RETROVIRIDAE. G. Di Bonaventura Università di Chieti-Pescara

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1 RETROVIRIDAE G. Di Bonaventura Università di Chieti-Pescara

2 * Oncovirus endògeni * Retrovirus patogeni per l uomo famiglia Retroviridae - tassonomia Subfamiglia Gruppo Esempi Oncovirinae Tipo A Intracisternal A Particles (non-infectious) (oncògeni) Tipo B Mouse Mammary Tumor (MMTV) Tipo C Avian Sarcoma and Leukemia Murine Sarcoma and Leukemia * Human T-cell leukemia virus (HTLV I-II) Tipo D Mason Pfizer monkey (MPMV) Lentivirinae (lungo periodo di incubazione) Spumavirinae (effetto vacuolizzante) Visna, * HIV (1 2), SIV, FIV Human Foamy virus (citopatico in vitro, non patogeno per l uomo)

3 H.I.V. (Human Immunodeficiency Virus)

4 AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) 1980/81- Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi omosessuali: gay pneumonia ) e definizione clinica della sindrome Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus). Inizialmente indicato LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLV-III (perché ritenuto, erroneamente, essere correlato ai retrovirus oncogeni umani già noti HTLV-I e HTLV-II) Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di anticorpi.

5 I virus responsabili dell AIDS Ad oggi, due sono i virus noti per essere causa della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2 HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è responsabile della maggior parte dei casi di AIDS HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale, India, Caraibi, America meridionale; è di gran lunga meno virulento di HIV-1 Virus analoghi, responsabili di sindromi assai simili (immunodeficienza acquisita), sono stati dimostrati anche in varie specie animali: scimmie (SIV), felini (FIV), etc.

6 HIV: caratteri generali HIV appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae, famiglia Retroviridae I Lentivirus hanno i caratteri generali dei Retrovirus con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo replicativo e l organizzazione generale del genoma: forma: sferica (d = 100 nm) nucleocapside con simmetria elicoidale presenza di involucro esterno (peplos), derivato dalla gemmazione della membrana plasmatica genoma: RNA+, diploide (unicità tra i virus!); sistema «gag-pol-env» e presenza di geni «regolatori»

7 HIV: struttura del virione HIV. Core ed envelope evidenti; le glicoproteine di superficie appaiono come protrusioni alla superficie (da: Gallo and Montagnier, Scientific American, 259:42, 1988)

8 HIV: organizzazione del genoma «provirus» (DNA) Retrotrascrizione DNApol-RNAdip (virale) - 2 x RNA - polarità poli-a, in contatto all estremità 5 - trna («innesco» RT) LTR (Long Terminal Repeat): contiene promoter/ehnancer per trascrizione provirus oltre ai 3 geni sempre presenti ed essenziali nei Retroviridae (gag pol env) HIV presenta, in aggiunta, una serie di geni accessori e regolatori che svolgono un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus

9 HIV ciclo replicativo

10 HIV - ciclo replicativo: binding 1. ATTACCO: HIV interagisce, mediante un antirecettore (gp120, gp41) presente sul peplos, con il recettore (CD4) ed i co-recettori (CCR5, CXR4) delle cellule sensibili (linfociti T-helper, macrofagi, microglia, monociti circolanti, cellule dendritiche, etc.) TROPISMO VIRALE per cellule CD4+: In vivo In vitro stipiti con capacità di crescere in linfociti T-helper (stipiti linfotropi) (CCR5 come co-recettore) stipiti con capacità di infettare i macrofagi (stipiti macrofagotropi), durante la fase di persistenza della malattia in sede extra-linfoide e vascolare (CXCR4 come corecettore) entrambi crescono in colture primarie di linfociti da sangue periferico (dotati di CCR5 e CXCR4) La presenza di co-recettori (CCR5 o CXCR4), disponibili alla superficie delle cellule CD4+, che cooperano con CD4 alla fusione dell envelope virale con la membrana cellulare, è stata suggerita da: insensibilità di cellule murine (transfettate con CD4) all infezione azione antivirale di chemochine (RANTES, MIP-1α, MIP-1β) che, legando i rispettivi co-recettori, ne impediscono l attacco a gp120

