MANUALE D USO Genikon. (Cariotipizzazione, FISH analisi, C.G.H.,Multiplex Fish, Spot Counting, Ricercatore metafasi )

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1 MANUALE D USO Genikon (Cariotipizzazione, FISH analisi, C.G.H.,Multiplex Fish, Spot Counting, Ricercatore metafasi ) Dicembre 2013

2 Prodotto: Versione: 3.8 Genikon Genikon è costruito e distribuito da: Nikon Instruments S.p.A. Via di San Quirico N Campi Bisenzio (Firenze) Tel. 055/ Fax 055/ SCOPO DI UTILIZZO: PER RICERCA E NON PER APPLICAZIONI IN ROUTINE Copyright: 2013 Nikon Instruments S.p.A Le informazioni contenute all interno di questo manuale sono soggette a variazioni senza preavviso. Nessuna parte di questo manuale può essere copiata, distribuita o trasmessa senza il consenso di Nikon Instruments S.p.A.

3 Genikon SOMMARIO 1 INTRODUZIONE AL SISTEMA Hardware Software INTRODUZIONE ALLA SICUREZZA La figura dell Amministratore AVVIO DEL PROGRAMMA Login Primo accesso Registrazione di un archivio Il mouse di Genikon Il tasto centrale Il tasto sinistro Il destro del mouse Gestione degli utenti Chiusura del programma AMBIENTE PRINCIPALE Gestione dei casi Caso corrente Mostra la lista dei casi Creazione di un nuovo caso Modifica del nome del caso Eliminazione di un caso Ricerca di un caso Scheda paziente (scheda esame) Elenco dei vetrini Elenco delle cellule 4-11

4 Immagini Unità Rimovibili Definizione delle unità rimovibili Archiviazione di un caso Ripristino dei casi da Unità rimovibile Esportazione di un caso Importazione di casi da Archiviazione Gestione immagini ACQUISIZIONE IMMAGINI Come si fotografano nuove cellule Scelta della modalità di lavoro Setup della telecamera Acquisizione di una nuova immagine Acquisizione immagini da telecamere ad alta risoluzione Sottrazione del fondo dalle immagini acquisite Soglia manuale Soglia automatica con contrasto Soglia automatica Adattiva Fusione di cromosomi esterni al campo Controllo automatico del fuoco sull immagine ANALISI ED ELABORAZIONE DELLE IMMAGINI Ambiente d Analisi delle metafasi Conta dei cromosomi Appaiamento degli omologhi Ambiente di Elaborazione Gestione immagini in Ambiente d Elaborazione Toolbar d elaborazione dei cromosomi Identificazione delle strutture sulla metafase e\o sul cariotipo Selezione e deselezione di cromosomi Pseudocolore Separazione di cromosomi uniti Unione di frammenti di cromosoma Funzione unione oggetti rapida Selezione di tutte le strutture Deselezione di tutte le strutture Eliminazione di strutture 6-16

5 Genikon Ripristino di una struttura eliminata Correzione sfondo e luminosità Funzione di affinamento dei contorni Ripristino dei cromosomi Profilo Ideogrammi di confronto Aggiustamento dimensione ideogrammi a cromosomi Undo Salvataggio Uscita dall ambiente d elaborazione Creazione e modifica del cariotipo Formato del cariotipo e posizione dei centromeri Modifica dei cromosomi Ritocco dei cromosomi Conteggio delle bande Aggiunta di testo e frecce Creazione d immagini composizione Confronto tra omologhi Raddrizzamento di un cromosoma ANALISI IN FISH Acquisizione d immagine in FISH Creazione della lista d acquisizione dei fluorocromi Creazione nuovi fluorocromi Trasferimento fluorocromi alla lista Memorizzazione della lista dei fluorocromi Acquisizione dei fluorocromi Sottrazione della soglia per immagini Fish Zone di interesse Acquisizione 3D focus in Fish Analisi della FISH Selezione delle motorizzazioni Valutazione dell intensità delle fluorescenze CGH Introduzione 8-1

6 8.2 Acquisizione immagini in CGH Sottrazione della soglia in CGH Aggiustamento dello shift Parametri di controllo per Acquisizione in CGH Elaborazione d immagini in CGH Analisi dei risultati in CGH Interpretazione dei profili ANALISI IN MULTIPLEX FISH Acquisizione d immagini in Multiplex Definizione della lista dei fluorocromi e della mappa associata Acquisizione dei fluorocromi Elaborazione ed analisi Multiplex FISH Analisi dei singoli cromosomi in MFISH IDEOGRAMMI Anomalie Editing anomalie Archiviazione anomalie FOGLIO DI LAVORO STAMPA IMMAGINI E DATI Finestra di controllo Come creare un nuovo Layout di stampa Barra delle funzioni Barra di stato Righello e linee guida Gestione delle immagini del report PERSONALIZZAZIONE DELL ARCHIVIO EDITOR DI SPECIE 14.1

7 Genikon 14.1 Creazione di una nuova specie Disegno del Formato del cariotipo Come posizionare una classe all interno dell area di lavoro Rimozione di una classe dall area di lavoro Raggruppamento di classi Caricamento di una specie Cancellazione di una specie Uscita OPZIONI Generale (impostazioni) Posizione del server Specie di appartenenza dei nuovi casi Impostazioni per l ambiente principale Impostazioni per l Acquisizione Telecamera principale Ruota fitri Microscopio motorizzato Configurazione filtri dei microscopi Configurazione ruota filtri Tavolini motorizzati Soglia adattiva ed informazioni su singola cellula Impostazioni di visualizzazione Personalizzazione dei colori COMANDI DA TASTIERA Associazione di funzioni a tastiera Modifica di una combinazione Eliminazione di una combinazione Eliminazione di tutte le combinazioni impostate Memorizzazione e richiamo di impostazioni predefinite Memorizzazione di un elenco di impostazioni Richiamo dell elenco di impostazioni Impostazioni per la stampa dei report Impostazione per l esecuzione di macro 16-4

8 17 MACROROUTINE Creazione della macroroutine Nomina della macroroutine Memorizzazione della macroroutine Associazione di una macro a tastiera SPOT COUNTING Archivio Ambiente di Acquisizione immagini Calibrazione del sistema Definizione del tipo di analisi Inizio della scansione Elaborazione RICERCATORE DI METAFASI /20 20 RIEPILOGO Procedura di Acquisizione - Analisi - Elaborazione Funzioni accessibili tramite Menu 20.2

9 Genikon 1 Introduzione al sistema Genikon utilizza come sistema operativo Microsoft Windows 98, NT, 2000, XP. Per eventuali informazioni relative al sistema operativo è possibile utilizzare la guida in linea (da Start in basso a sinistra del monitor scegliere Guida in linea ) 1.1 Hardware Genikon è costituito da un computer, monitor, scheda di acquisizione, tastiera, mouse (a tre tasti funzione che illustreremo in seguito), telecamera (differente secondo le applicazioni), supporto per archivio (alternativo al disco rigido), stampante ed altre varie periferiche (tavolini motorizzati, ruote filtri.. Il microscopio è collegato mediante un adattatore passo C alla telecamera. Le immagini che osserviamo al microscopio passano alla telecamera ed il segnale analogico viene digitalizzato mediante la scheda di acquisizione collocata all interno del computer; nel caso di camere digitali non sono necessarie schede di acquisizione. Genikon lavora in Campo chiaro(gtg), Fluorescenza (QFQ), FISH, MULTIPLEX FISH e C.G.H.. Per le applicazioni in campo scuro è sempre buona norma accendere prima la fluorescenza del microscopio e poi il PC, il monitor e le altre periferiche (stampanti). Per quanto riguarda la chiusura non esiste invece una particolare sequenza. 1.2 Software Genikon è costituito da un software principale che può essere integrato con più moduli opzionali, in modo da soddisfare ogni tipo di applicazione. I moduli opzionali sono riportati in Tabella

10 Modulo Nome Descrizione A Archivio Memorizzazione casi su un archivio centrale B Acquisizione Possibilità di acquisire immagini dal microscopio C Alta risoluzione Acquisizione in alta risoluzione D Software per PGD Acquisizione secondo la tecnica PGD E Cariotipo manuale Funzione per effettuare manualmente il cariotipo F Cariotipo automatico Possibilità di eseguire il cariotipo in automatico G Software per FISH Analisi di immagini FISH H Ruota dei filtri Controllo da PC della ruota dei filtri I Motorizzazione per Nikon Controllo da PC del microscopi Nikon J Comparative Genomic Hybridization Analisi di immagini CGH T Ricercatore Ricercatore metafasi Tabella 1.1: I Moduli di Genikon

