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1 Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio Agatina Alessandrello Liotta AOU Careggi- Firenze SOD Malattie Aterotrombotiche CRR per lo Studio della Trombosi

2 Lupus anticoagulant Famiglia eterogenea di immunoglobuline di tipo IgG, IgM, IgA In vitro provocano allungamento dei test fosfolipide dipendenti Nel nostro organismo sono responsabili di trombosi arteriose e/o venose, di aborti ripetuti, morti fetali

3 NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA apl Criteri di laboratorio (Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4: ) Presenza di LAC, determinato secondo le linee guida proposte da SSC e/o Medio/alto titolo di anticorpi anticardiolipina β2 glicoproteina I dipendenti (IgG e/o IgM), misurati con tecnica ELISA standardizzata Conferma in 2 o più occasioni ad almeno 12 settimane di distanza

4 Intrinsic Pathway HMWK F IX F XI Surface HMWK F XII F XIIa F XIa F X PK Kallikrein F IXa F VIIIa Ca ++ PL F VIII Ca ++ PL Prothrombin TF-FVIIa Ca ++ F Xa Extrinsic Pathway Vascular Injury FXa Thrombin F VIIa F IXa F Va Ca ++ PL Ca ++ PL F X F Xa Ca ++ PL F V Tissue Factor (TF) TF-FVII F IX F XIII Thrombin FVII Ca ++ Fibrin F XIIIa Centro Trombosi, Firenze Fibrinogen Fibrin Cross-linked Fibrin

5 Antigeni degli apl Beta2 Beta 2 glicoproteina 1 1 Protrombina Protrombina Proteina Proteina C (attivata) C (attivata) Proteina Proteina S S Trombomodulina Annessina Annessina V V Attivatore Attivatore tissutale tissutale del del plasminogeno Chininogeni Chininogeni a basso a basso ed a alto ed a peso alto peso molecolare molecolare Fattore Fattore XII XII Lipoproteine Lipoproteine abassa a bassa densità densità ossidate ossidate (ox-ldl) (ox-ldl) Centro Trombosi, Firenze

6 CRITERI PER LA DIAGNOSI DI LUPUS ANTICOAGULANT PROPOSTI DAI SSC (1995) Prolungamento di 1 o più test di screening PL dipendenti (aptt, KCT, drvvt, dpt o TTI) Studi di mixing (1:1) per dimostrare la presenza di un inibitore ed escludere eventuali carenze di fattori Test di conferma per dimostrare che l inibitore è diretto contro i PL Esclusione di altre coagulopatie (es. inibitore del fattore VIII o presenza di eparina)

7 DIAGNOSTICA DEL LAC aptt Un aptt di routine nei limiti della norma, non è sufficiente per escludere la presenza del LAC I reagenti contengono fosfolipidi piuttosto concentrati, quindi l aptt può essere normale nei pazienti con LAC medio/debole Un aumento del fibrinogeno o fattore VIII (fase acuta, gravidanza) può accorciare l aptt e mascherare la presenza di un LAC debole Possono però essere utilizzati reagenti diluiti

8 APTT Ratio 3 2,5 2 1,5 1 APTT Responsiveness Tripodi et al, Clin Chem 2003 PTT LA Roche (n=21) Actin FSL Dade (n=6) Pathromtin SL Dade (n=8) Synthasil IL (n=5) APTT LT Roche (n=6) APTT SP IL (n=9) 0,5 A B C D Plasmas KPTT Stago (n=5)

9 aptt REAGENT Kershaw G Semin Thromb Hemost 2012

10 DIAGNOSTICA DEL LAC Kaolin e Silica Clotting Time (KCT, SCT) Non contengono PL Sono molto sensibili Molto influenzati dalla presenza di piastrine residue Specificità ridotta dalla presenza di carenza di fattori Il SCT è una modificazione del KCT che ne consente l impiego su tutti gli strumenti

