ATI NATUREX (Hammer Pharma)
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- Adriano Mele
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1 SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI NATUREX (Hammer Pharma) - NATUREX Spa Caronno Pertusella VA - DIALECTICA Srl Milano - NAXOPHARMA Srl Novate Milanese MI - BIONEUROFAR Sas Luino VA - CNR ISTITTUTO TECNOLOGIE BIOMEDICHE Roma ID07/2005 PROGETTO R&S Innovazioni terapeutiche in Neurofarmacologia. AREA MD DURATA 30 MESI QUADRO ECONOMICO PREVISIONE INIZIALE ,00 COSTO FINALE ,64 INTERVENTO FINANZIARIO EROGATO ,00 DESCRIZIONE Il settore erboristico in questi anni sta assistendo ad una profonda evoluzione sul fronte dei contenuti tecnologici. La crescente domanda di prodotti fitoterapici ha spinto le industrie farmaceutiche ad interessarsi a questa nicchia di mercato e, di conseguenza, ad esigere da una parte maggiore standardizzazione e qualità certificabili del prodotto naturale e dall altra nuovi impieghi per i prodotti naturali.
2 Le linee di ricerca seguite da questo progetto hanno riflesso queste esigenze: sono stati migliorati i processi chimico- fisici di estrazione e purificazione (standardizzazione, purificazione e stabilizzazione del prodotto), sono stati sviluppati nuovi modelli per valutare una loro applicazione in campo neuro farmacologico; l obiettivo era di espandere l uso dei prodotti naturali alla cura delle malattie neurodegenerative con particolare riferimento alla malattia di Parkinson e di altre malattie caratterizzate dall attivazione di processi neurotossici. L intenzione era quindi di elevare le capacità scientifiche e tecnologiche nel campo dei prodotti erboristici e di definire un area di eccellenza nel campo dei prodotti naturali attivi sul SNC. In questo periodo si è assistito ad un crescente interesse per le malattie neurodegenerative. Molte di esse sono in aumento a causa del prolungamento della vita media. A fronte di ciò sono presenti sul mercato solo farmaci non risolutivi che si limitano a migliorare la sintomatologia, senza intervenire sulle cause. A questi limiti della farmacopea contribuisce la carenza di modelli validi sui quali studiare i meccanismi d azione delle sostanze impiegate. Le patologie neurodegenerative comprendono numerose forme di malattie caratterizzate dalla degenerazione di aree più o meno estese del cervello. Esistono diversi tipi di malattie neurodegenerative: il morbo di Parkinson è la seconda per importanza (dopo l Alzheimer) con un trend di crescita in continuo aumento. Incidenza del morbo di Parkinson (de Lau and Breteler, Lancet Neurol 2006)
3 L interesse del progetto per le malattie neurodegenerative risiedeva in una serie di contingenze positive: - una serie di evidenze sembravano indicare che alla base della malattia di Parkinson agisse un processo infiammatorio; - in Lombardia è attivo un polo di eccellenza nel campo della neurobiologia; - Hammer Pharma (oggi Naturex) aveva in pipeline numerosi prodotti naturali noti per le loro attività anti-infiammatore o per l attività sul SNC.. Per lo studio del morbo di Parkinson i modelli disponibili erano basati sulla somministrazione di un potente neurotossico che produce negli animali da laboratorio sintomi simili al Parkinson, ma seguendo ovviamente percorsi fisiologici differenti da quelli seguiti dalla malattia di Parkinson. Con tali modelli non è ovviamente possibile individuare farmaci che agiscano sulla cascata di eventi che portano al Parkinsonismo. Per lo sviluppo di questo progetto vi era quindi bisogno della realizzazione di nuovi test più affidabili e della realizzazione di test a più ampio spettro (sulla neurotossicità e il differenziamento). Sul versante erboristico era invece necessario affrontare un salto di qualità per rendere i prodotti erboristici con standard comparabile a quelli utilizzati nel mondo farmaceutico. La ricerca ha quindi seguito lo sviluppo di tre filoni paralleli. 