Progetto Tesi di Master Dr. Zamir KADIJA

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1 Progetto Tesi di Master Dr. Zamir KADIJA Profilo mutazionale di oncogeni candidati nel carcinoma broncogeno non-a-piccole cellule condotto su campioni ottenuti mediante biopsia endobronchiale ed agoaspirato transtoracico. Validazione di un approccio diagnostico molecolare d impiego routinario.

2 Provoca il cancro: teorie nel corso della storia Teoria umorale: Ippocrate riteneva che il corpo ha 4 umori (fluidi corporei) sangue, flegma, bile gialle e bile nera. Un eccesso di bile nera in varie parti del corpo si pensava desse il cancro. Teoria trasmessa fino al medioevo. Teoria linfatica: nel XVII secolo Stahl e Hofman ipotizzano l origine del cancro da una fermentazione e degenerazione linfatica in varie densità. Teoria del Blastema: nel 1838 Johannes Muller, patologo tedesco, dimostra che il cancro è costituita da cellule e non da linfa. Ma lui credeva che le cellule tumorali non derivassero dalle cellule normali ma dalla presenza elementi germinali, blastema, sparsi nei tessuti normali. Il suo allievo Rudolph Virchow ( ) dimostra invece che tutte le cellule, comprese quelle tumorali, derivano da altre cellule. Teoria dell irritazione: Virchow propone l irritazione cronica come causa del tumore, ma lui erroneamente crede che la malattia si diffondesse come un liquido. Un chirurgo tedesco, Karl Thiersch, dimostra che i tumori metastatizzano attraverso la diffusione di cellule maligne.

3 Il processo di oncogenesi Processo costituito da stadi successivi caratterizzati dalla progressiva acquisizione, da parte della cellula neoplastica, di mutazioni attivanti a livello dei geni oncogeni e inattivanti a livello dei geni oncosoppressori. Cancer is, in essence, a genetic disease B.Vogelstein Nature 2004

4 PROTO-ONCOGENI GENI ONCOSOPPRESSORI GENI CONTROLLORI della STABILITA ( caretakers) VIA I geni critici del cancro FUNZIONE Promuovono la crescita e la proliferazione cellulare Proto-oncogeni Codificano per proteine che inibiscono la crescita e la proliferazione cellulare Regolano i processi di : mismatch repair, nucleotide-excision repair, base-excision repair; controllano processi responsabili della ricombinazione meiotica e della segregazione cromosomica ALTERAZIONE Mutazioni attivanti o che diventano attivanti in date condizioni non presenti nel wt ONCOGENI Mutazioni che riducono l attività del prodotto genico Se inattivati, mutazioni in oncogeni e geni oncosoppressori avvengo con maggiore frequenza Crescita cellulare controllata MOLECOLARE Geni onco-soppressori Alberts B Molec Biol Cell 2002 STATO ALLELICO Sufficiente alterazione su un allele (ETEROZIGOSI) Necessaria alterazione su entrambi gli alleli (OMOZIGOSI) Generalmente necessaria alterazione su entrambi gli alleli STOP

5 Neoplastic Cell : the cell that has clonally expanded as a result of somatic mutations B.Vogelstein Nature, 2004 Mutazione genica: variazione nella sequenza del DNA presente in meno dello 0,1% della popolazione Alterazioni di origine somatica : acquisite nel corso dello sviluppo e presenti solo nelle cellule in espansione clonale Alterazioni ereditarie: presenti nella linea germinale (germline) e dimostrabili sia nelle cellule sane che cancerose. Tumore Tessuto normale (wt) Mutazione somatica P. A. Futreal et al. Nature Rev Cancer,2004

6 Carcinoma broncogeno non-a-piccole cellule Istotipo Adenocarcinoma - BAC Prevalenza (%) Localizzazione prevalente Metodica dignostica Associazione con Fumo di sigaretta Periferica FNAC NO Epidermoidale 25 Centrale EBB SI Ca grandi cellule Periferica FNAC SI Anaplastico 5-10 Centrale EBB SI