11 DIAGNOSTICA DEL LAC drvvt Il veleno di vipera Russell attiva il fattore X in presenza di ioni Ca, FV,e PL. Esistono molti reagenti commerciali che sono però molto diversi per sensibilità e specificità Molti kit commerciali forniscono anche un reagente di conferma (fosfolipidi concentrati)

12 drvvt Ratio 2,5 drvvt Responsiveness Tripodi et al, Clin Chem ,5 Am. Diagnostica (n=23) LAC Screen IL (n=27) LA1 Dade (n=17) 1 0,5 A B C D Plasmas

13 DIAGNOSTICA DEL LAC Tissue Thromboplastin Inhbition Test ( TTI) Il PT è generalmente normale in soggetti con LAC (la tromboplastina contiene elevate concentrazioni di PL) Se però il reagente è diluito, la concentrazione dei PL può diventare fattore limitante Il TTI viene in genere eseguito con due o più diluizioni di tromboplastina Alcune tromboplastine ricombinanti sono particolarmente sensibili al LAC (Innovin, Dade Behring)

14 TEST DI SCREENING MODALITA DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI - SECONDI - RATIO R = SEC Tempo di coagulazione campione SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali

15 TEST DI SCREENING INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI I risultati sono considerati positivi quando i tempi di coagulazione sono più lunghi o la Ratio è maggiore del valore Cut-off stabilito per il test e calcolato al 99 percentile della distribuzione normale ( SSC 2009)

16 STEP I: TEMPO DEL CAMPIONE Possibili cause dell allungamento del tempo del campione in esame Carenza fattoriale o presenza di terapia farmacologica interferente (eparina, warfarin) Inibitore di tipo anticorpale: Lupus anticoagulante Inibitore specifico

17 drvvt (ratio) Studi di mixing Ripetere il test sulla miscela: plasma del paziente e plasma di un pool di soggetti sani in rapporto 1:1 (La miscela comunemente non è incubata a 37 C) Cut-off INIBITORE 0.8 Carenza fattoriale Carenza fattoriale P P+N Centro Trombosi Fi

18 TEST DI MIXING MODALITA DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI RATIO R = SEC Tempo di coagulazione miscela (paziente/pool plasmi normali V/V) SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali ICA % = (sec tempo di miscela-sec tempo pool normale) x 100 sec tempo del paziente ICA = (Indice di anticoagulante circolante)

19 TEST DI MIXING : INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Risultati sono suggestivi per la presenza di LAC quando ratio o ICA maggiori del valore Cut-off stabilito per il Test e calcolato al 99 percentile della distribuzione normale

20 STEP II: TEMPO DELLA MISCELA Cause dell allungamento del tempo della miscela in esame Inibitore di tipo anticorpale Lupus anticoagulante Inibitore specifico Eparina?

21 STEP III: TEST DI CONFERMA Tempo di coagulazione in presenza di fosfolipidi in eccesso: PNP Triplett, Am J Clin Pathol, 1983 Fosfolipidi in fase esagonale Rauch, Thromb Haemost, 1989 Triplett, Thromb Haemost, 1993 (Questo tipo di conformazione rende i PL più disponibili a legare il LA : maggiore specificità) valore assoluto - delta - ratio

22 drvvt (ratio) Test di conferma Cut-off 0.8 P P+fosfolipidi Centro Trombosi Fi

23 TEST DI CONFERMA FALSI POSITIVI LISATI PIASTRINICI FOSFOLIPIDI ESAGONALI Eparina Inibitori del fattore VIII Inibitori del fattore V a basso titolo (rilascio di fattore V dai granuli piastrinici) Centro Trombosi Fi

24 DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI INIBITORI DELLA COAGULAZIONE ANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICA Anti-fattore VIII, II, IX, X, XI Anti-fibrinogeno/fibrina Anticoagulanti eparino-simili Anti-fattore V ANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICI Lupus Anticoagulant Anti-fattore XII Centro Trombosi Fi