11 Genikon 2 Introduzione alla sicurezza Genikon si utilizza sia come programma su un unica stazione di lavoro ( stand alone ) oppure se si dispone di una rete locale, è possibile attrezzare più stazioni in modo da lavorare contemporaneamente sugli stessi casi, che risiedono fisicamente su una delle stazioni collegate alla rete, (architettura client-server ). Normalmente la stazione sulla quale risiede l archivio è un server e deve essere dedicato all archivio e non utilizzato per Analisi od Elaborazioni. 2.1 La figura dell Amministratore In entrambi i casi è consigliabile che una sola persona si faccia carico di tenere sotto controllo la situazione degli utilizzatori di Genikon. Costui viene detto amministratore del sistema, e si occupa di effettuare il primo accesso al programma e di definirne gli utilizzatori. 2-1

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13 Genikon 3 Avvio del programma 3.1 Login Facendo doppio-click sull icona di Genikon Fig. 3.1: Icona di Genikon il programma si avvia, e mostra la finestra di login (Fig.3.2). Riempire le caselle Nome utente e Password con i propri parametri di accesso, come concordato con l amministratore. Fig. 3.2: Finestra di login Primo accesso La prima volta che si avvia il programma deve essere l amministratore ad accedere: solo lui potrà creare gli utenti che lo utilizzeranno. Come Nome utente mettere GKAdmin, e premere il tasto, senza inserire alcuna password. Si ottiene così l accesso al programma Registrazione di un archivio Con il primo accesso il programma richiede di registrare un archivio (cioè di predisporre il sistema per utilizzarne uno). 3-1

14 Fig..3.3: Registrazione di un archivio S lezioniamo un modello di archivio (un modello Standard viene fornito con Genikon ed e è denominato tipico.gkm altrimenti, è possibile creare modelli personalizzati per mezzo dell applicazione esterna di Personalizzazione archivi : vedi capitolo 13) e digitiamo Apri Premere il tasto di assenso per confermare. Una volta terminata la fase di registrazione dell archivio, Genikon si presenta come in Figura 3.4. NESSUN CASO E APERTO, nulla è selezionato tranne la lista di casi che con un sistema nuovo non dovranno essere presenti. Fig. 3.4: Ambiente principale 3-2

15 Genikon 3.2 Il mouse di Genikon Al mouse del sistema GENIKON sono associate numerose funzioni: In generale è necessario considerare che il mouse da utilizzare con Genikon deve essere a tre tasti: sinistro, centrale, destro Il tasto centrale 1. Quando lavoriamo su una metafase o su un cariotipo, posizionati sulla finestra principale del menu di elaborazione, se digitiamo il tasto centrale automaticamente si otterrà un valore di zoom del doppio. Se digitiamo nuovamente il tasto ritorniamo all ingrandimento originale. La stessa funzione si ottiene se digitiamo due volte il tasto di sinistra del mouse. 2. Quando dividiamo due oggetti manualmente e tracciamo la linea di separazione se desideriamo torniamo indietro con la linea possiamo utilizzare il tasto centrale Il tasto sinistro 1. Il tasto sinistro è quello più utilizzato e generalmente si utilizza per selezionare con un semplice click o per attivare o per lanciare un programma con un doppio click. Al tasto sinistro sulla seguente icona sono associate tutte le funzioni di assenso e conferma. Vediamo cosa è associato ad un semplice o ad un doppio click. Con doppio click possiamo lanciare genikon dal pannello di controllo digitando sull icona di GENIKON. 3-3

16 Con il tasto di sinistra selezioniamo o deselezioniamo oggetti singoli o a gruppi. Se con il mouse passiamo sopra agli oggetti compare un rettangolo tratteggiato che visualizza come sono composti i gruppi; se desideriamo selezionarlo dobbiamo digitare il tasto di sinistra del mouse. Il gruppo o l oggetto singolo verrà circoscritto da una linea continua. Da questo momento in poi tutte le funzioni saranno attive su quel gruppo o oggetto singolo selezionato. Se digito con il tasto sinistro su un nome di un caso specifico dalla lista dei casi, il sistema apre automaticamente il caso e mostra il contenuto sulla galleria delle immagini: Fig.3.5: Galleria immagini Se digitiamo un altro nome automaticamente il caso si chiude e viene aperto quello nuovo selezionato. Il tasto di sinistra si utilizza per muovere tutti i cursori di controllo: Fig.3.6: Cursori E necessario premere il tasto di sinistra e spostarlo fino al valore desiderato. 3-4

17 Genikon Il tasto di sinistra è necessario anche per disegnare delle ROI (regioni d'interesse) durante la fase di sogliatura del campo chiaro o FISH. Digitando il tasto di sinistra si inizia a scrivere e ci si muove fino al punto successivo. Per terminare digitiamo il tasto di destra. Fig.3.7:Disegno delle R.O.I. Nella fase di fusione per trasferire degli oggetti possiamo utilizzare la funzione specifica associata alla seguente icona, uno alla volta o tutti insieme; possiamo anche trasferirli digitando il tasto di sinistra sul cromosoma prescelto e mantenendo premuto si porta il mouse sulla finestra dove si desidera trasferire l oggetto. Fig.3.8:Trasferimento dei cromosomi da fusione L operazione di trasferimento dei cromosomi si può anche eseguire dalla metafase al collage. 3-5

18 Il tasto di sinistra si utilizza per posizionare un punto sui cromosomi durante la conta, si leva dalla conta digitando nuovamente il tasto di destra. Il tasto di sinistra si utilizza per iniziare il taglio manuale tra due oggetti. Digitiamo il tasto di sinistra e tracciamo una linea lungo il punto di contatto, terminiamo con il tasto di destra. Fig.3.9: Taglio semi_manuale Durante la dissovrapposizione manuale è possibile posizionare 4 punti sull incrocio col tasto di sinistra o levarli con quello di destra. Fig.3.10: Posizionamento dei punti di incrocio Se anche la dissovrapposizione manuale non ha funzionato possiamo procedere a disegnare gli assi dei singoli cromosomi. Per disegnare l asse iniziamo con il tasto di sinistra e tenendolo premuto procediamo fino al termine dell asse. Per terminare il. Fig.3.11: Disegno dell asse di un cromosoma Per spostare i cromosomi sul foglio del cariotipo teniamo premuto il tasto sx e posizionandoci al numero corretto della classe d' appartenenza. Di nuovo il tasto di sinistra serve per correggere la posizione del centromero dopo attivazione della funzione specifica. 3-6

19 Genikon Il tasto di sinistra entra in funzione per cancellare porzioni del cromosoma dopo avere attivato la funzione specifica. Nella M_fish dopo avere costruito il cariotipo e dopo avere aperta la mappa dei fluorocromi se ci si posiziona sul cromosoma anche sulla metafase il sistema mostra il numero preciso del cromosoma. Fig.3.12: Visualizzazione della Lista dei fluorocromi Negli ideogrammi il tasto di sinistra mostra l etichetta della banda se si passa sopra all immagine. Digitando il tasto di sinistra l etichetta verrà assegnata con possibilità di trasferimento sul collage. Fig.3.13: Posizionamento della banda Nella stampa durante la creazione di un referto stampa, se scegliamo nuova immagine con il tasto si sinistra premuto (sul foglio di stampa) è possibile un immagine di una dimensione specifica. Fig.3.14: Definizione della dimensione di un immagine sulla stampa Sempre nel referto stampa il tasto sinistro si utilizza per inserire un testo specifico. 3-7.