11 HIV - ciclo replicativo: fusione, penetrazione, uncoating 2. FUSIONE e PENETRAZIONE: l interazione dei recettori cellulari con le glicoproteine virali gp120/gp41 provoca un riarraggiamento conformazionale dell envelope che ne consente la fusione con la membrana cellulare. In tal modo, il nucleocapside virale accede al citoplasma 3. UNCOATING (SCAPSIDAMENTO): il virione perde il capside liberando così nel citoplasma il suo genoma

12 Linfociti T CD4+ infettati da HIV contenuti in vacuoli citoplasmatici (da: Haseltine and Wong-Staal, Scientific American 259:53, 1988)

13 HIV ciclo replicativo 4. REPLICAZIONE Retrotrascrizione (ad opera di una trascrittasi inversa DNA-polimerasi RNA dipendente virale) dell RNA del genoma virale in DNA (provirus) 5. INTEGRAZIONE provirus circolarizza e si integra nel genoma cellulare eventi favoriti anche dalle concomitanti: replicazione della cellula infetta attivazione della cellula infetta

14 HIV ciclo replicativo REPLICAZIONE GENOMICA - SINTESI PROTEICA Trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico e dei vari mrna per la sintesi delle poliproteine strutturali virus-specifiche: LTR 5 promoter consente attacco RNA-pol cellulare migrazione verso il citoplasma di mrna di piccole dimensioni (multi-spliced) codificanti per proteine regolatorie (funzionali). In particolare: Tat aumenta la velocità di trascrizione Rev blocca il multi-splicing, consente l esportazione di RNA-genomici e mrna per proteine strutturali (capside, peplos) ed enzimatiche (proteasi) Maturazione delle proteine, mediante clivaggio ad opera di proteasi Inserimento di proteine del peplos (es. gp120, gp41) in alcuni segmenti di membrana cellulare

15 Progenie virale Acquisizione del pericapside Rna (+) genoma Assemblaggio Trascrittasi inversa Endonucleasi/ integrasi TAR Trascrizione AAAA RRE Proteine strutturali Proteasi Poliproteine SpS Traduzione Traduzione Proteine regolatrici Tat Rev

16 I geni gag, pol, env sono tradotti in poliproteine che, ad opera di proteasi, verranno semplificate nei singoli prodotti proteici. In particolare, gag e pol vengono co-tradotti in un singolo polipeptide.

17 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR gag ( group-ag ) codifica le proteine del nucleocapside o core virale, e della matrice virale: p24 che forma il capside virale p17 proteina della matrice virale (riconosce il segmento di membrana cellulare che formerà il peplos) p9/7 e p7/6, proteine RNA-binding px, X = PM proteina Esempio: p24, PM = 24-kD

18 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR pol («polymerase») codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o trascrittasi inversa e gli altri enzimi associati al virione: proteasi (p9) trascrittasi-inversa e RNA-si H (p66) integrasi (p32)

19 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR env («envelope») codifica una poliproteina di 88 kd (p88) che viene glicosilata a gp160 ad opera di una proteasi virale, gp160 viene scissa nelle due glicoproteine dell envelope: gp120 e gp41 gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame al recettore gp41 è una proteina idrofobica che: garantisce l ancoraggio di gp120 tramite legami non covalenti coinvolta nella fusione dell envelope con la membrana cellulare

20 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR Geni accessori e regolatori di HIV-1 A differenza degli altri Retrovirus HIV possiede, oltre ai geni strutturali (gag, pol, env), almeno altre sei sequenze con funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di replicazione virale.

21 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR tat (trans-activator of transcription) consiste di due distinti esoni che codificano una proteina di 14 kd La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale della trascrizione del provirus e agisce a livello nucleare: potenziando l attività di LTR 5 reclutando fattori trascrizionali inducendo cambiamenti conformazionali nella cromatina, così favorendo la trascrizione del DNA escreta, può agire sulla stessa cellula (azione autocrina) o su cellule viciniore non infette (azione paracrina) transattivando la trascrizione di numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc.

