Modulo 13 La glicolisi

Transcript

1 1 Modulo 13 La glicolisi

2 La glicolisi: via metabolica centrale del catabolismo del glucosio } Via metabolica antica avviene interamente nel citoplasma delle cellule. } Converte il glucosio in piruvato, producendo ATP e NADH. Il piruvato prodotto dalla glicolisi può avere diversi destini. } Funzione: fornire energia e precursori per le biosintesi. } Il processo è anaerobico. Può rappresentare la parte iniziale di un processo ossidativo successivo. } Consiste di 10 reazioni sequenziali, suddivise in: } Fase preparatoria: il glucosio è convertito in due molecole di trioso-p (fase di investimento - 2ATP) } Fase di recupero energetico: vengono prodotte 2 molecole di piruvato + 4 ATP 2

3 Conversione del glucosio a Fruttosio-6-P 1) La esochinasi conversione il glucosio a a glucosio-6- fosfato (Il fegato contiene anche una esochinasi diversa chiamata glucochinasi). Glucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP La reazione richiede Mg 2+ che si coordina con i due carichi del gruppo P terminale dell ATP. Il Glucosio-6P non può più essere trasportato fuori dalla cellula. H 4 H 6CH 2 H 5 H H H 3 2 H H Glucosio glucose 6 2 CH 2 P 3 ATP ADP 5 H H H H 1 4 H H 1 H Mg 2+ H Hexokinase Esochinasi 3 2 H H H Glucosio-6-fosfato glucose-6-phosphate ΔG = -16,7 kj mol -1 2) Isomerizzazione del G-6-P a F-6-P Converte un aldoso in chetoso. 6 2 CH 2 P 3 5 H H H 4 H H 1 H H 3 2 H H 6 2 CH 2 P 3 1CH 2 H 5 H H 2 H 4 3 H H H Phosphoglucose Fosfoglucosio isomerasi Isomerase glucose-6-phosphate Glucosio-6-fosfato fructose-6-phosphate fruttosio-6-fosfato ΔG = -1,7 kj mol -1 3

4 Fosforilazione del F-6-P a fruttosio-1,6-bp 6 2 CH 2 P 3 5 H H Phosphofructokinase Fosfofruttochinasi 1CH 2 H 6 2 CH 2 P 3 ATP ADP 2 5 H H 1 2 CH 2 P 3 2 ΔG = -14,2 kj mol-1 H 4 3 H H H fruttosio-6-fosfato fructose-6-phosphate Mg 2+ H 4 3 H H H fructose-1,6-bisphosphate fruttosio-1,6-bisfosfato 3. Fosfofruttochinasi 1 (PFK-1): fruttosio-6-p + ATP fruttosio-1,6-bisfosfato + ADP La fosfofruttochinasi è un enzima allosterico (tetramero di 340 kda), sottoposto a regolazione che condiziona tutto il flusso della via metabolica. 4

5 Scissione del fruttosio-1,6-bp in gliceraldeide 3P 4. Aldolasi (fruttosio-1,6-bisfosfato aldolasi) fruttosio-1,6-bisfosfato diidrossiacetone-p + gliceraldeide-3-p 5 1 C H 2 P C H 3 C H H 4 C H H C H 5 6 C H 2 P 2-3 fruttosio-1,6- bisfosfato C H 3 2 P C 1 C H 2 H Diidrossiacetone -3-fosfato 5. Trioso fosfato isomerasi (TPI) Diidrossiacetone-3-P 4. Aldolasi + H 1 C H 2 C H C H 2 P gliceraldeide-3- fosfato gliceraldeide-3-p La rimozione della gliceraldeide-3-p spinge la conversione del diidrossiacetone-3-p verso l isomero aldeidico, La reazione è una scissione aldolica, facilmente reversibile in una condensazione aldolica (reazione inversa). ΔG = 23,8 kj mol-1 C H 3 2 P C 1 C H 2 H Diidrossiacetone -3-fosfato H H 1 C C 2 H C H 2 P gliceraldeide-3- fosfato ΔG = 7,5 kj mol-1

