc dell anticorpo legato alla cellula bersaglio è riconosciuta da suoi recettori su cellule effettrici ed avviene lisi cellulo-mediata o fagocitosi della cellula tumorale Apoptosi Agisce in questo modo Rituximab Azione indiretta Inibizione della crescita Alterazioni del ciclo cellulare La trasduzione del segnale è inibita perché l anticorpo si lega al recettore per un fattore di crescita sulla cellula tumorale in modo da bloccare il legame del ligando endogeno portando all inibizione della fosforilazione di recettori tirosin-chinasici e di eventi di segnalazione a valle della cascata regolativa. Sfruttano questi meccanismi Trastuzumab, Cetuximab e Bevacizumab

22 Rituximab Anticorpo chimerico diretto diretto contro CD20. E stato il primo anticorpo monoclonale ad avere successo nella terapia per il linfoma non-hodgkin e ad ottenere le licenza dalla FDA nel CD20 è una proteina trans-membrana con le seguenti proprietà: è espressa a livelli elevati sul 95% delle cellule B affette da linfoma, ma non su altre cellule del corpo è espressa sui linfociti B sani ma non sui loro precursori immaturi (permettendo la ricostituzione di un compartimento di cellule B dopo la terapia) e sulle plasmacellule (permettendo una produzione continua di immunoglobuline) dopo il legame con l anticorpo non va in circolo nel plasma e non viene internalizzata è essenziale per il differenziamento e la proliferazione dei linfociti B L attivazione del complemento è fondamentale nell efficacia dell anticorpo ma è molto importante anche l induzione dell apoptosi mediante influsso di calcio.

23 Trastuzumab (Herceptin) Anticorpo IgG1 umanizzato diretto contro HER2 HER2 è un proto-oncogene che codifica il recettore tirosin-chinasico del fattore di crescita epidermico umano Il recettore HER2 è una proteina transmembrana che si trova su numerosi tessuti epiteliali e che viene iper-espressa nel 20-30% dei casi di tumore al seno (>2 milioni di copie contro nelle cellule epiteliali normali). L iper-espressione di solito è dovuta ad una amplificazione del gene Trastuzumab lega con alta affinità HER2 ed induce l internalizzazione del suo recettore e quindi il blocco della trasduzione del segnale I tumori con iper-espressione di HER2 vengono identificati o mediante analisi immunoistochimica (positività a HER2-3) o con la FISH (evidenzia la presenza di amplificazione genica) È stato il primo anticorpo monoclonale contro tumori solidi ad essere approvato dalla FDA. E riconosciuto come agente singolo nella terapia di seconda linea nei tumori al seno HER2 + metastatici

24 Cetuximab Anticorpo monoclonale chimerico IgG1 diretto contro il recettore dell EGF che blocca il ciclo cellulare a livello G 0 /G 1, attraverso l espressione di p27. Induce inoltre apoptosi attraverso l espressione di fattori pro-apoptotici (Bax, caspasi 3, 8 e 9) o tramite l inattivazione di fattori anti-apoptotici (Bcl-2) e inibizione della produzione di fattori proangiogenici EGFr è una proteina transmembrana di 170 kda con un dominio intracellulare tirosin-chinasico È iper-espressa in molti tumori epiteliali Cetuximab compete con il ligando endogeno di EGFr per il legame al suo dominio extracellulare. Una volta legato, il complesso viene internalizzato ma senza l attivazione della funzione tirosin-chinasica, quindi si blocca il pathway cellulare. Inoltre, induce anche down-regulation del recettore sulla superficie cellulare. È stato approvato dalla FDA nel febbraio 2004 per il trattamento del cancro colorettale metastatico EGFr +

25 Bevacizumab È un anticorpo monoclonale umanizzato che inibisce la segnalazione angiogenica legando VEGF in modo da prevenire la sua interazione con VEGFr1 e VEGFr2. Ha ricevuto l approvazione della FDA nel 2004 come trattamento di prima linea per il cancro colorettale metastatizzato in associazione con 5-FU VEGF è un fattore di crescita proangiogenico che regola la proliferazione e la permeabilità vascolare ed è un fattore antiapoptotico per i nuovi vasi sanguigni Agisce tramite due recettori, VEGFr1 e VEFGr2, che sono espressi sull endotelio vascolare. La loro espressione in genere aumenta in risposta a ipossia, oncogeni e citochine.

26 g-carbossilazione delle proteine

27 La cascata della coagulazione del sangue

28 Disordini genetici della coagulazione: emofilia A (fattore VIII) emofilia B (fattore IX) La World Federation of Haemophilia stima che nel mondo ci siano emofiliaci. La produzione dei fattori della coagulazione necessari per questi pazienti attraverso la tecnologia del DNA ricombinante permette di superare i problemi di contaminazioni virali che rendono meno sicuri i derivati del plasma.

29 Fattore VIII Il fattore VIII è una proteina di 2332 aa che ha una struttura a domini A1-A2-B-A3-C1-C2. Il dominio B viene inizialmente rimosso e nel plasma il fattore VIII è associato al fattore di von Willebrandt (vwf), che lo stabilizza. Il dominio C2 è coinvolto nel legame a vwf e alle membrane.

30 Fattore VIII ricombinante Espresso in cellule di mammifero BHK e CHO a livelli bassi: secrezione poco efficiente. Costi molto elevati (oltre $/anno per paziente) Produzione di fattore VIII ibrido uomo/maiale (sequenze FVIII di maiale in domini A1 e A3 aumentano livelli di espressione migliorando la velocità di secrezione) in un sistema lentivirale sotto il controllo del promotore EF-1a in cellule BHK Livelli di espressione: 9 pg/cellula/giorno cioè circa 7.3 mg in 2.5 l raccolto dal giorno 3 al giorno 7 di coltura Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico su SulfoPropyl-Sepharose: 4.9 mg di fattore VIII con elevata purezza

31 Fattore VIII ricombinante

32 Espressione del Fattore IX in cellule CHO Fattore IX (415 aa) espresso in CHO a 180 mg/ml (forma attiva solo 1.5 mg/ml). I livelli di espressione aumentano se viene coespressa la furina (proteasi che rimuove un peptide segnale necessario per la g- carbossilazione). Approvato con il nome BeneFIX nel 1998.

33 Fattore VIIa ricombinante Il fattore VII è espresso in cellule BHK come proteina a singola catena. L attivazione (proteolisi R152-I153) è spontanea. Purificazione mediante cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità su anticorpo monoclonale contro il dominio Gla e altre due cromatografie a scambio ionico. Il fattore VIIa è indicato nei pazienti con emofilia A o B che hanno sviluppato anticorpi inibitori contro i fattori VIII o IX.

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