1. realizzare e registrare processi standardizzati di purificazione di sostanze naturali note per la loro attività sul Sistema Nervoso Centrale (SNC) o per l attività antiinfiammatoria; 2. approfondire i meccanismi d azione della malattia di Parkinson per sviluppare dei modelli in grado di riprodurre in vitro i processi patologici della malattia di Parkinson; 3. realizzare un valido sistema per condurre saggi di tossicità e la valutazione dell'attività di sostanze naturali a livello neuronale con test in vitro. In altri termini, il progetto era caratterizzato da un anima tecnologica per la realizzazione del primo filone e da un anima scientifica per la realizzazione dei filoni 2 e 3. RISULTATI DEL PROGETTO 1) Filone tecnologico Per rispondere alle particolari esigenze del progetto sono state realizzate delle nuove procedure che hanno consentito di aumentare il numero di depositi di nuovi API (Active Pharmaceutical Ingredient) di origine vegetale. Per fare questo, a partire da una serie di assunti
4 teorici, si stabiliscono dei disegni sperimentali sulla base dei quali sono effettuate prove incrociando parametri fisici (temperatura, tempo di contatto droga/solvente ecc.) e chimici (qualità del solvente e gradazione). Una volta identificate le giuste condizioni si fissano le specifiche estrattive e si procede con le prove in impianto pilota fino ad ottenere le condizioni ottimali di lavorazione. L analisi di un fitocomplesso risulta il più delle volte complicata. Questo non è mai un prodotto pulito e quindi l identificazione e caratterizzazione del marker può risultare complessa. L aspetto importante consiste nella validazione del metodo analitico scelto. Questa comporta l iniziale messa a punto del metodo e la successiva dimostrazione dell affidabilità del metodo stesso. Solo dopo le verifiche analitiche, si possono redigere i capitolati e i report di convalida necessari alla successiva brevettazione. Tutte queste attività devono essere condotte sia sulla droga di partenza, sia sull estratto. La scelta delle molecole è stata effettuata considerando i criteri concordati con la componente scientifica del progetto: - la struttura chimica dei composti con le possibilità di svolgere determinati funzione (ad es. chelante, antiossidante, etc.); - le possibilità che tale struttura abbia azione su uno dei meccanismi molecolari identificati come target innovativi dai partecipanti al progetto; - le probabilità di poter apportare modificazioni chimiche che migliorino le caratteristiche di drugability dei composti (ad es. stabilità, solubilità, permeabilità nel SNC, etc.) questa parte è stata comunque considerata nell ipotesi che si verificassero risultati positivi dai test biologici; - i costi previsti di ottenimento del materiale primo; - le potenziali condizioni morbose che potrebbero beneficiare dal composto (target diseases). 2) Sviluppo di un modello biologico del morbo di Parkinson Il morbo di Parkinson (PD) è caratterizzato da disfunzioni motorie invalidanti quali tremore, rigidità muscolare, difficoltà nei movimenti volontari e instabilità posturale. La sua principale caratteristica neuropatologica è la perdita di neuroni dopaminergici (che utilizzano dopamina come neuro trasmettitore) e contenenti neuromelanina. La presenza di neuromelanina (freccia) induce l attivazione della microglia (rossa) la quale fagocita e degrada la neuromelanina, durante questo processo la microglia danneggia i neuroni adiacenti (doppia freccia)