6 ssidazione della gliceraldeide-3-p a acido 1,3 bisfosfoglicerico 6. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH): unica tappa ossidativa della glicolisi, in cui NAD + è ridotto a NADH + (+H +) H 2 + H + P 3 1 C NAD + NADH 1 C + P H C H i H C H CH 2 P 3 3CH 2 P 3 Glyceraldehyde-3-phosphate 6. G3PDH Dehydrogenase glyceraldehyde- gliceraldeide-3-3-phosphate fosfato 1,3-bisphospho- glycerate bisfosfoglicerato ΔG = 6,5 kj mol-1 gliceraldeide-3-p + NAD + + P i 1,3-bisfosfoglicerato + NADH + H + La reazione esoergonica dell ossidazione di una aldeide ad acido carbossilico viene conservata e porta alla formazione di gruppo acilfosfato (anidride mista) con un elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico. L acil fosfato ha una energia libera di idrolisi elevata ΔG = -49,3 kj /mol. 6

7 La reazione catalizzata dalla gliceraldeide-3p deidrogenasi (GADPH) La reazione potrebbe essere considerata come la somma di due reazioni consecutive non accoppiate : i) l ossidazione dell aldeide ad acido carbossilico, mediata da NAD+, ii) unione dell ortofosfato all acido carbossilico per dare acil-fosfato. Caso ipotetico Caso effettivo H 1 C + H C H 2 3 C H 2 P gliceraldeide-3-p NAD + + H 2-1 C H C H + P 2 i 2-3 C H 2 P 3 3-fosfoglicerato ossidazione - 1 C H 2 C H + NADH + H C H 2 P 3 3-fosfoglicerato P In realtà l ossidazione non avviene in modo diretto: le due reazioni sono accoppiate attraverso un intermedio tioestere: ha una energia libera più elevata dell acido carbossilico libero 1 C H C H 2 3 C H 2 P 3 2-1,3-bisfosfoglicerato 7

8 Meccanismo catalitico della GAPDH Struttura della GAPDH : il sito attivo include una His ed una Cys adiacenti ad una molecola di NAD + 8 L energia rilasciata dall ossidazione del carbonio viene conservata in elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico.

9 Trasferimento del gruppo P all ADP ed isomerizzazione del 3-fosfoglicerato 7. fosfoglicerato chinasi: 1,3-bisfosfoglicerato + ADP Il potenziale di trasferimento del 1,3 bisfosfoglicerato è superiore a quello dell ATP. Esempio di fosforilazione a livello di substrato. 3-fosfoglicerato + ATP Phosphoglycerate Kinase ADP ATP 1C C 1 H C H H C H Mg CH 2 P 3 3CH 2 P 3 P 3 2 1,3-bisphospho- 1,3-bisfosfoglicerato glycerate 3-phosphoglycerate 3-fosfoglicerato ΔG = -18,5 kj mol-1 8. fosfoglicerato mutasi: 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato Reazione di riordinamento molecolare. Il fosfato viene spostato dall ossidrile sul C3 all ossidrile in C2. Phosphoglycerate Mutase H C 1 C 2 H 2 3CH 2 P 3 Mg 2+ C 1 H C 2 3CH 2 H P phosphoglycerate 3-fosfoglicerato 2-phosphoglycerate 2-fosfoglicerato 9

10 Formazione del fosfoenolpiruvato e trasferimento del gruppo fosforico all ADP 9. Enolasi: 2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato + H 2 La deidratazione introduce un doppio legame (enolo). Il fosfoenolpiruvato (PEP), un enol-p, ha un ΔG di idrolisi del gruppo P > di quello dell ATP. Perché: il P mantiene la molecola nella sua forma enolica instabile. 10. Piruvato chinasi: fosfoenolpiruvato + ADP 10 piruvato + ATP La rimozione del P i dal PEP da parte dell ADP dà origine ad un enolo instabile che spontaneamente si converte nella forma chetonica, cioè nel piruvato. - 1 C 2 - H 2 C P 3 H 3 C H 2 2-fosfoglicerato - Enolasi - 1 C 2-2 C P 3 3 C H 2 fosfoenolpiruvato C A D P A T P 1 1 C 2-2 C P 3 C H 2 K +, Mg 2+ 3 C H 2 3 C H 2 + H 2 ΔG = + 7,5 kj mol-1 Piruvato chinasi 1 C C 2 3 C H 3 fosfoenolpiruvato enolpiruvato piruvato - - ΔG = -31,4 kj mol -1