25 DOSAGGIO DEI FATTORI RIDUZIONE CHE MARCATA SINGOLO FATTORE NON SI MODIFICA DEL LA DILUIZIONE DEL CAMPIONE CON RIDUZIONE CHE SI APPARENTE PIU FATTORI NORMALIZZA DI CON LA DILUIZIONE DEL CAMPIONE INIBITORE SPECIFICO INIBITORE DI TIPO : LUPUS

26 J Thromb Haemost 2009

27 SCELTA DEI TEST L utilizzo di più di due test fosfolipide dipendenti aumenta il rischio di risultati falsamente positivi I due test devono basarsi su principi diversi I test raccomandati sono : drvvt, SCT

28 SCT aptt drvvt drvvt/sct drvvt/aptt SCT aptt drvvt drvvt/sct drvvt/aptt

29 SC

30 STANDARDIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICA - PRELIEVO - Tipo : venoso - Sede : vena cubitale della piega del gomito - Evitare laccio emostatico o ridurne la presenza, la stasi ematica provoca:variazioni di ph ed aumenti della CO 2 con perdita del fattore V; danno tissutale con conseguente liberazione di fattore tissutale e attivazione del fattore VII - TRATTAMENTO DEL CAMPIONE DI SANGUE - CONSERVAZIONE - Centrifugazione a 2800 g per 15 minuti a temp. ambiente - Separazione del plasma - 2 centrifugazione a rpm per 3-5 minuti * E importante ridurre le piastrine al di sotto di 1x10 9 /L - Congelamento rapido e conservazione a -80 C

31 CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA NORMALE PER I TEST DI MISCELAZIONE * PRIVO DI PIASTRINE * NORMALE CONTENUTO DI TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONE * NORMALE CONTENUTO DI FIBRINOGENO ( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto) IL POOL DI PLASMA NORMALE DEVE ESSERE CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A -70 C Centro Trombosi Fi

32 SOSPETTO DI EPARINA NEL CAMPIONE Prima di eseguire test di miscelazione e di conferma, procedure lunghe e costose ESEGUIRE TEST TEMPO DI TROMBINA

33 Effect of Lupus Anticoagulant and Anticoagulant Therapies on commonly used clinical laboratories assays Ortel TL, 2012, mod

34 LAC nei Pazienti anticoagulati Terapia eparinica: neutralizzare l eparina con sostanze antiepariniche(polibrene o eparinasi) oppure mediante l uso di una resina (ecteola) che mescolata al plasma, dopo idonea incubazione, è capace di adsorbire l eparina Anticoagulanti orali: Esecuzione dei test previa miscela del plasma del paziente con plasma normale (v/v); Esecuzione del test di conferma a due diverse concentrazioni di fosfolipidi, senza preventiva miscelazione con plasma normale. L entità della correzione rispetto ai valori di base del test consente di effettuare la diagnosi (Tripodi A et al )

35 LAC e Sospensione terapia anticoagulante VKA: 1-2 settimane dalla sospensione della terapia o quando INR < 1.5 LMWH: l effetto dipende dal tipo di eparina utilizzata, dal momento in cui viene eseguito il prelievo attendere almeno 12 h dall ultima somministrazione

36 Normalized Ratio SILICA CLOTTING TIME 2.0 before surgery 5 days after surgery, 2-3 hours of rivaroxaban administration Patients Alessandrello Liotta A.

37 Ratio DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST 3.0 before surgery 5 days after surgery,2-3 hours of rivaroxaban administration lessandrello Liotta A Patients

38 Ratio DILUTED RUSSELL VENOM VIPER: mixing normal plasma (V/V) test five days after surgery Patients on Rivaroxaban Alessandrello Liotta A.

39 Ratio DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST: Confirm Test five days after surgery Patients on Rivaroxaban Alessandrello Liotta A.

