DNA footprinting. Interazioni DNA-proteine. Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi.

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1 Interazioni DNA-proteine Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. L analisi della sequenza dei primi promotori nei batteri non rivelò, come atteso, la stessa sequenza ma regioni molto eterogenee all interno delle quali si riconoscevano due sequenze conservate una a -10, con consensus TAATAT e un altra a -35 con consensus TTCAGA. Studi di footprinting e analisi di mutazioni hanno confermato l importanza funzionale di queste regioni regolative. DNA footprinting Il DNA footprinting è una tecnica che riesce a determinare l esatta posizione della proteina legata ad una sequenza di DNA. Un frammento di DNA, che si suppone contenga una regione di legame, viene marcato, fatto interagire con la proteina in esame e digerito parzialmente con DNasi I. L eventuale legame alla proteina proteggerà la regione di legame dalla degradazione endonucleasica. 1

2 La miscela di reazione viene quindi risolta su gel di poliacrilammide, insieme ad una reazione di controllo senza la proteina, e viene visualizzata tramite autoradiografia. Lo stesso frammento usato per il footprinting viene sequenziato per risalire alla sequenza di legame. Promotori eucarioti La RNA polimerasi negli eucarioti per funzionare ha bisogno di numerosi fattori di trascrizione. Negli eucarioti esistono tre classi di promotori riconosciuti rispettivamente dalla RNA polimerasi I, II e III. Ci limitiamo a descrivere la RNA polimerasi II. La RNA polimerasi non è in grado di sostenere una trascrizione efficace in assenza dei fattori di trascrizione. La RNA polimerasi, inoltre, non si lega direttamente al promotore ma ha bisogno di una serie di fattori di trascrizione che formano il cosìdetto complesso pre-inizio che presiede ai livelli basali di trascrizione. 2

3 Se si sospetta o si vuole confermare la presenza di una regione di legame al DNA uno dei metodi più immediati è quello noto come gel shift o EMSA. EMSA L EMSA (electrophoretic mobility shift assay) è una tecnica intensamente usata per studiare le interazioni DNA-proteina. Tale tecnica si basa sul fatto che i complessi DNA-proteina, in un gel di polyacrilammide nativo, migrano più lentamente del DNA non legato producendo uno shift nella migrazione delle bande di DNA marcato. Se sono disponibili anticorpi contro la proteina che sospettiamo interagire con il nostro DNA, è possibile effettuare, come controllo, un esperimento di supershift. Incubando la miscela proteine/dna con uno specifico anticorpo, questo si legherà alla proteina. Se, a sua volta, questa proteina era legata al DNA, si registrerà un ulteriore ritardo su gel rispetto al campione contenente solo l estratto proteico/dna. 3

4 Occorrente per l analisi: oligonucleotidi di DNA marcato (con radioattivo o con biotina) oligonucleotidi di DNA non marcato freddo estratti nucleari gel di polyacrilammide nativo (4-8%) TBE (Tris-Borato-EDTA) Membrane di nylon cariche positivamente Lastre fotografiche Apparato per elettroforesi Apparato per elettroblotting Lampada UV per cross-link Preparazione estratti nucleari Si effettua a partire da cellule in coltura o da un tessuto. Con opportuni tamponi occorre dapprima rompere la membrana cellulare per ottenere il rilascio del contenuto citoplasmatico. Tramite centrifugazione si recuperano i nuclei cellulari intatti; questi vengono poi lisati con un tampone adatto, si centrifuga e, dopo centrifugazione, si recupera il contenuto nucleare che viene aliquotato e congelato a -80 C fino al momento dell uso. 4

5 Preparazione gel nativo Si prepara con TBE (concentrazione finale 0.5X), acrilammide-bisacrilammide alla concentrazione finale del 4-8%, glicerolo, APS e Temed. Il gel, una volta polimerizzato, viene posto nella camera di corsa, preventivamente riempita di tampone TBE 0.5X, e sottoposto ad una pre-corsa per minuti (ciò riduce le forze generate durante la corsa). Preparazione reazioni di binding Si effettuano a temperatura ambiente per 20 minuti. Si aggiungono un appropriato buffer, poly(didc), glicerolo NP- 40, MgCl 2, DNA non marcato, gli estratti nucleari (2μg circa per ogni reazione), DNA marcato (20 fmoli). E necessario, per ogni complesso da esaminare, preparare un campione contenente solo il DNA marcato; uno contenente il DNA marcato più l estratto nucleare e uno contenente il DNA marcato più l estratto nucleare più il DNA freddo in eccesso. Corsa elettroforetica I campioni vengono addizionati con tampone di caricamento (contenente glicerolo, blu di bromofenolo e xilene cianolo) e caricati sul gel. Si manda la corsa (100 V) per il tempo opportuno. Il gel viene poi staccato e posto in contatto con la membrana di nylon, si assembla il tutto come in un normale western blotting e si fa avvenire il trasferimento (in tampone TBE) per 1 h a 4 C (380mA). Dopo la corsa il DNA viene fissato sulla membrana tramite UV crosslinking. 5