20 3.2.3 Il tasto destro del mouse Generalmente il tasto di destra del mouse serve per terminare operazioni iniziate con quello di sinistra. 1. Se abbiamo ingrandito l immagine col tasto centrale possiamo muoverci lungo l area digitando il tasto di destra più volte. 2. Il tasto destro serve per terminare la definizione delle Regioni d'interesse (ROI). 3. Si utilizza per terminare la divisione di due oggetti. 4. Nell analisi visiva si utilizza per assegnare il numero di coppia d'appartenenza. 5. Nella conta per eliminare dalla conta un cromosoma. 6. Durante il taglio semiautomatico per posizionare ed iniziare tale operazione. 7. Nella galleria immagini per visualizzare a dimensioni superiori una data immagine. 3-8

21 Genikon 3.3 Gestione degli utenti (utilizzatori) Gli utenti di Genikon sono definiti scegliendo la voce Gestione utenti dal menù File. N.B.: l utilizzo di questa funzione è permesso solo all amministratore del sistema. Si apre la finestra di Fig.3.15 mediante cui è possibile creare un nuovo utilizzatore. Fig. 3.15: Gestione utenti Premendo il tasto nuovo è possibile creare un ulteriore profilo. Riempire la casella Nome utente con il nome dell utilizzatore. E consigliabile assegnare una password ad ogni utente, in modo da controllare gli accessi (questa possibilità è utile in particolare nel caso di un sistema di rete): riempire la casella Password con una parola chiave (per conferma, la chiave deve essere ripetuta nella casella Conferma password ). Selezionare i permessi concessi al nuovo utente. Premere il bottone di conferma per creare il nuovo profilo, oppure chiudere la finestra con la in alto a destra. 3-9

22 Fig. 3.16: Nuovo utente Per eliminare un utente definito in precedenza è sufficiente selezionarlo e digitare elimina. Per modificare la password di un utente, oppure per assegnarne una all amministratore, selezionare l utente dalla lista inserire la vecchia password (se esistente) riempire la casella Password con una parola chiave (per conferma, la parola chiave deve essere ripetuta nella casella Conferma password ). Fig. 3.17: Modifica della password 3.4 Chiusura del programma Il programma si chiude tramite la voce Uscita del menù File, oppure con la in alto a destra. 3-10

23 Genikon 4 Ambiente principale 4.1 Gestione dei casi La schermata principale di Genikon consente di gestire i casi e di analizzare il contenuto dei dati e delle immagini. Sulla parte alta troviamo la Barra strumenti principale attraverso la quale, oltre ad accedere ai vari ambienti di Genikon, possiamo utilizzare funzioni di lavoro per gestire periferiche o connessioni con altre stazioni di lavoro: Fig. 4.1: Barra strumenti della finestra principale Gestione Archivio dati ed immagini Ambiente d'acquisizione Acquisizione Spot Ambiente d'elaborazione Fusione di cromosomi Analisi visiva e conta 4-1

24 Ricerca automatica delle metafasi Menu di Stampa Menu di Stampa veloce Macroroutine Menu Opzioni Associazione tra tasti della tastiera e funzioni toolbar Sotto alla barra principale lo schermo si suddivide in varie parti: Caso corrente, Scheda paziente, Elenco dei vetrini, Elenco delle cellule, Galleria delle Immagini Caso corrente Fig. 4. 2: Caso corrente Mostra quale caso è stato selezionato e quindi quello sul quale stiamo lavorando. E da questa finestra che possiamo selezionare un altro caso per aprirlo ed eventualmente modificarlo. I casi sono quelli presenti sull hard disk del sistema ed è possibile: Scorrerli uno alla volta in avanti e indietro ; 4-2

25 Genikon Andare in fondo alla lista ; Posizionarsi all inizio della lista. L indicatore mostra il numero del caso rispetto al totale (terzo caso su un totale di 10), l icona indica se il caso è libero (colorazione verde) oppure se è aperto da un altro utente su di un altra stazione (colorazione rossa) oppure se è archiviato su unità rimovibile (colorazione blu) Mostra la lista dei casi Si tratta di una funzione ON/OFF che si attiva o disattiva con un click del mouse sul tasto. Il sistema mostra la lista dei casi in ordine alfa-numerico; selezionando un caso con il mouse (tasto di sinistra) viene chiuso il caso precedente e si apre quello scelto. Fig.4.3: Elenco dei casi presenti sull hard disk I casi presenti sull hard disk sono visualizzati premendo il pulsante ; il caso attivo è evidenziato in blu, i casi trasferiti su supporti rimovibili sono identificabili premendo il 4-3

26 pulsante:. La selezione contemporanea delle due icone e consente di avere una visione completa dei casi presenti sul disco rigido e su rimovibile. Digitando nuovamente l icona, scompare la lista e appare nuovamente la scheda del paziente. L ultima funzione di questo menu consente di eseguire la stampa dei nomi dei casi presenti sull hard disk Stampa dati anagrafici dei casi Se lo desideriamo possiamo anche stampare la lista dei nomi dei casi e dei dati associti ai casi selezionati se preceentemente abbiamo selezionato un anagrafica Per accedere a tale selezione prima di digitare la stampa selezioniamo la voce Importa anagrafica come indicato in Fig. 4.4: Fig.4.4: Esportazione anagrafica/stampa Il sistema apre il seguente sottomenu mediante il quale possiamo selezionare le voci dei dati che desideriamo stampare associate al nostro/i caso/i. Fig.4.5: Selezione dei casi e voci dell anagrafca per stampa 4-4

27 Genikon Selezioniamo i casi col tatso di sinistra ed inviamoli mediante la freccia sulla parte dx. Selezioniamo con un check le voci che desideriamo stampare della anagrafica. Se ora utilizziamo l icona di stampa con l anteprima: Il sistema mostra i dati ed i casi prima dell eventuale stampa Fig.4.6: Anteprima di stampa Creazione di un nuovo caso Premendo l icona si apre una finestra nella quale dobbiamo introdurre il nome del caso. E possibile introdurre fino a 50 caratteri alfanumerici. Una volta digitato il nome dobbiamo premere sul tasto di accettazione. Fig. 4.7: Creazione nuovo caso 4-5

28 Nel caso in cui il nome del caso sia già presente ell nostro sistema il sistema avverte con il seguente messaggio: Fig. 4.8 Nome del caso già presente Esiste anche la possibilità di verificare se oltre ad un caso con lo stesso nome ma anche con lo stesso nome del paziente o che presenti un altra qualsiasi voce nell anagrafica identica è presente nel sistem. Per utilizzare questa possibilità prima creiamo il nome del nuovo caso.digitiamo poi l icona scheda paziente, il sistema mostra il seguente menu. Fig. 4.9 Controllo dati già presenti Introduciamo ora i dati da controllare e digitiamo la seguente icona, per esempio il nome Rossi: Se un altro caso con il nome Rossi esiste il sistema lo mostra insieme a quelo nuovo credato ((test123 nel caso nostro) 4-6

29 Genikon Fig Duplicazione nome del paziente La stessa operazione effettuata sul nome del paziente può essere effettuata su una qualsiasi altra voce dell anagrafica Associazione immagini al caso Nel menu precedente è inoltre presente un altra icona che consente invece di associare al caso creato immagini provenienti da fuori.: Utilizzando questa funzione si presenta un ulteriore Menu di visualizzazione delle immagini associate o per associare immagini a quel particolare caso: Fig Visualizzazione immagini associate al caso Per associare nuove immagini andiamo a caricarle da dove sono state eventualmente salvate(i formati accettati sono TIFF,Jpeg, Bmp. 4-7

30 Possiamo anche salvare le immagini oppure cancellare immagini associate precedentemente Modifica del nome del caso Selezioniamo il caso e nel menù Archivio (in alto a sinistra) scegliere la voce Modifica nome del caso, inseriamo il nuovo nome, automaticamente sarà variato Eliminazione di un caso L eliminazione del caso corrente avviene per mezzo del tasto:. N.B.: Con questa operazione cancelliamo tutto il caso ed il suo contenuto in maniera irreversibile; è buona norma quindi assicurarsi che non desideriamo più il caso in maniera definitiva, selezionando la forbice il sistema comunque invia un messaggio di attenzione prima di procedere all eliminazione definitiva Ricerca di un caso Prima di effettuare una ricerca è necessario impostare un criterio. Premendo il Tasto compare la lista dei campi dell archivio con le scritte in blu. In ogni spazio dedicato ai dati relativi alla scheda paziente, possiamo introdurre delle chiavi di ricerca per ritrovare ed eventualmente rianalizzare dei casi analizzati in precedenza. E sufficiente inserire le voci negli spazi specifici del database per definire le chiavi di ricerca. La barra per la gestione dei casi si integra con queste nuove icone: : serve per cancellare le chiavi inserite; : tasto di tipo ON/OFF che permette di includere/escludere i casi esportati su unità rimovibile; : tasto di tipo ON/OFF consente di includere/escludere i casi importati da unità rimovibile. Premere il tasto per eseguire la ricerca (rimane schiacciato: ON). Il sistema seleziona i casi in base alle chiavi che sono state immesse. Le chiavi possono essere parziali mediante l impiego del carattere speciale % (se per esempio abbiamo bisogno di ricercare casi con 47,+21 e vogliamo ricercare tutti i casi 4-8

