QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA-Lite TM CCP IgG è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di Anticorpi della classe IgG diretti contro gli anticorpi anti-ccp, ovvero Cyclic Citrullinated Peptide (Peptide Citrullinato Ciclico), nel siero del paziente. La presenza di anticorpi anti-ccp IgG, può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di artrite reumatoide. Riassunto e Spiegazione del test L artrite reumatoide (AR) è una delle malattie autoimmuni sistemiche più frequenti. L eziologia della malattia è sconosciuta. Essa colpisce circa lo 0,5% della popolazione mondiale. Il numero di donne colpite è il doppio rispetto al numero degli uomini. 1 La diagnosi di AR viene fatta principalmente sulle manifestazioni cliniche della malattia. Fino a tempi recenti l unico test sierologico disponibile era la determinazione della presenza del fattore reumatoide (FR) nel siero. Il FR è costituito da anticorpi diretti contro la regione Fc delle immunoglobuline della classe IgG. Il FR può essere un immunoglobulina delle classi IgG, IgM ed IgA. La presenza del FR IgM è un indicatore tipico dell AR, e si rinviene in circa il 50-90% di questi pazienti. 1,2 Tuttavia, il FR IgM si trova anche in pazienti affetti da infezioni, da altre malattie autoimmuni ed anche in alcuni individui sani. 1,2 Il FR della classe IgG è meno sensibile ma è più specifico per l AR rispetto al FR della classe IgM. 2 È molto importante diagnosticare l AR il più presto possibile in modo da instaurare subito una terapia mirata e tenere così sotto controllo la malattia. 3 Da molti anni si è al corrente del fatto che i pazienti affetti da AR presentano autoanticorpi anti-perinucleari, altrimenti detti anti-cheratina. 4,5 Si è scoperto di recente che questi autoanticorpi riconoscono un epitopo che contiene la forma de-amidata dell arginina chiamata citrullina. 6 Si è notato che il peptide sintetico circolare che contiene la citrullina denominato Peptide Ciclico Citrullinato (CCP) è più efficace ai fini della diagnosi dell AR rispetto al test per il rilevamento degli autoanticorpi antiperinucleari o di quello per l individuazione del fattore reumatoide Nella letteratura, circa il 70% dei pazienti con AR risulta positiva agli anti-ccp, mentre solamente circa il 2% dei donatori di sangue e dei soggetti di controllo vi risulta positiva. In uno studio recente sono state riscontrate proteine citrullinate nelle articolazioni di pazienti affetti da AR, ma non in quelle di pazienti affetti da altri tipi di patologie articolari. 12 Questi risultati offrono una base teorica per la presenza di anti- CCP in pazienti affetti da AR ed un possibile ruolo nella patogenesi della malattia svolto da questi anticorpi. Principio della Metodica L antigene utilizzato nel test IgG CCP QUANTA Lite TM ELISA è un peptide sintetico citrullinato ciclico che si è scoperto avere alta sensibilità e specificità nel rivelare anticorpi nei pazienti affetti da AR. Questo antigene è adsorbito sulla parete dei pozzetti della piastra. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-ccp IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene CCP purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza 3. Controllo ELISA debolmente positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 4. Controllo ELISA fortemente (Calibratore A) per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 5. Calibratore B ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 6. Calibratore C ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 7. Calibratore D ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 8. Calibratore E ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed 9. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 1

2 10. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 11. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 12. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 13. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo CCP IgG, ELISA debolmente positivo CCP IgG ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. 2

3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA CCP IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo (Calibratore A) CCP IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore B ELISA CCP IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore C ELISA CCP IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore D ELISA CCP IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore E ELISA CCP IgG prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG, Controllo ELISA fortemente positivo CCP IgG ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di CCP IgG usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. 5. Se si desidera, i risultati possono essere anche quantizzati utilizzando una curva standard a 5 punti. Per i punti da A ad E della curva standard a 5 punti utilizzare i calibratori PREDILUITI CCP IgG da A ad E direttamente dalla fiala. La curva standard a 5 punti ha i seguenti valori: Punto Unità A Calibratore A CCP IgG prediluito 250,0 B Calibratore B CCP IgG prediluito 125,0 C Calibratore C CCP IgG prediluito 62,5 D Calibratore D CCP IgG prediluito 31,25 E Calibratore E CCP IgG prediluito 15,62 Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo CCP IgG, ELISA fortemente positivo CCP IgG, dei Calibratori ELISA positivi per CCP IgG da B ad E (se si vuole), ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta 3

4 dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo CCP IgG, ELISA fortemente positivo CCP IgG ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo CCP IgG, ELISA fortemente positivo CCP IgG ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo CCP IgG prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo CCP IgG prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo CCP IgG servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo CCP IgG non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati semi-quantitativi Metodo del rapporto Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo CCP IgG La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. 4

