MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/18

Transcript

1 IL LIEVITO

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3 La cellula di lievito

4 Caratteristiche generali Fungo unicellulare appartenente alla divisione ascomicete Cresce su substrati semplici Ha un tempo di generazione di circa 2 ore Si possono effettuare degli studi di genetica classica Può essere manipolato geneticamente trasformazione disponibilità di diversi tipi di plasmidi. S. cerevisiae è stato il primo eucariote completamente sequenziato: il genoma è circa 3,5 volte quello di E. coli, esistono circa 6000 geni (in E. coli sono circa 2000) di cui solo per una parte si conosce la funzione Può essere utilizzato come modello semplice per i complicati processi che avvengono nelle cellule degli eucarioti superiori. Viene utilizzato in numerosi processi biotecnologici.

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6 Sebbene i lieviti abbiano una complessità genetica più grande dei batteri, contengono 3.5 volte più DNA rispetto a Escherichia coli, condividono con quest ultimo molti vantaggi tecnici che hanno consentito un rapido progresso nel campo della genetica molecolare. Alcune delle proprietà che rendono il lievito particolarmente adatto per gli studi biologici includono la crescita rapida, forma unicellulare in forma dispersa, la facilità della replica plating e l isolamento di mutanti, un sistema genetico ben definito e una ampia versatilità di sistemi di trasformazione. Il S. cerevisiae è vitale anche se porta numerosi marcatori genetici. Essendo non-patogeno, il lievito può essere maneggiato tranquillamente senza particolari precauzioni. E infatti considerato un organismo GRAS (Generally Regarded As Safe). Ampie quantità di normale lievito panario sono commercialmente disponibili e possono fornire una risorsa a buon mercato per gli studi biochimici. Al contrario di molti altri microrganismi, i ceppi di S. cerevisiae possono esistere in forma stabile sia in forma aploide che in forma diploide. In questo modo le mutazioni recessive possono essere isolate e se ne può studiare il fenotipo nei ceppi aploidi; i ceppi diploidi possono essere utilizzati per generare mutazioni in geni essenziali e per test di complementazione.

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10 Colorazione delle cellule di lievito con rodamina-falloidina: messa in evidenza della actina

11 Parete cellulare del lievito I costituenti principali della parete del lievito sono: 1. 1,3-β-glucano: è il maggiore componente e forma lo scheletro fibroso della parete 2. 1,6-β-glucano: collega i componenti esterni ed interni della parete 3. mannoproteine: si trovano sulla superficie esterna della parete. Sono estensivamente glicosilate. La loro presenza limita la permeabilità ai soluti della parete. Le mannoproteine sono modificate mediante l aggiunta di un ancora glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI) 4. chitina: contribuisce alla insolubilità delle fibre. Si localizza nel collo di emergenza della gemme e forma una cicatrice. Contando le cicatrici si può risalire al numero di gemme prodotte da una cellula.

12 Colorazione delle cellule di lievito con calcofluoro: messa in evidenza della chitina

13 Lo sviluppo delle tecniche di trasformazione del DNA ha reso il lievito particolarmente accessibile alla clonazione genica e a tecniche di ingegneria genetica. Geni strutturali corrispondenti a praticamente qualsiasi tratto genetico possono essere isolati mediante complementazione da banche plasmidiche. I vettori utilizzati per la trasformazione del lievito sono di tre tipi: vettori integrativi (YIp), che si integrano a bassa frequenza nel genoma, vettori ad alto numero di copie (YEp), che si replicano autonomamente grazie all origine di replicazione del plasmide 2µ ed infine, vettori a basso numero di copie (YCp), che si replicano grazie ad una sequenza di replicazione autonoma (ARS). e che contengono anche una sequenza centromerica (CEN).Sono inoltre disponibili gli YAC, cromosomi artificiali di lievito, che vengono utilizzati per clonare grandi frammenti di DNA ( Kb); tali vettori sono lineari e contengono anche sequenze telomeriche oltre ad una origine di replicazione (ARS ) e al centromero (CEN).Grazie alla tecniche del DNA ricombinante ed alla costruzione di vettori di clonaggio e di espressione, il lievito Saccharomyces cerevisiae viene utilizzato per la produzione di proteine eterologhe.rispetto ad E. coli, le proteine prodotte in lievito possono subire le appropriate modifiche a livello post-traduzionale quali la glicosilazione. Inoltre, le proteine eterologhe secrete da ceppi ingegnerizzati mostrano un corretto ripiegamento e sono facilmente recuperate dal terreno di coltura.ciò ha permesso di produrre in lievito il primo vaccino umano, l antigene del core dell epatite B, ed il primo prodotto di impiego nel settore alimentare, la rennina (Sherman, 1997). Infine, le potenzialità del lievito in quanto organismo modello è illustrata dal fatto che molti geni di mammifero vengono introdotti in lievito per un analisi sistematica della funzione dei corrispondenti prodotti genici.