31 Genikon +21, dobbiamo introdurre nel campo dove è stata immessa tale informazione :%+21%; il sistema mostra tutti i casi con tale informazione). Se osserviamo la lista dei casi saranno presenti solo quelli che presentano le chiavi di ricerca che abbiamo appena inserito; se è presente un solo caso con quelle caratteristiche il sistema lo apre direttamente. Per terminare, premere nuovamente il tasto inserite resteranno a disposizione per il futuro. (ritorna normale: OFF). Le chiavi di ricerca Scheda paziente (scheda esame). Fig.4.12: La scheda paziente La scheda paziente consente di introdurre tutte le informazioni relative al paziente ed all esame in corso. La struttura della scheda si crea durante l installazione del sistema, utilizzando un programma esterno all applicativo di Genikon che consente di soddisfare perfettamente le esigenze del laboratorio. Con questo programma i tecnici Nikon definiscono le intestazioni, il numero delle caselle e le dimensioni, per riflettere in pieno quelle del referto abituale. E buona norma creare un archivio, all inizio durante l installazione del sistema, per poi non dovere apporre nuove modifiche che potrebbero causare problemi in seguito quando vogliamo imporre dei criteri di ricerca tra i nostri casi. Indipendentemente dal numero, intestazione e dimensioni delle caselle esistono due differenti tipi di caselle. Un tipo fisso, nel senso che per ogni scheda paziente dobbiamo introdurre dei dati variabili. Un secondo tipo definito tabella che presenta sulla destra i simboli sotto elencati: 4-9

32 Apre una lista di informazioni frequenti (create in precedenza dall operatore) ed uguali per casi diversi. La lista può per esempio contenere il tipo di campione: liquido amniotico, sangue periferico, midollo osseo, tessuto; nel momento in cui introduciamo i dati di una specifica scheda paziente sarà sufficiente aprire la lista e selezionare la voce appropriata senza doverla riscrivere. Apre il menù per creare un nuovo elemento della lista: Fig.4.13: Codifica dei valori possibili per i campi "a scelta" Consente di creare una nuova voce per il campo. Consente di modificare una voce introdotta precedentemente. Cancella la voce selezionata. La scheda paziente può essere costituita da più fogli se le informazioni da inserire per ogni caso sono numerose. Con completo immettiamo un informazione che consentirà in seguito di filtrare i casi quando dovremo trasferirli su un altro supporto, nel caso in cui si desideri trasferire solo quelli completi (finiti). N.B. Attenzione all introduzione dei dati sul campo data. Se infatti la data non è introdotta con la barra come 15/12/74 ma con 15\12\74 non viene accettata da sistema e non consente il salvataggio dei dati del caso Fig.4.14: Errore nell introduzione dati data 4-10

33 Genikon Elenco dei vetrini Fig.4.158: Rappresentazione dei vetrini e delle Composizioni E possibile analizzare il singolo, o tutti i vetrini in contemporanea. Se con il mouse selezioniamo un solo vetrino automaticamente sono mostrate le cellule appartenenti a quel vetrino. Selezionando Tutti i vetrini, si aprono tutte le cellule appartenenti a tutti i vetrini. Ogni vetrino è caratterizzato da un colore specifico che circoscrive anche le immagini delle cellule rappresentate sulla destrasecondo il vetrino di appartenenza. Quando siamo in modalità Tutti i vetrini, le cellule vengono etichettate secondo lo schema [vx; cx], dove vx è il nome del vetrino a cui appartiene al cellula cx. E possibile assegnare un nome al vetrino selezionato, diverso da quello proposto, semplicemente facendo click sulla scritta che compare sotto; la scritta cambierà aspetto, indicando che n'è possibile la modifica. Inserire ora il nuovo testo. Il tasto serve per ed aggiungere un nuovo vetrino alla lista. La lista può contenere al massimo dieci vetrini. Il tasto consente di eliminare il vetrino selezionato e tutte le sue cellule. N.B.: l operazione di eliminazione di un vetrino implica la cancellazione di tutte le immagini di tutte le cellule di quel vetrino; l operazione è irreversibile Elenco delle cellule Fig.4.16: Rappresentazione grafica delle cellule La modalità di selezione è identica a quella del vetrino se seleziono con il mouse una cellula a destra sulla galleria si mostra solo quella cellula con tutte le immagini ad essa appartenenti (metafase, cariotipo, fusione). 4-11

34 Fig.4.17 Barra di scorrimento immagini nella modalità "Singola cellula" Selezionando invece Tutte le cellule si osservano tutte le cellule appartenenti al vetrino in esame. Fig.4.18: Barra di scorrimento immagini nella modalità "Tutte le cellule" Poichè è attiva la funzione Tutti i vetrini il sistema mostrerà tutte le cellule appartenenti a tutti i vetrini di quel dato esame o caso. Fig.4.19: Barra di scorrimento immagini nella modalità Tutti i vetrini e Tutte le cellule Il passaggio rapido dalla modalità Singola cellula a Tutte le cellule si può effettuare tramite il tasto, mentre apre l elenco delle cellule disponibili per il vetrino selezionato, dove è possibile passare alla cellula che più ci interessa (Fig.4.12). Questa soluzione è molto utile quando siamo in altri ambienti dove non si ha visione diretta della struttura vetrini-cellule. Fig.4.20: Scelta della cellula dall'anteprima delle immagini Il passaggio rapido dalla modalità Singolo vetrino a Tutti i vetrini e l accesso all elenco dei vetrini disponibili per il caso selezionato, avviene in modo analogo a quanto descritto per la gestione delle cellule. L operazione di modifica del nome d'ogni cellula è analoga a quella per i vetrini. E possibile eliminare le cellule semplicemente premendo il bottone dopo aver selezionato la cellula da eliminare. 4-12

35 Genikon N.B.: anche in questo caso l operazione di eliminazione di una cellula è irreversibile. L eliminazione di una cellula comporta la cancellazione di tutte le immagini di quella cellula Immagini Sulla parte destra dello schermo sono visualizzate le immagini. Ogni immagine può raffigurare una metafase, un cariotipo, una composizione, una fusione marcati ognuno con una sigla specifica (in basso a destra): M metafase; M+F metafase con fusione K cariotipo; C immagine composizione ; F immagine di fusione; FH immagine FISH (risultante dalla combinazione di fluorocromi); CGH immagine CGH (immagine ratio in falsi colori) mfish immagine Multiplex Fish xxx fluorocromo: indicato con le prime tre lettere del nome se la lunghezza supera quattro lettere (p. es.: DAPI - DAPI,FITC FITC, TRI. etc ). La dicitura sotto ogni immagine ne indica la posizione, secondo lo schema [vx; cx], dove vx è il nome del vetrino e cx è il nome della cellula. Inoltre se le cellule appartengono al medesimo vetrino sono identificate da una barra in alto nella finestra del medesimo colore (in modalità Tutte le cellule ). In basso, il sistema informa se stiamo lavorando con singola cellula o con tutte le cellule. Sempre in basso troviamo delle frecce che consentono di scorrere avanti ed indietro le immagini della cellula oppure in fondo o all inizio della lista. Digitando il tasto dx del mouse su un anteprima di un immagine, compare un menù che permette principalmente di visualizzare in grande l immagine, di eliminare un immagine, e di eseguire nuovamente la soglia. Altre funzioni sono disponibili a seconda del tipo di immagine che abbiamo selezionato. Importazione d'immagini 4-13