11 Bilancio della glicolisi In totale durante le dieci tappe, il bilancio per quanto riguarda i legami fosforici è stato: 2 ATP spesi 4 ATP prodotti (2 da ogni trioso formato dal glucosio) Produzione netta 2 legami ~P di ATP per molecola di glucosio Il bilancio complessivo della glicolisi è: 1 glucosio + 2 NAD ADP + 2 Pi à 2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H 2 0 Se la glicolisi si fermasse a questo punto non potrebbe procedere a lungo: il bilancio redox è venuto meno (deplezione di NAD+). 11

12 12 Utilizzo metabolico di altri monosaccaridi/disaccaridi

13 I possibili destini metabolici del piruvato glucosio Glicolisi Fermentazioni Etanolo Lieviti, altri microrganismi ssidazione Completa piruvato respirazione Microrganismi lattici Muscoli in anaerobiosi lattato Il destino del piruvato dipende dalle condizioni fisiologiche, dai tessuti e gli organismi in cui viene prodotto. 13

14 Il lattato è l accettore terminale degli elettroni nella fermentazione lattica Il piruvato è convertito a lattato, in questo modo viene rigenerato NAD + necessario per la continuazione della glicolisi C C - Lattico deidrogenasi N A D H + H + N A D + C H C - H ΔG = -25,1 kj mol-1 C H 3 Piruvato C H 3 Lattato In esercizio il muscolo scheletrico lavora anaerobicamente quando la disponibilità di ossigeno diventa insufficiente ed il metabolismo aerobico non può fornire l energia richiesta. La glicolisi è, in condizioni anaerobie, la maggior fonte di ATP glucosio + 2 ADP + 2 Pi à 2 lattato + 2 ATP + 2H 2 14

15 La fermentazione alcolica Diversi organismi anaerobi (lieviti) trasformano il piruvato ad etanolo, secreto come prodotto di scarto. L alcol deidrogenasi rigenera il NAD +, necessario per continuare la glicolisi. C C C H Piruvato decarbossilasi - 3 C 2 H C C H 3 Alcol deidrogenasi N A D H + H + N A D + Piruvato Acetaldeide Etanolo H H C C H 3 H glucosio + 2 ADP + 2 Pi + 2H + à 2 etanolo + 2C 2 + 2H 2 +2ATP 15

16 La regolazione della glicolisi Sono tre enzimi regolatori il cui controllo determina il flusso metabolico (la velocità di reazione) lungo la via glicolitica. Essi catalizzano reazioni virtualmente irreversibili, cioè reazioni che sono lontane dall equilibrio (ΔG <<=0) I. la fosfofruttochinasi: principale punto di controllo, inibito da ATP II. la esochinasi, inibita allostericamente dal suo prodotto il glucosio-6- fosfato. III. piruvato chinasi: enzima allosterico inibito da ATP (elevata energia), alanina (elevato livello precursori), attivato invece dal F-1,6-BP Il controllo avviene a due livelli: Controllo locale: dipendenza delle reazioni catalizzate da enzimi da parte delle concentrazioni di substrati ed intermedi presenti nella cellula. Controllo globale: controllo esercitato da ormoni, che agiscono a distanza tramite secondi messaggeri e regolano le vie metaboliche a beneficio dell intero organismo. 16

17 La fosfofruttochinasi è modulata allostericamente Fosfofruttochinasi: il principale punto di controllo della glicolisi nei mammiferi e determina il flusso lungo questa via. È il rapporto ATP/ADP a svolgere un ruolo primario. L enzima (omotetramero) viene inibito allostericamente dall ATP, mentre AMP ed ADP ne antagonizzano l effetto. La glicolisi è inibita quando la carica energetica è elevata. L ATP si lega ad un sito regolatorio promuovendo un cambiamento conformazionale l inibizione dell enzima (curva spostata a destra). 17

18 18 Schema di controllo della glicolisi nei muscoli

19 Variazioni di energia libera delle reazioni della glicolisi (calcolate da stime di concentrazioni di substrati) ENZIMA ESCHINASI FSFGLUCISMERASI FSFFRUTTCHINASI ALDLASI TRIS FSFAT ISMERASI GLICERALDEIDE-3P DEIDRGENASI FSFGLICERAT CHINASI FSFGLICERAT MUTASI ENLASI PIRUVAT CHINASI ΔG (kjmol -1 )