5 Questi neuroni sono ubicati in un area del cervello che, dal colore della melanina, prende il nome di Sostanza Nera. In quest area del cervello sono particolarmente abbondanti anche le cellule della microglia. Queste si comportano, nel Sistema Nervoso Centrale, in modo simile a quanto fanno i globuli bianchi nel sangue: fagocitano cellule e sostanze estranee o cellule morenti in modo di proteggere e mantenere pulito il nostro organismo. Così la microglia oltre a proteggere il sistema nervoso dalle infezioni lo ripulisce dai neuroni morenti in modo da evitare l accumularsi di residui necrotici all interno del sistema nervoso. L attivazione della microglia nel morbo di Parkinson era ritenuta quindi una conseguenza della presenza di neuroni morenti. In altri termini, la microgliosi (cioè la fagocitosi di neuroni operata dalla microglia) nella sostanza nera era ritenuta un effetto secondario derivante dalla presenza di neuroni dopaminergici morenti. Con questo lavoro abbiamo dimostrato invece che è la morte dei neuroni dopaminergici che libera nell ambiente circostante la neuromelanina che questi contenevano e che le cellule della microglia vengono attivate dalla neuromelanina libera. La microglia, nel tentativo di rimuovere la neuromelanina dall ambiente, attacca e distrugge altri neuroni dopaminergici (contenenti neuromelanina) che, a loro volta, liberano altra neuromelanina che agisce come sostanza attivante in un escalation infiammatoria nella quale è stimolata anche la produzione di fattori proinfiammatori, superossidi, ossido d azoto e perossido d idrogeno. Queste sostanze danneggiano i neuroni e l azione della microglia porta alla progressiva degenerazione della Sostanza Nera del cervello ed al conseguente conclamarsi ed aggravarsi del morbo di Parkinson. I risultati ottenuti forniscono una prova convincente del fatto come la neuromelanina extraneuronale sia in grado di attivare la microglia, che può, a sua volta, aggravare la degenerazione delle cellule dopaminergiche. La microglia e la neuromelanina non sono quindi fattori secondari, ma sono i protagonisti nella cascata di eventi del morbo di Parkinson. Questo risultato ha implicazioni di vasta portata, sia per la comprensione della patogenesi, sia per lo sviluppo di nuove terapie. Per la scoperta di un nuovo farmaco è fondamentale infatti poter utilizzare un modello che riproduca il più fedelmente possibile l evoluzione della malattia che si vuole studiare, Una sostanza candidata a diventare un futuro farmaco dovrà infatti essere capace di contrastare i meccanismi evolutivi della malattia. Nel caso del morbo di Parkinson esistevano alcuni modelli (ottenuti principalmente con sostanze neuro tossiche) capaci di riprodurre le
6 condizioni della malattia ma non la sua progressione patologica naturale. Il modello di attivazione della microglia con neuromelanina in coltura riproduce invece fedelmente la condizione neuro infiammatoria presente nel morbo di Parkinson e costituisce pertanto un valido e semplice sistema per la valutazione di proprietà anti neuro-infiammatorie di farmaci e principi attivi. Questo importante risultato sull insorgenza e l evoluzione del morbo di Parkinson ha consentito di ottenere una serie di risultati applicativi particolarmente interessanti: attraverso la realizzazione di co-colture di microglia-neuroni ed alla successiva aggiunta di neuro melanina, è stato possibile realizzare un test in vitro che riproduce il morbo di Parkinson nella sua evoluzione patologica; iniettando neuromelanina nella sostanza nera di ratto è possibile realizzare un test in vivo capace di riprodurre i meccanismi fisiopatologici che portano all insorgenza del morbo di Parkinson. ragionando sul meccanismo infiammatorio alla base della neuro degenerazione Parkinsoniana e su altri dati disponibili in letteratura è stato possibile ampliare il ventaglio dei composti attivi da indagare comprendendo le sostanze antinfiammatorie di origine vegetale per la terapia del morbo di Parkinson; 3) Sviluppo di saggi biologici di neurotossicità Nel corso del progetto sono stati realizzati e caratterizzati un sistema cellulare per derivare da cellule staminali murine, in maniera riproducibile, cellule differenziate con caratteristiche neuronali. Da questo processo sono derivati: I) saggio di tossicità in cellule neurali staminali murine; II) III) saggio reporter DiaNRSEluc8; saggio reporter DiaNrf2. Blastocyst Fetal brain Adult Brain (SVZ) NS cells saggio di tossicità in cellule neurali staminali murine.