36 Sempre in questa sezione dello schermo troviamo l icona che consente di importare immagini esterne a Genikon:.Con questa funzione è possibile leggere ed eventualmente rianalizzare immagini in diversi formati (TIFF, JPeg, Bitmap, TGA), richiamati da altri sistemi. Il sistema apre la lista dei file che si desiderano importare; dopo avere scelto il nome del file è necessario sogliare per poi immettere nella nostra galleria all interno di un caso la nuova immagine. L immagine importata genera una nuova cellula. Per importare invece immagini in una cellula già esistente,utilizzare la seguente icona :. 4.2 Trasferimento immagini da un vetrino (caso) all altro Apriamo il caso sul quale sono selezionate le immagini acquisite in posizione errata digitiamo poi la seconda delle icone che consente di salvare l immagine corrente,possiamo memorizzarla temporaneamente dove desideriamo anche sul desktop Fig.4.22 Memorizzazione di una copia dell immagine da trasferire Posizioniamoci ora sul vetrino o sul nuovo caso dove desideriamo trasferire l immagine e digitiamo l icona di importazione il sistema si posiziona dove l imagine è stata salvata. 4-14

37 Genikon N.B. è bee ricordarsi di cancellare l immagine dall vetrino/caso precedente perché abbiamo un duplicato. 4.3 Unità Rimovibili (CDROM-DVDRAM-DISCHI OTTICI ed altri) E possibile esportareed archiviare su unità rimovibili i casi che non vengono più utilizzati ma che devono essere mantenuti nel caso in cui desideriamo rianalizzarli in un secondo tempo. Esistono due diverse modalità di trasferimento dei casi molto diverse tra loro: a- Archiviazione _ b- Esportazione A- Archiviazione trasferisce il caso su una qualsiasi periferica ed automaticamente lo cancella dall archivio. B-Esportazione copia il caso su una qualsiasi periferica ma non lo cancella Definizione delle unità rimovibili Qualsiasi procedura si desideri utilizzare è in ogni caso necessario definire l unità sulla quale si desidera trasferire i casi o il caso. Per prima cosa bisogna tenere presente che le unità codificate mediante le utility del menu seguente, sono valide per l archivio al quale siamo correttamente collegati. Ciò significa che in una configurazione di rete, per la quale sia stata preventivamente definita lamacchina su cui risiede l Archivio di lavoro, è possibile, da qual si voglia macchina CLIENT, codificare e dunque far conoscere all ARCHIVIO CENTRALE, unità removibili residenti sulle macchine CLIENT. In Fig.4.13 si illustra la situazione sopra descritta: Fig.4.23: Gestione unità rimovibili La macchina di lavoro, nell esempio in esame, è GENIKON2 ed in questo caso anche l archivio di lavoro è GENIKON2 mentre le unità disponibili sono raffigurate sotto la voce 4-15

38 Unità locale. Occorre definire una volta il tipo d'unità rimovibili che si hanno a disposizione. Per definire una nuova unità rimovibile, digitare unità rimovibili. nella sezione Codifica Fig.4.24 Creazione nuova unità Specificare l unità locale tra una di quelle proposte; se si desidera, inserire una breve descrizione sul supporto. Nella casella Nome inserire un'etichetta identificativa per il supporto scelto. Per confermare, premere (l unità viene codificata e viene inserita nell elenco). Alle successive riaperture della finestra per la gestione delle unità rimovibili, le unità codificate saranno elencate nella casella Unità codificate Trasferimento dei casi su unità rimovibile. E anche possibile eliminare un unità (se ancora non sono stati archiviati casi) o modificare la descrizione di un unità, con le icone accanto a quella della nuova creazione. Modifica Eliminazione di un unità rimovibile Per chiudere invece il menu è sufficiente utilizzare la funzione seguente Nel caso precedente abbiamo introdotto unità USB sul GENIKON2. N.B. Può accadere che in fase di creazione il sistema visualizzi un Messaggio informativo in cui afferma l impossibilità di codifica. Questo accade poiché il sistema associa in automatico un nome di condivisione all unità definita. Il nome di condivisione è un numero a partire dalla data ed ora corrente. L evento descritto avviene se e solo se si è definito due unità in un tempo inferiore ad un minuto. L univocità del nome di condivisione impone, infatti, una differenza di nome. 4-16

39 Genikon Fig.4.25 Creazione di due unità Nel caso in fig.4.15 abbiamo l archivio residente su XPGE il nostro computer client è DEBORAXP ed abbiamo disponibile in locale l unità DVDRAM e CDRW che mostrano correttamente un nome di condivisione differente. A questo punto possiamo decidere se Esportare od Archiviare il caso. Se scegliamo la modalità d archiviazione di un caso: Archiviazione di un caso Fig.4.26Archiviazione di un caso Per prima cosa teniamo presente che quando siamo in archiviazione esiste sempre una sorgente che è l archivio di lavoro, ed una di Destinazione, cioè una cartuccia su unità removibile. Nell esempio in fig.4.16 l archivio di lavoro è GENIKON2 e l unità ad esso selezionata è un USB. Poichè l unità è attiva oppure se si tratta di un magneto ottico e la cartuccia è inserita il sistema recupera in automatico il nome della cartuccia e l elenco dei casi presenti sulla stessa. Scegliamo dunque l unità di archiviazione e selezioniamo i casi che decidiamo trasferire. Per selezionare i casi possiamo digitare il tasto sx del mouse sul singolo nome e con il tasto CTRL possiamo eseguire una selezione multipla a salti, oppure con le frecce nere possiamo decidere di trasferirli tutti in una sola volta Fig.4.27 Selezione dei casi ed informazione di occupazione di memoria 4-17

40 per trasferire solo i casi selezionati. Una volta selezionati i casi e trasferiti sulla destra, il sistema informa su quanto occupano in memoria e quanto spazio è disponibile sull unità di archiviazione: Al termine di queste selezioni utilizziamo il tasto d assenso il sistema procederà al trasferimento al termine, comunica l esito. Fig.4.28 Trasferimento in atto del caso Fig Esito di trasferimento avvenuto Chiusura del form BROWSER. La pressione del pulsante abilita un interfaccia di selezione mediante cui è possibile scegliere una qualche unità rimovibile di rete NON codificata e dunque NON nota all ARCHIVIO DI LAVORO. Quest UTILITY può essere utile nei casi di temporanea indisponibilità (esempio guasto) delle unità usualmente impiegate dall ARCHIVIO e correttamente codificate. Pulsante di REFRESH per aggiornare la lista dei casi su cartuccia. Nell ipotesi in cui il sistema incorra in errori d archiviazione è fornito Nell ipotesi in cui il sistema incorra in errori d ARCHIVIAZIONE è fornita all utente, sempre e in ogni modo, una messaggistica indicante il tipo di problema incontrato: 4-18

41 Genikon Figura 4.30 Errori incontrati in archiviazione Al termine del processo d archiviazione il sistema abilita in automatico un FORM che indica quali casi siano stati correttamente archiviati e quali no: Figura 4.31 Riepilogo archiviazione OSSERVAZIONE: La rimozione dei casi da archivio è sempre subordinata al favorevole esito di una serie di controlli di match fra il caso in archivio e la copia eseguita sulla cartuccia. Nell ipotesi di eventi non prevedibili né controllabili quale la rottura del dispositivo di archiviazione durante il trasferimento o il suo spegnimento (cessazione dell alimentazione di rete), il sistema dovrebbe (sulla base della progettazione eseguita e dei test realizzati) garantire una preservazione dei dati o al più una duplicazione degli stessi all interno della cartuccia senza che i casi sorgenti risultino archiviati per il data base. E opportuno precisare che nella cartuccia di destinazione, al termine dell ARCHIVIAZIONE casi, il sistema trasferisce una copia del MODELLO d ARCHIVIO corrente. Il modello in oggetto si distingue da quello salvabile mediante PERSARC, poiché il suo impiego permette il recupero delle TABELLE costruite dall utente. Il nome associato al modello coincide con quello posseduto dall ARCHIVIO. Nell esempio corrente il file si chiamerebbe: XPGE.gkm La chiusura del FORM d ARCHIVIAZIONE comporta un aggiornamento dell elenco casi attiva nell ambiente principale. Per una corretta procedura d ARCHIVIAZIONE sono da applicarsi le seguenti linee guida: 4-19