20 La gluconeogenesi non è l inverso della glicolisi: produzione di glucosio da fonti non glucidiche 20

21 La gluconeogenesi non è l inverso della glicolisi Gluconeogenesi: sintesi del glucosio da precursori non glucidici (lattato, amminoacidi, glicerolo) convertiti in piruvato o in intermedi che entrano nella via successivamente. rgani interessati: fegato in primis, poi rene ed intestino per rifornire altri organi (cervello). Funzione: mantenere alti i livelli di glucosio durante il digiuno. La gluconeogenesi non è l inverso della glicolisi: tre reazioni scavalcano le reazioni virtualmente irreversibili della glicolisi: 1. La conversione del piruvato in PEP (piruvato carbossilasi + PEP carbossichinasi) 2. La defosforilazione del F 1,6 BP (fruttosio 1,6 bifosfatasi 1 ) 3. La defosforilazione del G6P (glucosio 6 fosfatasi) Complessivamente è un processo dispendioso: 2 Piruvato + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 6 H 2 Glucosio + 4 ADP + 2 GDP + 6 P i + 2 NAD + 21

22 Gluconeogenesi conversione del piruvato in PEP 1. Piruvato carbossilasi enzima (mitocondriale) che utilizza la biotina come donatore di C 2 per convertire il piruvato in ossalacetato (A) 2. PEP carbossichinasi, enzima che decarbossila l A per formare PEP. Il donatore di P è il GTP Piruvato + ATP + GTP + HC 3 - PEP + ADP + GDP + P i + C 2 ΔG = 0,9 kj /mol Le decarbossilazioni spesso favoriscono reazioni altrimenti endoergoniche. La carbossilazione/decarbossilazione è un sistema di attivazione del piruvato. 22

23 23 Glicolisi e gluconeogenesi sono regolate reciprocamente Glicolisi: ΔG complessivo per produrre piruvato da glucosio: ΔG = -84 kj mol -1 Gluconeogenesi: ΔG per produrre glucosio da piruvato ΔG = -38 kj mol -1 Glicolisi e gluconeogenesi sono fortemente esoergoniche, non c e nessun impedimento di ordine termodinamico a che entrambe possano svolgersi allo stesso tempo: devono essere regolate reciprocamente. Principali punti di controllo: conversione del F 6-P a F 1,6-P e del PEP a piruvato Se carica energetica è bassa ATP : glicolisi J gluconeogenesi L Se carica energetica è alta ATP : glicolisi L gluconeogenesi J Se precursori abbondanti: citrato, alanina glicolisi L gluconeogenesi J Presenza di F-2,6-BP glicolisi J gluconeogenesi L

24 La regolazione epatica della glicolisi e gluconeogenesi Il fegato ha funzioni aggiuntive ed uniche: 1) mantiene costanti i livelli ematici di glucosio sintetizzando glucosio, degradando glicogeno, e rilasciando glucosio. 2) Utilizza glucosio per produrre NADPH (potere riducente ). I meccanismi di regolazione della glicolisi sono più complessi nel fegato. Attività della PFK-1 Attività della FBPasi-1 Il più importante regolatore della glicolisi nel fegato: fruttosio 2,6 bisfosfato (F-2,6-BP). Quando il glucosio è abbondante viene prodotto F-2,6-BP, attivatore allosterico della PFK (stimolazione anterograda). 24

25 Controllo della sintesi e degradazione del 2,6- bisfosfato Nel fegato il principale regolatore delle glicolisi e della gluconeogenesi è il Fruttosio 2,6 bisfosfato prodotto da un enzima bifunzionale: PFK2. La sua regolazione è controllata da ormoni. Glucagone: segnala al fegato di produrre e rilasciare glucosio stimolando l attività della FBPasi-2 per fosforilazione e quindi della gluconeogenesi (rifornimento di glucosio). L insulina attiva una fosfoproteina fosfatasi che inibisce la FBPasi2 e attiva la PFK2 PFK2 = fosfofruttochinasi 2 FBPasi2 = fruttosio bisfosfatasi 2 Insulina e glucagone controllano in maniera opposta l enzima bifunzionale PFK-2/ FBPasi-2 che produce o degrada il fruttosio 2,6 bisfosfato. 25