14 Vettore batterico

15 Classi di vettori di lievito

16 GENETICA CLASSICA La segregazione dei cromosomi in S. cerevisiae avviene in maniera simile a tutti gli altri eucarioti con una prima ed una seconda divisione meiotica. Durante la meiosi, le cellule di S. cerevisiae vanno incontro a cambiamenti morfogenetici. Ogni cellula diploide produce quattro spore apolidi contenute in un asco, chiamato anche tetrade. L associazione fisica di tutti i prodotti di una singola meiosi all interno di una tetrade, consente un analisi genetica della progenie molto precisa. L analisi genetica dei prodotti meiotici all interno di una tetrade richiede un metodo noto come dissezione delle tetradi che consiste nella separazione delle quattro spore di una tetrade su un terreno solido. Qui le spore germineranno e intraprenderanno il ciclo di vita mitotico. Per la dissezione delle tetradi è necessario un trattamento con un enzima litico (zimoliasi o glusulasi) che digerisca parzialmente la parete dell asco. Quindi, con l ausilio di un micromanipolatore, è possibile separare le spore.

17 A B C D Replica Terreno minimo privo di istidina Gene essenziale

18 Scopi dell analisi delle tetradi Verificare l effetto di una mutazione Analizzare la distanza sul cromosoma tra due marcatori genetici Creare doppi mutanti Verificare la relazione esistente tra due geni mediante l analisi del doppio mutante Verificare se una mutazione è dominante o recessiva

19 Isolamento ed analisi di mutanti Screening: ricerca di mutanti nei quali ogni candidato è testato per il fenotipo mutante. Si può pensare di fare uno screening su circa cloni Selezione: descrive l uso di particolari condizioni che consentono la crescita preferenziale o la sopravvivenza di organismi con un particolare fenotipo. E importante per isolare mutazioni rare; si possono analizzare anche 10 7 colonie per piastra

20 Un esempio di screening genetico

21 Test per verificare se un mutante è dominante o recessivo

22 Test di complementazione

23 Letalità sintetica mutazione1 mutazione2 mutazione1+2

24 Letalità sintetica P P P P P P P P P P P P P P P P P

25 Uso del lievito come sistema modello Idendificazione di un ORF umana (HuO) Esiste l omologo in lievito (YeO) Non esiste l omologo in lievito La funzione è nota La funzione non è nota Sovra-espressione del cdna HuO in lievito e osservazione del fenotipo Complementazione del mutante di lievito con la HuO Uso della genetica di lievito per studi di strutturafunzione Costruzione del mutante Il mutante non ha un fenotipo Sovrespressione del cdna HuO e YeO, isolamento di mutanti ts di YeO, isolamento di coletali al mutante YeO (letalità sintetica) Il mutante ha un fenotipo Complementazione del mutante di lievito con la HuO Uso della genetica di lievito per studi di struttura-funzione

26 Uso del lievito come sistema modello Le persone altruiste fanno cose straordinarie, danno prima che qualcosa gli sia chiesto, fanno cose senza la necessità di essere ringraziati, si preoccupano non soltanto per se stessi, ma anche per altri individui che apparentemente non si preoccupano del loro futuro, a volte sacrificano la loro vita per il bene della comunità. Queste persone sono molto rare nella maggior parte delle società. E molto difficile trovare dei microrganismi altruisti, ma uno studio sul lievito ha dimostrato che in alcune condizioni, le cellule di lievito si suicidano per il bene di altre cellule circostanti. Nelle cellule di mammifero la morte programmata di una cellula viene definita apoptosi. In organismi multicellulari, le cellule muoiono in continuazione. Se le cellule destinate a morire lo facessero semplicemente lisando, potrebbero rilasciare un gran numero di molecole tossiche nell area che le circonda e potrebbero così danneggiare le cellule in quest aria. Nell apoptosi invece, la morte cellulare è molto organizzata e come risultato si ha che i danni alle cellule vicine sono molto limitati. In pratica, quasi tutte le molecole tossiche che risultano dalla morte cellulare sono distrutte durante l apoptosi. Ciò è molto utile se una parte dell essere vivente sta morendo; sarebbe controproducente infatti compromettere la salute dell intero organismo solo perché una parte è malata.