7 Lesioni genetiche nel carcinoma broncogeno Herbst RS et al, NEJM, 2008

8 Trasduzione del segnale cellulare mediata da EGFR Rasul KI & Kerr DJ Nat. Rev. Clin. Oncol 2009

9 Mutazioni somatiche di EGFR nel NSCLC Sharma et al. Nature Reviews Cancer % Estremo Oriente vs % Paesi Occidentali 50% adenocarcinomi (variante BAC) pazienti di sesso femminile & non fumatori

10 Oncogenic addiction : il tallone d Achille del cancro Dipendenza del clone neoplastico per la propria sopravvivenza e proliferazione dalla persistenza di un unica via di segnale abnormemente attivata in conseguenza di una lesione genetica Weinstein IB Science 2001 Dati Il fenotipo in vitro EGFR-addicted dimostrano che linee PREDICE cellulari la risposta di NSCLC, ai farmaci portatrici inibitori delle stesse di EGFR lesioni genetiche Il blocco(mutazioni) farmacologico di EGFR recettoriale ritrovate è realmente in vivo in efficace tumori umani, solo nelvanno ristretto incontro gruppo ad di tumori arresto dipendenti del ciclo ( addicted ) cellulare e dalla apoptosi inappropriata se trattate attivazione con inibitori del di recettore EGFR. stesso.

11 Mutazioni di EGFR e risposta ai farmaci inibitori 77% NSCLCs responsivi alla terapia con erlotinib sono EGFR-mutati Di Nicolantonio et al, PNAS 2008

12 Mutazioni di KRAS si associano a resistenza agli inibitori di EGFR Linardou et al., The Lancet Oncology 2008 KRAS mutations are highly specific negative predictors of response to single agent EGFR TKIs in advanced NSCLCs. Prevalenza mutazioni KRAS : 5-17% dei casi di NSCLC

13 Disegno e razionale dello studio clinico Sospetto clinico-strumentale di NSCLC Lesione periferica non visibile in FBS Lesione visibile in FBS FNAC Conferma diagnostica cito-istologica EBB Profilo molecolare EGFR - KRAS Selezione dei pazienti per la targeted therapy basata sul profilo farmacogenetico individuale

14 Obiettivo dello studio 1. Validazione dell approccio di screening del profilo mutazionale di geni candidati su campioni cellulari tumorali di NSCLC freschi e di piccole dimensioni per consentire l associazione di diagnosi molecolare ed istologica così da poter impostare un trattamento personalizzato e realmente efficace. 2. Descrivere le differenze qualitative dei vari tipi di campione cellulare necessari per la diagnosi molecolare. 3. Follow-up dei pazienti in target-therapy.

15 Procedura di Fine Needle Aspiration Citology (FNAC) 100% cellule tumorali selettività e specificità per il tumore dei risultati delle analisi molecolari condotte

16 Biopsia endobronchiale in FBS

17 Processazione dei campioni

18 Validazione dei risultati NSCLCs: estrazione DNA genomico Coorte di riferimento: EBB fresco Coorte in studio: FNAC/ fresco EBB paraffinato FNAC/fissato Analisi del profilo mutazionale nei geni candidati Se: P FNAC = P PARAFF = P ATTESA Validazione analisi mutazionale della procedura

19 Prospettive Ampliamento del pannello di geni candidati nel processo di oncogenesi polmonare (e.g. BRAF, PIK3CA, MET) con lo scopo di caratterizzare il profilo farmacogenomico del NSCLC ( NSCLC-signature ) Possibilità di ottenere, attraverso la procedura di FNAC/EBB, cellule tumorali fresche utilizzabili in coltura primaria - drug screenings: profili di resistenza e sensibilità a farmaci target - isolamento Tumor Initiating/Stem Cells Possibilità di applicazione di questa tecnologia alle altre maggiori neoplasie toraciche: carcinoma broncogeno a piccole cellule e mesotelioma pleurico maligno

20 Ringraziamenti: U.C. di Pneumologia Policlinico S. Matteo Pavia Dr.ssa Giulia Stella Dr..ssa Francesca Cemmi Dr. Michele Zorzetto Dr.ssa Simona Inghilleri Dr.ssa Ilaria Campo e soprattutto To Be Continued Prof. Ernesto Pozzi Prof. Maurizio Luisetti

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