Metodo di conferma in GC-MS

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1 9 - TETRAIDROCANNABINOLO-COOH urinario Cod. GC47010 Metodo di conferma in GC-MS INTRODUZIONE Il 9 -THC-COOH è il metabolita urinario principale della Cannabis. La sua determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi ( UV, Fluorescenza, MS). Il presente metodo consente di determinare il 9 -THC-COOH urinario previa estrazione SPE e lettura in GC-MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 011 THC urinario in GC/MS Settembre

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare il 9 - Tetraidrocannabinolo-COOH (il maggiore metabolita della Cannabis) previa estrazione SPE e lettura in GC-MS. Recupero del Metodo : > 85 % Sensibilità del Metodo : 10 ng/ml Valore di cut-off: Range dinamico del Metodo : 15 ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 30 ottobre ng/ml Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A Reagente di Idrolisi, 1 x 30 ml Reagente B Soluzione Condizionamento 1, 1 x 200 ml Reagente C Soluzione Condizionamento 2, 1 x 200 ml Reagente D Soluzione Lavaggio, 1 x 300 ml Reagente E Soluzione di Eluizione, 1 x 50 ml Reagente F Soluzione Diluente, 1 x 50 ml Reagente G Soluzione Test, 1 x 0,5 ml Reagente L1 liofilo urinario Livello 1, 1 x 10 ml Reagente L2 liofilo urinario Livello 2, 1 x 10 ml Reagente L3 liofilo urinario Livello 3, 1 x 10 ml Reagente L4 liofilo urinario Livello 4, 1 x 10 ml Reagente L5 liofilo urinario Livello 5, 1 x 10 ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, 1 x 5 ml (5 ampolle da 1 ml) Colonne di Clean-up, 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento GC/MS Computer gestionale Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 10 ml urina Fase pre-analitica : Se non si analizza subito, congelare a -20 C. Stabile per circa 3 mesi. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA: FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo in pyrex pipettare : 450 µl di Reagente F Soluzione Diluente 50 µl di Reagente G Soluzione Test Al vortex per 20 secondi FASE 2 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto FASE 3 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante FASE 4: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Al vortex per 20 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 5 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 2 µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione del 9 - Tetraidrocannabinolo-COOH che deve essere simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA: FASE 1 : Idrolisi del Campione Fare una Curva di Calibrazione su 5 punti: Reagente L1 Livello 1 Reagente L2 Livello 2 Reagente L3 Livello 3 Reagente L4 Livello 4 Reagente L5 Livello 5 Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5 Campione Controlli Campione Controlli Reagente A Reagente di idrolisi 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Agitare al Vortex Release N 011 THC urinario in GC/MS Settembre

4 FASE 2 : Porre le provette in stufa a 60 C per 20 minuti. FASE 3 : Portare i campioni a ph neutro (5<pH<7) con Acido acetico. FASE 4 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 2 ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento 1 Scartare l eluato Versare in colonna 2 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 5 : Versare tutto il, i Campioni ed i Controlli precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto. FASE 6 : Lavaggio: Lavare con 3 ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 7 : Eluizione rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Eluire con 500 µl di Reagente E Soluzione di Eluizione Raccogliere l eluato in provette di vetro ed agitare al vortex FASE 8 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto FASE 9 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante Al vortex per 20 secondi FASE 10: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 11 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume INIEZIONE : Iniettare 2 µl della soluzione nel GC Release N 011 THC urinario in GC/MS Settembre

5 REAGENTE G: SOLUZIONE TEST 9 - TETRAIDROCANNABINOLO-COOH urinario- AVVERTENZE 9 - Tetraidrocannabinolo-COOH circa ng/ml REAGENTE L1-L2-L3-L4-L5 : CALIBRATORI LIOFILI URINARI Lot 9 - Tetraidrocannabinolo-COOH Modalità d uso e Ricostituzione: il deve essere usato per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 10 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 minuti fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 20 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 10 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5 ng/ml REAGENTE M: SOLUZIONE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. SETTAGGIO DEL GAS-CROMATOGRAFO : Colonna VF-5ms 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (condizionata) Temperatura iniettore 280 C Rapporto di Splittaggio Inizio: ON split 20 0 min: OFF 1 min: ON split min: ON split 20 Temperatura 120 C x 3,25 minuti + 20 C/min fino a 250 C x 1 minuto + 40 C/min fino a 300 C x 3 minuti (corsa 15 minuti) Gas Elio 1 ml/min SETTAGGIO DETECTOR DI MASSA (4000) : Range di Massa Temperatura della Massa: 180 C; Temperatura Transfer Line: 270 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: 3 minuti CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA VF-5 MS E DELLA SIRINGA Lavare la siringa prima dell iniezione con ACETONE. Per la colonna seguire le prescrizioni del costruttore. Non condizionare la (le) colonna/e se attaccata al Detector di Massa. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Tenerla alla massima temperatura per il tempo consigliato. ( Vedi istruzioni del costruttore ) 5

6 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC47016 per THC urinario 2 x 5 x 10 ml CC47017 Controllo per THC urinario Livello 1 6 x 10 ml CC47018 Controllo per THC urinario Livello 2 6 x 10 ml CC47019 Controllo per THC urinario Livelli 1 e 2 2 x 6 x 10 ml Z Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 Pz S Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 100 Pz 6

7 9 - TETRAIDROCANNABINOLO-COOH (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) MCounts t thc.sm s 50:800 50: % Spectrum 1A BP: min, Scan: 995, 50:800, Ion: 10 us, RIC: 1.249e+7, BC e+6 15 Area: 3.304e+6 THC-TMS ng/ml min 75% e % e % % minutes m/z Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : Spettro di Massa di Soluzione Test R.T THC IONE MOLECOLARE : 371 7

8 9 - TETRAIDROCANNABINOLO-COOH (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) MCounts cal thc 1600ngml.sms 50:800 50: % Spectrum 1A BP: min, Scan: 996, 50:800, Ion: 10 us, RIC: 4.268e+7, BC e Area: 1.690e+7 THC-TMS RF min 75% e+6 50% e+6 25% e % minutes m/z Fig. 3 : liofilo urinario Fig. 4 : Spettro di Massa di urinario R.T THC 1600 ng/ml IONE MOLECOLARE : 371 8

9 9 - TETRAIDROCANNABINOLO-COOH (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) MCounts camp. urinario 200ngml.sms 50:800 50: % Spectrum 1A BP: m in, S can: 99 5, 5 0:80 0, Ion: 12 u s, R IC : e+6, B C e % % % Area: 2.557e+6 THC-TMS ng/ml min % minutes m/z Fig. 5 : Campione urinario Fig. 6 : Spettro di Massa di Campione urinario R.T THC 200 ng/ml IONE MOLECOLARE : 371 9

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