5 Metodo di calcolo opzionale: risultati semi-quantitativi utilizzando una curva standard Calcolo dei risultati utilizzando la curva standard opzionale 1. Calcolare un valore medio per i valori doppi. 2. Tracciare l assorbanza media (OD) dei campioni nella curva standard utilizzando i rispettivi valori in Unità. Utilizzare uno Spline cubico, lineare/lineare (polinomiale di terzo ordine) oppure una curva punto a punto per disegnare la curva. 3. Determinare la concentrazione sconosciuta di CCP in Unità dall asse Y leggendo l assorbanza corrispondente sull asse X. Calcolare le Unità sconosciute. 4. Nota: i valori calcolati utilizzando il metodo del rapporto saranno differenti rispetto a quelli calcolati con il metodo della curva standard. I valori elevati differiranno di più rispetto a quelli più bassi. Il CCP Fortemente Positivo non darà un valore di 250 Unità con il metodo del titolo. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Debolmente Positivo Moderatamente Positivo Fortemente Positivo >60 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro CCP IgG e suggerisce la possibilità di artrite reumatoide. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro CCP IgG anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM CCP IgG ELISA della INOVA. I valori CCP IgG ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da AR risultano positivi agli anticorpi CCP. 3. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 4. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. 5. Il valore diagnostico degli anticorpi anti-ccp in pazienti affetti da artrite reumatoide giovanile non è stato determinato. Valori attesi La capacità del test IgG CCP QUANTA Lite TM ELISA di rilevamento degli anticorpi CCP della classe delle IgG è stata valutata comparando i risultati a quelli di un test ELISA per la misurazione del FR IgG nonché misurando gli anticorpi anti-ccp in pazienti con diagnosi clinica di AR o di altra malattia sistemica autoimmune in due studi clinici esterni ed in uno studio interno su vasta scala. Range normale Sono stati testati in totale 216 campioni prelevati a donatori di sangue scelti a caso (118 donne e 98 uomini, età media: 39 anni). Due campioni (1%) sono risultati positivi agli anticorpi anti-ccp. In uno la presenza di anticorpi anti-ccp e FR IgG sono risultati fortemente positivi, un marker specifico dell AR. L altro è risultato debolmente positivo con sole 21 Unità. 5

6 Sensibilità e specificità clinica La seguente tabella riassume i risultati di tutti i nostri studi clinici. La diagnosi di AR in questi pazienti è stata fatta basandosi sui criteri ARA 14 ed in base al miglior giudizio del reumatologo responsabile. Riassunto dei risultati clinici Gruppo di pazienti Donatori di sangue scelti in maniera casuale No. CCP IgG ELISA No. 20 Unità (%) CCP IgG ELISA No. 40 Unità (%) 216 2* (1%) 1 (0,5%) Artrite reumatoide (76%) 158 (63%) Artrite reumatoide FR (90%) 142 (78%) Artrite reumatoide FR (40%) 16 (23%) Malattia reumatica (9%) 16 (5%) LES * (10%) 3 (3%) Sclerodermia 86 10* (12%) 7 (8%) Sindrome di Sjögren 38 0 (0%) 0 (0%) Altre malattie reumatiche 109 9* (8%) 6 (6%) Crioglobulinemia 29 2 (7%) 1 (3%) Malattie infettive 87 2 (2%) 1 (1%) Altri pazienti 29 1 (3%) 0 (0%) *Alcuni dei campioni risultati positivi agli anticorpi anti-ccp erano positivi anche al FR IgG, un altro marker anticorpale dell AR. Questi includevano un donatore di sangue, 2 pazienti affetti da LES, 4 pazienti affetti da sclerodermia e 3 dei pazienti con altri tipi di malattie reumatiche. Reazioni crociate Per determinare potenziali reazioni crociate dell antigene CCP con altri autoanticorpi, l IgG CCP QUANTA Lite ELISA è stato messo alla prova utilizzando 22 campioni, tutti contenenti livelli elevati di vari altri autoanticorpi. In questo gruppo erano presenti 2 campioni che hanno reagito con SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, TPO, Ribo-P, M2, cromatina e DNA. Tutti i campioni sono risultati negativi agli anticorpi anti-ccp. Il suddetto studio non ha dimostrato reazioni crociate significative del IgG CCP QUANTA Lite ELISA con una varietà di altri autoanticorp. Precisione e riproducibilità La variazione Inter-Test è stata misurata eseguendo analisi doppie di campioni negativi, debolmente positivi, moderatamente positivi, e fortemente positivi in 6 differenti prove durante 6 giorni diversi. La variazione Intra-Test è stata misurata analizzando 5 campioni, ognuno per 9 volte, sulla stessa piastrina ELISA. I risultati rappresentativi sono riportati qui di seguito. Variazione Inter-Test Neg.1 Neg.2 Debol.1 Debol.2 Mod.1 Mod.2 Fort.1 Fort.2 Unità medie 2,5 U 2,1 U 21 U 31 U 42 U 47 U 103 U 168 U DS 0,3 0,1 1,2 1,7 2,6 3,1 5,6 12 CV% 11% 7% 6% 6% 6% 7% 5% 7% Variazione Intra-Test Neg.1 Mod.1 Fort.1 Fort.2 Fort.3 Unità medie 2 U 52 U 107 U 109 U 175 U DS 25 4,5 5,4 4,2 4,9 CV% 11% 9% 5% 4% 3% Quando un campione debolmente positivo è stato analizzato per 45 volte sulla stessa piastrina si è riscontrato un valore di CV del 6%. 6

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