27 Uso del lievito come sistema modello Ora, per quale motivo una cellula di lievito vorrebbe uccidersi? In fondo sono organismi unicellulari che devono pensare solo a loro stessi. L ossigeno, sebbene sia importante per una rapida crescita cellulare, può causare dei gravi danni. In presenza di un elevata concentrazione di radicali liberi molte cellule di lievito moriranno. Se morissero rilasciando il loro contenuto cellulare pieno di molecole tossiche, anche i pochi sopravvissuti morirebbero. Ciò sarebbe deleterio per la continuazione della specie se è presente nell ambiente una elevata concentrazione di ossigeno. Per evitare di perdere tutti i membri di una popolazione di lievito anche le cellule di lievito quindi intraprendono il processo apoptotico. Il risultato sarà in un danno minore per le cellule sopravvissute; oltretutto si renderanno disponibili nutrienti per le cellule sopravvissute, importanti nella ripopolazione di un altra nicchia. L apoptosi è una materia di studio importante in quanto a volte nel nostro corpo alcune cellule sopprimono la via che porta ad apoptosi, trasformando tali cellule in cellule cancerogene. Conoscere meglio come viene controllato il processo apoptotico potrebbe essere utile per delucidare alcuni segreti propri delle cellule cancerogene e quindi potrebbe aiutare nello sviluppo di terapie per il trattamento di queste cellule impazzite.

28 Marcatori citologici di apoptosi nel lievito e nei mammiferi 1. Rotture nella doppia elica del DNA Queste rotture causano la presenza di estremità 3 -OH libere che possono essere messe in evidenza mediante una specifica colorazione denominata TUNEL (pan. C e G) 2. Condensazione della cromatina La condensazione della cromatina si può osservare tramite una colorazione del DNA nucleare con il colorante DAPI. In questo caso si osserverà una marginazione della colorazione sulla membrana nucleare a formare un anello (pan.a, B, E, F) La condensazione della cromatina è anche visibile al ME (pan. I e J) 3. Esposizione della fosfatidilserina sulla membrana cellulare (pan. D e H) K.U. Frolich, F. Madeo, FEBS Letters 473 (2000) 6-9

29 Uso del lievito come sistema modello per lo studio dell apoptosi Le proteine della famiglia Bcl-2 svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell apoptosi, e comprendono fattori che promuovono l apoptosi (Bax e Bak) e fattori che bloccano il processo (Bcl-2 e Bcl-X L ). La completa sequenza genomica di S. cerevisiae ha mostrato assenza di geni omologhi ai principali regolatori apoptotici descritti nei metazoi (Bax, Bcl-2, Apaf-1). Tuttavia l espressione eterologa della proteina Bax in S. cerevisiae conferisce al lievito un fenotipo letale. Inoltre, la cellula va incontro a cambiamenti molecolari e morfologici caratteristici dell apoptosi.

30 Espressione della proteina umana proapoptotica hbax in lievito

31 Uso del lievito per l solamento di geni importanti per la funzione di Bax

32 I mutanti cdc I mutanti cdc (cell division cycle) sono quelli che in condizioni restrittive arrestano la crescita in un particolare stadio del ciclo cellulare. Sono stati di fondamentale importanza per determinare gli eventi che consentono la progressione nel ciclo cellulare e le proteina coinvolte in tali processi. Anche in questo caso si è rivelata una sorprendente omologia con i processi che avvengono nelle cellule degli eucarioti superiori. Il premio Nobel nel 2001 è stato assegnato a L. Hartwell, P. Nurse e T. Hunt per i loro studi sul ciclo cellulare. La maggior parte dei mutanti cdc del lievito S. cerevisiae sono stati isolati e caratterizzati nel laboratorio di L. Hartwell. P. Nurse si è occupato dello studio del ciclo cellulare nel lievito Schizosaccharomyces pombe, che per certi versi è più simile alle cellule degli eucarioti superiori. Questo lievito si riproduce per schizogonia (scissione binaria) e, pur avendo lo stesso contenuto in DNA del S. cerevisiae, il materiale genomico è organizzato in tre grandi cromosomi

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