22 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR rev (regulator of expression of virion proteins) ( due esoni), codificano per p19 che favorisce il trasferimento nucleocitoplasmatico di RNA-m unspliced La proteina Rev si lega agli m-rna virali in corrispondenza della sequenza RRE (Revresponsive element) sita all interno del gene env, proteggendoli dalle operazioni di splicing Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell RNA genomico e degli m-rna per le proteine strutturali, limitando altresì, indirettamente, (attraverso il blocco della produzione di RNA-m spliced) l espressione propria e quella delle altre proteine accessorie e regolatrici

23 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR vpu (viral protein unique) presente solo in HIV-1, codifica una proteina di kd che facilita il trasporto di gp120 e gp41 verso la membrana cellulare idrolizza CD4 neosintetizzate a livello del reticolo endoplasmico non essenziale per la replicazione di HIV-1, ha un ruolo nel corretto assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati

24 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR nef (p27) (negative factor) azione simile a quella di vpu: causa downregulation di CD4. Si lega al CD4 di membrana (provocandone la endocitosi) e a quello dell apparato di Golgi conducendolo in sede lisosomiale provocandone, così, la degradazione associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture di cellule patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef defettivi

25 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR vif (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la produzione di virus extracellulare infettante, forse intervenendo nella elaborazione finale dei prodotti del gene env e nell assemblaggio del core virale Virioni defettivi in vif sono scarsamente infettanti per i linfociti o i macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si trasmettono ancora efficacemente da cellula a cellula

26 LTR gag pol vif vpr tat vpu rev env nef LTR vpr (viral protein R) codifica una proteina di 14 kd che viene associata al virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare

27 HIV ciclo replicativo 9. ASSEMBLAGGIO E DISSEMINAZIONE DEI VIRIONI Assemblaggio dei singoli virioni: 2 molecole di trna genomico si associano a proteine regolatorie/strutturali a dare il virione completo Gemmazione dei virioni neoformati che in tal modo si dotano del peplos (no lisi cellulare)

28 Variabilità genetica di HIV-1 La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di controllo (proof-reading) presenti nella duplicazione del DNA. Pertanto, gli errori (mutazioni) associati alla sua attività si traducono nella comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie) nei diversi individui infetti nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo La variabilità è particolarmente evidente a livello di alcune zone di env e nef (mutazioni non silenti ed estese) mentre altri geni (gag, pol, tat) sono molto più conservati (mutazioni silenti e puntiformi) esistenza di uno stretto rapporto struttura-funzione elusione della risposta immune mediante modificazioni non silenti delle glicoproteine di superficie (inefficacia della vaccinazione)

29 Variabilità genetica di HIV-1 Stipiti di HIV-1 classificabili in 3 gruppi: M, N, O gruppo M ( main ) comprende la maggior parte degli stipiti; si distinguono vari sottotipi (cladi): A-K (Italia, sottotipo B) gruppo O ( outlier ): stipiti infrequenti gruppo N ( non-m non-o ): struttura genomica molto diversa da M ed O Elevata velocità di replicazione ed elevato tasso mutazionale = diversità di sequenza fino al 20% di diversità in env all interno di un sottotipo La diversità di sequenza modula le frazioni immunogene del virus

30 La patogenesi dell AIDS L infezione da HIV è di natura ematogena Si trasmette attraverso: rapporto sessuale omosessuale eterosessuale contatto con sangue infetto scambio di siringhe (tossicodipendenti, operatori sanitari) trasfusione (sangue o emoderivati) contatto perinatale passaggio attraverso il canale del parto allattamento

31 La patogenesi dell AIDS All infezione primaria segue un incubazione di 3-6 settimane e, quindi, una fase acuta (sindrome simil-mononucleosica) Segue una fase asintomatica: la latenza clinica non equivale alla latenza virale Infatti, l infezione si accompagna ad una progressiva e sostenuta replicazione del virus (in particolare negli organi linfoidi) - che, per tutto il periodo asintomatico, viene contrastata e contenuta dalla risposta immune dell organismo - e ad una progressiva diminuzione dei linfociti T- CD4+ (normalmente circa 1.000/mm 3 )

32 La patogenesi dell AIDS Con la riduzione dei linfociti T-helper al di sotto di una soglia critica (in genere, < 500/mm 3 ) e con la conseguente compromissione della capacità di risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia la fase sintomatica (AIDS): iniziale stadio LAS (lymphoadenopatic syndrome) con linfoadenopatia persistente stadio ARC (AIDS-related complex): calo ponderale, diarrea, astenia con netta diminuzione dei linfociti T-helper circolanti quando linfociti T-helper < 300 mm 3 compare lo stadio di AIDS conclamato, con massiva viremia (incapacità linfonodale a contenere il virus) e comparsa di infezioni opportunistiche (batteriche, protozoarie, virali) di inusitata gravità, spesso accompagnate dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi, sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS-related dementia)