26 Regolazione di Glicolisi e Gluconeogenesi REGLAZINE GENICA

27 Il metabolismo del glicogeno: la degradazione La demolizione del glicogeno nel muscolo scheletrico e nel fegato è catalizzata dalla glicogeno fosforilasi che catalizza una reazione di fosforolisi Il glucosio G-1P rilasciato è poi convertito in intermedio della glicolisi G-6P Glucosio 1-P Glucosio 6-P (glicolisi) (fosfoglucomutasi) 27

28 L azione dell enzima deramificante rende il glicogeno una catena lineare Enzima deramificante: ligo α(1 6) α(1 4)glucantransferasi 28

29 La glicogeno fosforilasi è regolata sia allostericamente che ormonalmente Nel fegato il glucagone attiva la glicogeno fosforilasi per effetto di una fosforilazione AMPc/PKA dipendente della fosforilasi b chinasi (vedi regolaz enzimatica) Nel muscolo scheletrico l adrenalina ha un effetto simile mentre Ca2+ e AMP sono attivatori allosterici. Con elevati livelli di G in sangue: nel fegato: glucochinasi (esochinasi IV) con K M di 50 volte quella della esochinasi, non inibito dal glucosio 6 P. Ruolo nella sintesi del glicogeno. 29

30 L ossidazione del glucosio attraverso la via del pentosio fosfato Glucosio-6-P: precursore di composti necessari alla cellula: via del pentosio fosfato (o del fosfogluconato). Presente in tutte le cellule, nel citoplasma. Funzioni: 1) Via ossidativa per produrre NAPDH (donatore di e- nelle biosintesi riduttive). 2) Via per produrre ribosio 5- fosfato (per sintesi di nucleotidi e quindi, DNA, RNA; NADH, FADH2 e coenzima A. La via è versatile: il flusso può essere modificato per far prevalere uno dei due obiettivi. Attivo soprattutto nel tessuto adiposo e nella ghiandola mammaria e negli eritrociti 30

31 Ciclo dei Pentoso Fosfati Avviene nel citoplasma Glucosio-6P DH NADPH Acidi grassi liberi 6- fosfoglucono lattone Fase ossidativa 6 fosfogluconato lattonasi 6- fosfoglucono lattone

32 Fase ossidativa 6-fosfo gluconato DH

33 Le reazioni ossidative della via del pentosio fosfato Due fasi : 1) Fase ossidativa: produce pentosio P e NADPH con 4 reazioni (2 deidrogenasi e due isomerasi). 2) Fase NN ossidativa: ricicla i pentosi fosfato in glucosio-6 P, oppure gli utilizza per sintetizzare nucleotidi. Bilancio della fase ossidativa: Glucosio-6-P + 2 NADP+ + H20 D-ribosio-5- P + 2 NADPH + 2H+ 33

34 Fase NN ossidativa: ricicla i pentosi fosfato in glucosio -6 P Reazioni (reversibili) che convertono i pentosi (C5) in esosi (C6) e consentono alla via metabolica di proseguire. Da 6 pentosi si producono 5 molecole di G6-P 34

35 Vie che richiedono NADPH Sintesi Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo Biosintesi di neurotrasmettitori Biosintesi di nucleotidi Detossificazione Riduzione del glutatione ossidato Citocromo P540 monoossigenasi

36

37 distretto substrato enzima prodotto ptialina amilosio bocca amilopectina (solo a1-4 interni no maltosio glicogeno a1-6, a1-4 terminale maltotriosio destrine a-limite stomaco inattivazione da HCl pancreas fegato duodeno digiuno intestino tenue amilosio amilopectina glicogeno Lattosio Saccarosio Destrine a-limite maltooligosaccaridi a-amilasi stessi legami della ptialina ma più potente lattasi saccarasi a-destrinasi a1-6 Glucoamilasi a1-4 terminali amilosio maltosio maltotriosio destrine a-limite galattosio+ glucosio fruttosio+ glucosio glucosio glucosio 37