7 Per lo sviluppo e l'ottimizzazione di saggi cellulari che possano poi essere usati per testare sostanze estratte da piante, è stato realizzato e caratterizzato un sistema che utilizzato per condurre saggi di tossicità sui composti di interesse. La vitalità cellulare è stata monitorata mediante un saggio High Content, che utilizza una maschera in grado di discriminare tra cellule vive e cellule morte presenti nel pozzetto, oppure tramite saggio omogeneo, andando a valutare i livelli di ATP evidenziati allo spettrofotometro. Questi saggi si sono dimostrati riproducibili sia in condizioni di proliferazione sia di differenziamento. Tra i composti testati, si sono valutati anche gli estratti forniti da Naturex Spa di Echinacea purpurea, St John's Wort e Valeriana. I risultati hanno confermato le indicazioni ad oggi disponibili circa la tossicità osservata in vitro per gli estratti da queste piante. Tuttavia resta da esplorare la possibilità di utilizzare alcune componenti degli estratti che potrebbero, una volta separati e purificati, fornire interessanti risultati Saggio reporter DiaNRSELuc8 Una seconda attività ha riguardato i meccanismi molecolari alla base della Corea di Huntington (HD). Questa rara malattia neurodegenerativa fornisce infatti un modello interessante sui meccanismi di neurotossici e neuroprotettivi. Il danno neurologico sotteso a questa malattia è costituito dalla degenerazione dei neuroni striatali dei gangli della base. Il difetto genico responsabile della malattia consiste in una mutazione all'interno di un gene che svolgere una funzione neuroprotettiva, denominata huntingtina. Nella malattia, l'huntingtina mutata svolge una funzione tossica. La mutazione determina inoltre la perdita della funzione neuroprotettiva della proteina. Questi due meccanismi provocano la progressiva degenerazione delle cellule striatali deputate al controllo dei movimenti involontari e, quindi, la comparsa della sintomatologia coreica. In condizioni fisiologiche la funzione dell'huntingtina è quella di stimolare la produzione di una neurotrofina, il BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), che favorisce la sopravvivenza dei neuroni del sistema nervoso centrale aumentando la trascrizione del gene denominato RE1/NRSE. I composti in grado di diminuire l'attività silenziatrice della sequenza RE1/NRSE potranno rivelarsi di interesse non solo per la Corea di Huntington e le patologie sopra citate, ma anche in altre patologie neurodegenerativa. Sviluppo del saggio primario Una porzione di genoma contenente la sequenza RE1/NRSE è stata state ingegnerizzate insieme ad un vettore Luciferasi in cellule di derivazione neurale. Queste cellule sono state esposte ai composti di interesse ed è stata valutata l'attività luciferasica. Un incremento di attività luciferasica riflette un'inibizione dell'attività silenziatrice RE1/NRSE. Tale saggio è stato utilizzato per testare i tre estratti da Echinacea purpurea, St John's Wort e Valeriana forniti da Naturex Spa. Non sono state osservate attività specifiche degli estratti testati. Tuttavia anche in questo caso resta da esplorare la possibilità di utilizzare alcune componenti degli estratti che potrebbero, una volta isolati e purificati, fornire interessanti ed inaspettati risultati.
8 Saggio reporter DiaNrf2 Valutando in maniera specifica gli obiettivi del progetto Innovazioni Terapeutiche in Neurofarmacologia, l'attenzione posta su molecole di origine naturale, ha consentito di sviluppare un saggio reporter per l'identificazione di composti dotati di attività antiossidante: degli enzimi responsabili della detossificazione finale di un composto esogeno o di un metabolita. Obiettivo del progetto è stato quello di ottenere un sistema reporter in grado di identificare composti di interesse per ottenere e/o potenziare l attivazione della risposta al danno ossidativo che sembra avere un ruolo centrale nella patogenesi dell invecchiamento e di diverse malattie degenerative. IMPATTO attraverso la tecnica delle co-colture neuroni-glia e stato ottenuto il primo test in vitro in grado di riprodurre il processo infiammatorio che genera il morbo di Parkinson; è stato ottenuto un test in vivo che genera la comparsa del morbo di Parkinson (risultato inizialmente non previsto dal progetto); Sono stati ottenuti tre test di neuro tossicologia di cui: a. saggio di tossicità in cellule neurali staminali murine; b. saggio reporter DiaNRSEluc8; c. saggio reporter DiaNrf2. Sono stati depositati al Ministero della Sanità: cinque dossier per la protezione della proprietà intellettuale relativa ad altrettanti prodotti; un dossier (ippocastano) è in corso di deposito; sono state individuate, le schede necessarie alla preparazione dei dossier di 6 Active Pharmaceutical Ingredient di origine vegetale - entro la fine del 2009 i dossier relativi saranno tutti depositati al Ministero della Sanità; altre 8 schede sono in preparazione per il deposito dei dossier entro la fine del 2010.
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