6 Se si sono utilizzati oligonucleotidi biotinilati, quindi, la membrana viene posta in contatto con una soluzione contenente streptavidina-coniugata ad una perossidasi. La streptavidina è una proteina che presenta una forte affinità per la biotina. Si fanno poi dei lavaggi per eliminare l eccesso non legato e poi si lascia la membrana a reagire con una soluzione contenente come substrato luminolo e perossido di idrogeno. Luminolo e derivati Il luminolo ed i suoi derivati sono fra i composti chemiluminescenti che hanno trovato maggior utilizzazione in campo analitico. La struttura base della molecola del luminolo (5 amino, 2-3 diidroftalazina, 1-4 dione) è costituita da due anelli adiacenti: uno aromatico, che non subisce nessuna variazione durante la reazione chemiluminescente, e l altro eterociclico non aromatico che invece viene ossidato durante tale reazione dando origine allo ione ftalato in uno stato di eccitazione elettronica (tripletto) che ritornando allo stato fondamentale (singoletto), restituisce l energia di eccitazione sotto forma di fotoni (Fig. 8). g 8. Reazione di ossidazione del luminolo 6

7 Anche per il luminolo e i derivati dell isoluminolo, sono stati messi a punto sistemi di accoppiamento con un enzima. In particolare si è sfruttato l accoppiamento perossidasi+luminolo. Sebbene l esatto meccanismo e la precisa natura delle specie emittenti non sia ancora completamente elucidato, uno schema di reazione comunemente accettato prevede l ossidazione del luminolo mediante formazione di un complesso tra ossidante (H2O2) e perossidasi per produrre un radicale del luminolo. I radicali del luminolo intervengono poi in ulteriori reazioni che danno origine ad un endoperossido che successivamente si decompone in uno ione ftalato in uno stato elettronicamente eccitato che emette luce nel suo ritorno allo stato fondamentale (Fig. 8). La natura multistadio della reazione, con numerosi fattori limitanti e molte reazioni laterali che competono con la principale, determina un efficienza quantica complessiva molto bassa e quindi non utilizzabile per scopi analitici. Per aumentare l efficienza luminosa di questa reazione, sono state introdotte molecole denominate comunemente amplificatori, "enhancer", che si sono dimostrate molto efficienti nel miglioramento dell emissione luminosa di questa reazione, fino a raggiungere in condizioni ottimali livelli anche 1000 volte superiori rispetto alla reazione chemiluminescente tradizionale ed inoltre, in particolari condizioni di reazione, l emissione luminosa è prolungata e decade molto lentamente. 7

8 Aspetti generali della chemiluminescenza La luminescenza consiste fondamentalmente nell emissione di radiazioni luminose nel visibile o nel vicino visibile (lunghezza d onda compresa nell intervallo nm) dopo che elettroni eccitati mediante una qualche fonte di energia, ritornano dallo stato eccitato a quello fondamentale. L energia potenziale delle transizioni elettroniche all interno degli atomi o delle molecole viene così liberata sotto forma di luce. Immunoprecipitazione cromatinica L immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) è una tecnica che consente di studiare le interazioni DNA/proteina in vivo. Con tale tecnica le cellule intatte vengono trattate con formaldeide che blocca e conserva le interazioni DNA/proteina. Il DNA viene poi frammentato (tramite sonicazione o digestione enzimatica) e i complessi DNA/proteina di interesse vengono immunoprecipitati usando un anticorpo diretto contro la proteina di interesse. Analisi del DNA dopo frammentazione tramite sonicazione. Lane 1: 100bp DNA ladder Lane 2: DNA estratto dalle HeLa intatto Lane 3: DNA dopo 5 minuti di digestione Lane 4: DNA dopo 10 minuti di digestione Lane 5: DNA dopo 15 minuti di digestione. 8

9 Il legame DNA/proteina viene poi rotto e le proteine vengono rimosse tramite trattamento con Proteinasi K. K Il DNA viene quindi purificato ed analizzato,, tramite PCR, per comprendere quali sequenze di DNA formavano complessi con la proteina di interesse. 9