42 1. Eseguire l ARCHIVIAZIONE di un caso solo quando quest ultimo può considerarsi ragionevolmente concluso. 2. Eseguire sempre e in ogni modo un ESPORTAZIONE dei casi che s intende archiviare. L operazione di COPIA dei dati che si stanno per rimuovere dall ARCHIVIO salvaguarda l utente finale da problemi di rottura, guasto, smagnetizzazione o altro del supporto fisico (cartuccia) impiegato per l ARCHIVIAZIONE. 3. Durante la fase di ARCHIVIAZIONE è vivamente CONSIGLIATO sospendere le attività lavorative svolte dai CLIENT sull archivio server. 4. Eseguire un ARCHIVIAZIONE a step, ovvero trasferire sottogruppi di casi (esempio casi per volta) al fine di avere un controllo più diretto sull operazione in esecuzione. I casi trasferiti su unità rimovibile possono essere visti nell elenco dei casi premendo il tasto. N.B.: i casi che vengono trasferiti su un unità rimovibili vengono fisicamente spostati, quindi la loro consultazione è impossibile se non si inserisce il supporto nell unità senza supporto è solo possibile consultare i dati dell archivio ma non le immagini Ripristino dei casi da Unità rimovibile Per riportare nell archivio centrale un caso trasferito su un supporto rimovibile, occorre scegliere la voce Trasferisci caso da UR del menù File dell ambiente principale di Genikon. Sarà chiesto di inserire un supporto specifico (in base all etichetta che abbiamo dato in fase di trasferimento). Fig.4.32 Ripristino casi da Unità rimovibile Il sistema mostra a sinistra i casi presenti sulla cartuccia; anche in questo caso possiamo selezionarli ed accettare. Il tasto seguente: Consente di visualizzare differenti periferiche sulle quali sono stati archiviati casi: 4-20

43 Genikon Fig.4.33 Visualizzazione delle periferiche disponibili Come per l archiviazione il sistema al termine del ripristino conferma se avvenuto positivamente il trasferimento dal supporto all hard disk Esportazione di un caso Fig.4.34 Termine del trasferimento Nel caso in cui desideriamo invece copiare senza cancellare dall hard disk un caso scegliamo la voce Esportazione di un caso e procediamo con il seguente menu: Fig.4.35 Menu d esportazione casi Il menu è molto simile a quello d archiviazione e la selezione dei casi avviene come l archiviazione. Per default il sistema seleziona Caso corrente se invece desideriamo selezionare altri casi dobbiamo deselezionare l icona di caso corrente ed eseguire selezioni multiple seguendo la stessa modalità dell archiviazione. 4-21

44 4.3.5 Importazione di casi da Archiviazione Fig.4.36 Importazione casi I casi possono essere importati da Esportazione da Archiviazione o ripresi da un archivio specifico. o Esportati: con tale termine ci si riferisce a casi preventivamente esportati da altro ARCHIVIO. I casi sono in formato compresso con estensione GXP. o Archiviati/altro : con tale termine ci si riferisce a casi presenti su cartuccia poiché preventivamente archiviati oppure presenti in una qualche FOLDER locale o di rete. I casi in oggetto sono delle semplici copie delle cartelle indicizzate recuperabili all interno della cartella ARCHIVE. o Da Archivio: con tale termine ci si riferisce a casi attualmente presenti e attivi su un ARCHIVIO di rete. OSSERVAZIONE: E lecito supporre che le ultime due forme di recupero dati siano riservate all assistenza tecnica piuttosto che all utente finale. Nel caso in cui siano ripresi da un esportazione semplicemente devono essere selezionati con la solita modalità (singola multipla o in totale con le frecce) seguendo al termine il tasto d assenso. Se invece sono ripresi da archivio automaticamente si abilita una nuova funzione che consente di associare o no dati. Nel caso in cui i casi provengano da un archivio che ha campi diversi da quello in possesso. Fig.4.37 Selezione per associazione di campi 4-22

45 Genikon Il trasferimento di uno o più casi nella lista di selezione, abilita in automatico il pulsante di creazione MAPPA. La pressione del pulsante in oggetto attiva la sezione di definizione MAPPA. Nell ipotesi in cui i casi selezionati e presenti in lista siano stati creati a partire dallo stesso modello d archivio residente sul DATA BASE di destinazione, il sistema visualizza il recupero dell anagrafica. Nell esempio di figura 4.24 i modelli d archivio sono totalmente discordanti ciò significa che in automatico, è eseguito il recupero del solo nome caso: Fig Correlazione tra archivi Nella colonna di sinistra (VOCI ARCHIVIO) sono elencate le voci del modello d archivio corrente. Nella colonna di destra (DATI ANAGRAFICI) sono visualizzati i dati del caso evidenziato all interno della lista di selezione e associati in modo automatico. L utente, interessato al recupero di tutta l anagrafica, può a questo punto procedere con la costruzione dei LINK: Un semplice CLICK eseguito sulla colonna di destra in corrispondenza della voce di ARCHIVIO da associare, abilita una COMBO di selezione al cui interno sono presenti TUTTI i dati anagrafici associati al caso che si desidera importare: Fig Rappresentazione associazione La selezione di una delle voci in elenco abilita il LINK fra quella VOCE d ARCHIVIO e il DATO ANAGRAFICO. La VOCE D ARCHIVIO associata è visualizzata in grassetto. Nell ipotesi in cui sia assente, fra quelli in lista, il dato anagrafico d interesse, si annulla il tentativo d associazione scegliendo l ultima voce d elenco vuota. 4-23

46 Fig.4.40 Associazione Dati archivio a casi Le associazioni eseguite restano attive fino a che il FORM non viene chiuso. La selezione dei casi successivi presenti in lista consente di testare la veridicità dei LINK eseguiti ed eventualmente di modificarle e/o rimuoverle. Per una pulizia completa di tutte le associazioni eseguite premere il pulsante, per il salvataggio della mappa creata premere il pulsante ed infine per il caricamento di una mappa precedentemente costruita premere il pulsante. Queste ultime due operazioni hanno senso se si desidera importare i casi in tempi diversi (chiusura e riapertura del FORM), senza perdere il lavoro di LINK eseguito. E opportuno precisare che i dati anagrafici del caso sorgente restano sempre e in ogni modo fruibili per il caso importato, indipendentemente dalla costruzione o meno della mappa di LINK. I dati sono accessibili nell ambiente principale dell ARCHIVIO nel momento in cui si seleziona un caso importato, si accede all anagrafica e quindi si preme il pulsante Fig Possibile successiva importazione dati Per il significato dei pulsanti fare riferimento a quanto detto per i precedenti FORM. L unica eccezione è rappresentata dal pulsante che in questo contesto avvia l operazione d IMPORTAZIONE. In quest operazione, durante la fase di trasferimento, 4-24

47 Genikon è attivo il FORM di progressione precedentemente descritto ed il FORM riepilogativo finale: Fig.4.42 Esito importazione casi La chiusura del FORM d IMPORTAZIONE comporta un aggiornamento della lista casi attiva nell ambiente principale. Generalmente questa funzione si utilizza per eseguire assistenza poiché normalmente i casi hanno lo stesso archivio di quelli trasferiti sul supporto. Esiste un ulteriore possibilità di ripristinare casi da un altro archivio che risiede su un supporto diverso e magari su un altra macchina in questo caso utilizzo l ultima funzione di ripristino casi da archivio ed il sistema chiede su quale postazione è collocato tale archivio Fig.4.43 Selezione di una nuova postazione per trasferire casi 4.4 Gestione immagini Sulla schermata iniziale di Genikon la gestione delle immagini avviene principalmente dalla galleria. Automaticamente quando il caso è aperto il sistema mostra la prima immagine del primo vetrino. Già abbiamo visto che è possibile selezionare una sola cellula (in questo caso il sistema mostra tutti i dettagli relativi a questa cellula) oppure se siamo nella modalità tutte le cellule mostra tutte le cellule appartenenti a quelle di uno o di tutti i vetrini. Se desideriamo vedere a maggiore ingrandimento le cellule della galleria è sufficiente digitare il tasto di destra sulla cellula e selezionare VISUALIZZA: Fig.4.44 Galleria immagini 4-25