40 STACLOT LA test by using hexagonal phospholipids After DRVVT confirmation test (by adding phospholipids) 6 patients were positive at LA testing, in the other 10 patients the DRVVT confirmation was still prolonged. For this reason, we performed STACLOT LA test by using hexagonal phospholipids and LA was not confirmed.

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42 Test Integrati per la rilevazione del LUPUS ANTICOAGULANT Modalità di espressione dei risultati: % Correzione = [(Screening ratio-confirmation ratio)/screening ratio] x 100 Ratio Normalizzata (TR)= Screening Ratio/ Confirmation Ratio

43 Lupus Anticoagulant: I test integrati To Mix or Not To Mix in Lupus Anticoagulant Testing? That is the Question Armando Tripodi Seminars Thrombosis and Hemostasis, 2012 ; 38:

44 Lupus Anticoagulant: I test integrati L esperienza del Centro Trombosi- Firenze Test mix effettuati su campioni negativi: 127 Allungamento del tempo di miscela: 0 L allungamento del tempo di miscela è stato rilevato su un solo caso positivo N.M. DRVVT S sec.47,2 R=1,51 SCT S sec 60,3 R=1,61 DRVVT C sec.29,7 R= 0,98 TR= 1,55 SCT-C sec 26,4 R= 0,86 TR= 1.88 DRVVT Mix sec R= 1,51 SCT-Mix sec 84,2 R = 2,21 TR =2,56 [DRVVT cut-off TR< 1.12] [SCT cut-off TR< 1.16]

45 Da fare

46 aptt allungato.? Test Integrati LAC Presente LAC assente Test di Miscelazione v/v drvvt S R= 1.49 (cut off R <1.16) drvvt C R=1.64 (cut off R <1.11) drvvt Mix R= 1.07 (cut off R <1.09) SCT S R= 1.58 (cut off R <1.33) SCT C R= 1.86 (cut off R <1.45) SCT Mix R= 0.98 (cut off R <1.16) Campione 1 : aptt 51 sec (V.N sec) drvvt S R= 1.21 (cut off R <1.16) drvvt C R= 1.23 (cut off R <1.11) drvvt Mix R= 1.32 (cut off R <1.09) SCT S R= 2.11 (cut off R <1.33) SCT C R= 2.09 (cut off R <1.45) SCT Mix R= 1.50 (cut off R <1.16) Campione 2: aptt 56 sec (V.N.26-38sec) Carenza fattoriale: Fatt X = 20% Inibitore Fatt VIII = 2.8 U/mL

47 Nuova definizione di Sindrome da apl (Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4: ) CRITERI DI LABORATORIO Lupus anticoagulant determinato in base a quanto stabilito nelle linee guida proposte dal SSC, positivo in 2 o più occasioni ad almeno 12 settimane di distanza. Anticorpi anticardiolipina-β 2 glicoproteina I dipendenti qualificati con tecnica ELISA standardizzata, di classe IgG e/o IgM, presenti a medio o alto titolo in 2 o più occasioni a distanza di almeno 12 settimane. Centro Trombosi Fi

48 Schouwers Thrombosis Research 2010

49 Lupus Anticoagulant Appropriatezza della richiesta Alta: -Tromboembolismo venoso spontaneo in pz. età <50 anni -Tromboembolismo arterioso inspiegabile -Trombosi in sedi inusuali -Morti fetali -Trombosi o patologia gravidica in pz. con malattie autoimmuni Moderata: -Rilievo casuale di aptt allungato in pz. asintomatico -Più aborti spontanei precoci -Tromboembolismo venoso secondario in pz. giovani Bassa: -Tromboembolismo venoso o arterioso in pz. Anziani Thrombosis Research 2012 Pengo

50 REFERTO Risultati analitici accompagnati da un commento sulla loro compatibilità con la presenza o meno di lupus anticoagulant Per i casi positivi alla prima determinazione consigliare di ripetere il test dopo almeno 12 settimane

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