33 La patogenesi dell AIDS La progressione verso la malattia è in rapporto alla quantità di virus infettante alla capacità replicativa del virus ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high) alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti) La patogenesi dell AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta distruzione linfocitaria ad opera della infezione virale. Infatti, nonostante HIV causi la totale deplezione dei linfociti T CD4+: HIV infetta soltanto il 20-30% della popolazione linfocitaria rimpiazzo dei linfociti T ad opera di un turn-over da parte dei precursori della serie linfoide Esistenza di meccanismi alternativi (indiretti): Reclutamento di linfociti CD4+ non infetti da parte di HIV, per induzione del fenomeno apoptotico innescato dall interazione tra gp120 e CD4

34 Patogenesi multifattoriale dell AIDS Un meccanismo patogenetico alternativo è stato anche proposto per spiegare i quadri di citopenie periferiche e le lesioni del SNC Le cellule CD34+ (progenitori ematopoietici) ed i neuroni infatti non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza della abnorme produzione di citochine indotta in cellule infette (linfociti, glia, astrociti) e non (linfociti) in seguito all azione tossica di proteine virus-specifiche (gp120, Tat) Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella comparsa del sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri fattori (HHV-8?)

35 I long-term non progressors < 5% di soggetti infetti da più di anni non presenta segni di malattia o di compromissione della risposta immune e possiede un numero normale (o comunque superiore a 500/mm3) di linfociti T CD4+? -minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi) -elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici (CD8+) -iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori -produzione di fattori antivirali (?) da parte dei linfociti T CD8+ -altre cause?

36 La diagnosi di infezione da HIV L infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva Quindi Sieropositività = diagnosi di infezione "in atto (anche se clinicamente silente) Ricerca di anticorpi anti-hiv mediante saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay o ELISA): utilizzo di preparazioni antigeniche virali che consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di HIV-1 Conferma sieropositività: un risultato positivo all ELISA va sottoposto ad esame "di conferma" tramite immunoblotting, utilizzando supporti adsorbiti con diversi peptidi di HIV- 1 e gp36 di HIV-2 Tuttavia, la sierologia presenta molti limiti: fase iniziale (3-4 settimane): il cosiddetto periodo "finestra" falsa positività in neonati da madri HIV (presenza di anticorpi sierici materni) in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline

37 La diagnosi di infezione da HIV Un risultato positivo all ELISA va sottoposto ad esame "di conferma" tramite Immunoblotting, utilizzando strisce caricate con i diversi peptidi di HIV-1 e gp36 di HIV-2 L immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.

38 La diagnosi di infezione da HIV Diagnostica Virologica = ricerca del virus Isolamento del virus in colture di cellule Determinazione dell antigenemia (p24 nel sangue) Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue)

39 La diagnosi di infezione da HIV Isolamento del virus in colture di cellule è indicato anche: a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo (sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua resistenza ai farmaci antiretrovirali b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato territorio Determinazione dell antigenemia (p24 nel sangue) Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue)

40 Il follow-up virologico del paziente viral load il livello e l andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale per: a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali, b) giudicare l efficacia del regime terapeutico in atto, c) valutare l andamento dell infezione sotto il profilo prognostico

41 Per valutare il viral load : 1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR) Indica l ampiezza del reservoir di virus presente nell organismo, non sempre correlata alla intensità della replicazione virale 2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico misurata in colture di cellule in vitro 3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT- PCR o metodi analoghi) Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus

42 Il follow-up virologico del paziente Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla presenza di infezione sintomatica e/o al numero di linfociti T CD4+) è utilizzato per decidere l inizio della terapia con farmaci antiretrovirali valutare l efficacia del regime terapeutico in atto, valutare la prognosi della malattia

43 La resistenza di HIV-1 ai farmaci antiretrovirali Durante la replicazione del genoma in HIV intervengono tre polimerasi: Transcrittasi inversa virale DNA pol RNA pol 3x10-5 errori per base incorporata Durante la prima fase dell infezione, la popolazione virale sembra essere monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è disomogenea. La presenza di mutanti resistenti impedisce il controllo dell infezione

44 Vaccinazione anti-hiv: problematiche Variabilità genetica del virus Rapida replicazione, alta velocità di mutazione mutanti immune-escape Latenza e persistenza HIV-1 infetta cellule CD4 alterando l efficacia della risposta immune Dubbia capacità del sistema immune a prevenire o controllare l infezione da HIV-1