48 Se vogliamo richiamare in sequenza le immagini digitiamo sulla freccia della tastiera oppure se ne desideriamo un immagine specifica digitiamo il tasto di sinistra del mouse sull immagine piccola della galleria. La stessa operazione è possible a grande schermo. In quest ultimo caso saranno operative solo le frecce da tastiera. Ricordiamo che da questa modalità si accede anche alla possibilità di esportare l immagine di Genikon come Tiff,Jpeg,Bmp su un qualsiasi supporto. Il sistema offre 2 modalità di salvataggio con e senza TXT. Naturalmente nel caso di cariotipo è bene salvare con Txt per esportare anche il numero relativo alle coppie di omologhi. Fig.4.45 Salvataggio immagini inn formati diversi Cliccando con il tasto di dx sull immagine è possibile attivare altre 2 funzioni: a) Introduzione di nuovi dati sulla singola immagine ed al nuovo thresholding dell immagine: Fig.4.46 Funzioni su singola cellula a)modifica informazioni aggiuntive: 4-26

49 Genikon Fig.4.47 Introduzione informazioni aggiuntive Consente, nel caso in cui sia stato introdotta ON la voce di introduzione di informazione su singola cellula. b)se invece digitiamo su singola cellula di modificare il thresholding, potremo nuovamente cambiare la sottrazione del fondo già effettuata in precedenza con il processo di acquisizione. A questo livello se modifichiamo la sogliatura ad una metafase collegata ad un cariotipo il sistema cancellerà il cariotipo a modifica della sogliatura. Se sempre dalla galleria digitiamo su singola cellula il tasto dx sull immagine del cariotipo si aggiunge una nuva voce relativa all eliminazione della sola immagine del cariotipo Fig.4.48 Eliminazione immagine del cariotipo 4.5 Gestione immagini Sempre nel menu di gestione del caso sulla galleria delle immagini il simbolo seguente consente di selezionare o no le informazioni sottostanti alla cellla. 4-27

50 Se Abbiamo selezionato la funzione sotto all immagine compaiono le informazioni Fig.4.49 Informazioni sul vetrino e tipo di cellula Fig.4.50 Immagine cellula senza informazioni L opportunità di mantenere le informazioni sulla parte bassa della cellula si ritrova anche nel menu di processazione. In tale enu se l icona è selezionata in basso a destra si vedono o non si vedono il numero di conta delle strutture presenti sull immagine. 4-28

51 Genikon 5 Acquisizione immagini Per acquisire immagini, si seleziona dalla Toolbar Principale la seguente icona: Fig.5.1: Menu di Acquisizione Dall ambiente di acquisizione possiamo comunque visualizzare le informazioni relative al caso in esame: il tasto permette di visualizzare l elenco dei casi e la scheda dati per il caso in corso (Fig.5.2). Il tasto Fig.5.2: Visualizzazione dell'elenco dei casi in fase d acquisizione mostra i vetrini e le cellule del caso in corso (Fig.5.3); Fig.5.3: Visualizzazione degli elenchi vetrini e cellule in fase di acquisizione 5-29

52 mostra le immagini delle cellule acquisite (Fig.5.4): se stiamo acquisendo la prima cellula tutte le finestre saranno vuote (nere). Fig. 5.4: Visualizzazione delle immagini in fase di acquisizione L ambiente di acquisizione mostra 11 finestre dedicate alla visualizzazione delle immagini; le 2 (a minore dimensione) + 1 (a dimensione maggiore) finestre sono utilizzate per la gestione dell immagine durante la fase di acquisizione e successivamente in quella di elaborazione. La finestra più grande, mostra l immagine della metafase sia live che memorizzata e consente la perfetta messa a punto del fuoco e della luminosità dell immagine. Le due finestre più piccole in basso servono per collocare eventuali fuse, collage, cariotipi. Le otto finestre sulla sinistra consentono di osservare a piccolo ingrandimento tutte le cellule associate a quel dato vetrino. Per scambiare un immagine con l altra facciamo click con il tasto di sinistra del mouse sull immagine desiderata automaticamente le immagini saranno invertite. Durante questa fase è possibile osservare le immagini della galleria a maggiore ingrandimento se digitiamo il tasto di destra sull immagine prescelta. 5.1 Come si fotografano nuove cellule Le due icone che seguono consentono di passare a fotografare immagini. L icona consente di acquisire una nuova cellula, mentre cattura una cellula già fotografata nel caso in cui si sia errata la procedura precedentemente o nel caso in cui si desideri aggiungere delle fusioni a cellule precedentemente acquisite. Se selezioniamo la prima icona avremo sulla finestra maggiore l immagine live corrispondente alla metafase che abbiamo posizionato sotto al microscopio a 100x. Le altre icone del menu d acquisizione hanno funzioni diverse. 5-30

53 Genikon E una funzione di undo in altre parole di annullo dell ultima operazione eseguita. Consente di effettuare il salvataggio della cellula, in ogni modo il sistema salva sempre in automatico l immagine della metafase. Esce dall ambiente d acquisizione. Seleziona l acquisizione con modalità in campo chiaro. Seleziona l acquisizione con modalità in fluorescenza (bande Q/R/DAPI). Seleziona l acquisizione con modalità in FISH. Seleziona l acquisizione con modalità in CGH. Seleziona l acquisizione in Multiplex FISH. Seleziona la ricerca automatica degli spot su nuclei interfasici Prima di passare ad acquisire immagini dobbiamo eseguire un controllo del microscopio. 5.2 Scelta della modalità di lavoro Se lavoriamo in campo chiaro, è buona regola che il microscopio sia correttamente allineato; è dunque necessario eseguire il controllo dell illuminazione secondo il principio di Koheler; controlliamo inoltre che non siano inseriti nel percorso ottico i filtri della fluorescenza; generalmente un filtro che può essere tenuto lungo il percorso è quello DAPI che risulta essere inefficace con il campo chiaro, capita talvolta di non avere più posizioni libere per lavorare in campo chiaro se il microscopio è dotato di tutti gli accessori necessari per la FISH. E invece utile utilizzare un filtro verde, come per la fotografia, che esalta i contrasti dei cromosomi; tale filtro può essere posto sul diaframma di campo del microscopio nel caso in cui non sia stato dato come accessorio fisso nel corpo del microscopio. Dobbiamo assicurarci che almeno il 50% della luce vada alla telecamera oltre che agli oculari. Ciò dipende dal modello di microscopio che abbiamo in dotazione. Alcuni microscopi consentono di vedere in contemporanea agli oculari ed alla telecamera. Altri modelli invece inviano il 100% della luce agli oculari oppure il 100% è inviato alla 5-31

54 telecamera. Assicuriamoci dunque che almeno il 50% vada alla telecamera proprio come si fa normalmente per inviare la luce alla macchina fotografica. Se lavoriamo in fluorescenza è fondamentale che la lampada della fluorescenza sia centrata. Controlliamo inoltre che lungo il percorso ottico sia posizionato il blocchetto di filtri corretto per osservare il fluorocromo (quinacrina o arancio di acridina); anche in questo caso come per il campo chiaro assicuriamoci che almeno il 50% della luce vada alla telecamera. Scegliamo ora la modalità di lavoro: campo chiaro o fluorescenza (la FISH sarà presa in esame successivamente). E fondamentale scegliere la modalità corretta perché se scegliamo fluorescenza e poi lavoriamo in campo chiaro saremo in saturazione se invece lavoriamo in fluorescenza e scegliamo il campo chiaro saremo in assenza o bassa luminosità. 5.3 Setup della telecamera Dopo avere selezionato la modalità di lavoro e con l immagine live della metafase possiamo almeno per la prima volta controllare il Setup della telecamera : per acquisizioni in campo chiaro: Fig.5.5: Regolazioni per Acquisire in campo chiaro per acquisizioni in fluorescenza: Fig.5.6: Set up acquisizione in fluorescenza Se lavoriamo in campo chiaro, potremo gestire la luminosità e il contrasto dell immagine; è l operatore che deve decidere la quantità di luce o di fondo che desidera sull immagine; variando le due regolazioni devo potere ottenere il massimo del contrasto. E sempre bene prima osservare al microscopio con la quantità di luce corretta e l apertura del condensatore corretta secondo il tipo d obiettivo col quale stiamo lavorando 5-32

55 Genikon successivamente, aggiustiamo il sistema mantenendo la stessa quantità di luce in maniera tale da non dovere cambiare ogni volta da microscopio a sistema. In fluorescenza potremo gestire luminosità e contrasto ma a queste due voci si aggiunge la possibilità di integrare (esposizione) la telecamera per consentire di osservare anche fluorescenze molto basse. Alzando il valore d esposizione si osservano strutture anche poco fluorescenti ed è possibile raggiungere ugualmente un ottimo contrasto. I valori fissati dall operatore si possono ottenere anche lavorando sul controllo automatico della telecamera: se selezioniamo regolazione automatica, da ora in poi è il sistema che controlla i valori di contrasto e luminosità e cerca di trovare il massimo del contrasto dell immagine senza intervento dell operatore. Se non desideriamo più tale controllo è sufficiente utilizzare il tasto sinistro del mouse per deselezionare il controllo automatico. In entrambi i casi dobbiamo avere l immagine live sul monitor e naturalmente il percorso della telecamera aperto. Con entrambe le modalità di lavoro (controllo manuale e/o automatico) il sistema presenta una barra di controllo di colore verde (Fig.5.3) che rappresenta la quantità di luce che proviene dal microscopio ed arriva alla telecamera ed indica il contrasto rilevato dal sistema. Fig.5.7: Barra della dinamica del segnale in ingresso Se abbiamo immagini molto scure, la barra verde sarà disposta verso il basso; viceversa, se le immagini sono molto chiare, la barra verde occupa tutto lo spazio. Agendo sulle regolazioni dobbiamo rendere la banda verde più grande possibile, senza però che questa sia troppo vicina ai bordi (si noterà che se la barra oltrepassa il limite superiore, comparirà una tacca rossa in alto; una tacca blu comparirà se è il limite inferiore ad essere oltrepassato). N.B.: Nel caso in cui si lavori con l integrazione della telecamera, è bene cercare di tenere il valore di esposizione il più basso possibile e quindi giocare magari di più con la luminosità poiché tempi alti di integrazione ritardano lo spostamento dell immagine ed anche la messa a fuoco. 5-33

56 Per entrambe le modalità abbiamo comunque l opportunità di eseguire un salvataggio del setup, oppure possiamo richiamare l ultimo salvataggio effettuato. 5.4 Acquisizione di una nuova immagine Apriamo un vecchio caso o creiamo un caso nuovo; entriamo nell ambiente d acquisizione selezioniamo la modalità di lavoro per esempio campo chiaro ; controlliamo il fuoco sul microscopio; controlliamo eventualmente i valori di luce e contrasto. selezioniamo l icona per acquisire l immagine. A questo livello esistono due modi diversi di procedere a seconda se la cellula rientra o no per intero nel campo del microscopio. Tutti i cromosomi sono presenti nella prima immagine memorizzata Possiamo subito premere il tasto per terminare l acquisizione ed eventualmente passare al processo successivo d elaborazione (conta, analisi visiva o separazione dei cromosomi per una successiva cariotipizzazione). L acquisizione è finita possiamo procedere ad acquisire o un altra cellula o ad elaborare l immagine appena digitalizzata. Mancano uno o alcuni cromosomi che sono posti esternamente al campo appena fotografato Dobbiamo procedere come segue: abbiamo già acquisito gran parte di cromosomi; spostiamo sul microscopio al centro del campo i cromosomi esterni; facciamo click nuovamente sull icona per memorizzare la nuova immagine ; se ancora mancano cromosomi possiamo spostarci nuovamente e procedere come ai punti due e tre; Una volta fotografati tutti i (anche se su immagini diverse) possiamo fare click sull icona seguente per terminare la fase d acquisizione. 5-34

57 Genikon Avremo così un immagine principale descritta come metafase, più una certa quantità d immagini definite F1, F2, Fn, secondo quanti frame abbiamo fotografato. 5.5 Acquisizione immagini da telecamere ad alta risoluzione Nel caso in cui sia collegata al sistema una telecamera digitale ad alta risoluzione il sistema lavora in live alla stessa risoluzione del monitore cioè 1024x1280. L alta risoluzione si ottiene con l impiego di telecamere quali: HAMAMATSU ORCA 285 COOLSNAP HESPFIRMA NIKON DS2 MONOCROMATICA RAFFREDDATA è consentito solo in modalità ALTA RISOLUZIONE. Questo significa che sulla chiave hardware del programma GENIKON deve essere attivo il relativo modulo. Il FORM LIVE in modalità ALTA RISOLUZIONE consente una visione d immagine pari a 1280x1024 pixel. Le SCROLLBAR laterali permettono in ogni modo la visione dell intera immagine così come acquisita dalla telecamera d impiego. Fig.5.8 LIVE ad alta risoluzione Al termine dell acquisizione, determinata dalla pressione del pulsante di STOP, si attiva un FORM di SOGLIATURA, l immagine è visualizzata nella classica dimensione 768x576. Per visualizzarla nel suo formato originale è necessario lavorare in modalità GRANDE SCHERMO. 5-35

58 Al LIVE AD ALTA RISOLUZIONE può essere associato l impiego dell' E1000 e/o RUOTA FILTRI, in modo analogo con quanto avveniva nelle precedenti versioni a BASSA RISOLUZIONE. L ingresso nell ambiente LIVE con una modalità di lavoro CGH o MFISH comporta in automatico il caricamento dell ultimo profilo di acquisizione, impiegato e memorizzato sui registri. Per la FISH il caricamento avviene se e solo se l ingresso in LIVE è avvenuto a partire da un vetrino vuoto, altrimenti il sistema carica il profilo associato alla cellula d ingresso per consentirne la sogliatura nuovamente. 5.6 Sottrazione del fondo dalle immagini acquisite Al termine di ogni acquisizione, il sistema esegue in automatico la sottrazione del fondo, o sogliatura, per ogni immagine catturata. Questa fase è molto delicata perché corrisponde alla quantità di background che desideriamo eliminare dalla nostra immagine. E necessario controllare che insieme al fondo non siano eliminate parti appartenenti ai cromosomi. Fig.5.9: Sogliatura delle immagini acquisite (manuale) Sul sistema Genikon esistono diverse modalità di sogliatura più o meno complesse e con diversa efficienza selezionabili dalla voce opzioni della Main Tool Bar 5-36

59 Genikon Fig.5.10: Selezione diverse modalità di sogliature Soglia manuale La prima soglia MANUALE indicata in figura 5.9 è quella che lascia maggiore libero arbitrio all utente. Con tale menu è infatti possibile modificare il contrasto sull imagine non solo abbassando il livello massimo al di sotto di 255 ma anche il minimo sopra 0 Fig.5.11: Selezione diverso contrasto Tale funzione leva il rumore di fondo alzando il livello minimo o schiarisce l immagine abbassando il massimo. Fig.5.12: Aumento del filtro Se invece aumentiamo il valore del filtro (circa 7) aumenterà la differenza dei livelli di grigio determinando ua messa a fuoco migliore dell immagine. La voce luminosità consente di schiarire o scurire l immagine 5-37

60 Fig.5.13: Variazione luminosità L icona seguenete abilita la possibilità di osservare quanto fondo verrà sottratta all immagine. Fig.5.14: Visualizzazione della soglia In questo caso è possibile aumentare o diminuire la sottrazione, muovendo la barra seguente: Fig.5.15: Slider per gestione soglia 5-38

61 Genikon Quando agiamo sulla soglia è anche possibile definire delle ROI disegnando col tasto sx del mouse intorno agli oggetti di interesse ed utilizzare i tasti +e- per aumentare o diminuire la soglia sulle regioni identificate in manuale. E possibile definre quante regioni l utente ritiene necessarie. Fig.5.16: Thresholding su ROI Fig.5.17: Modifica soglia su ROI 5-39

62 In questo caso in figura 5.17 abbiamo diminuito la sogliatura su una regione specifica Digitando più volte il segno +. L icona seguente consente di cancellare ROI disegnate in maniera erronea Terminate queste operazioni se decidiamo che debbano essere definitive anche sulle piastre successive, per memorizzare i valori identivicati digitiamo il seguente tasto. Le modifiche, saranno memorizzate anche nei casi successivi. Se invece desideriamo apporre e modifiche solo sulla piastra che è in analisi in questo momento digitaimo il tasto di assenso senza salvare: Il sistema esce dal menu di thresholding e passa a quello di elaborazione. L immagine è pronta per essere processata. Se abbiamo compiuto errori e decidiamo di ripristinare il valore di sogliatura originale cliccando sull icona seguente riportiamo il sistema ai valori originali: Soglia automatica con contrasto Dal Menu opzioni selezioniamo la voce soglia automatica con contrasto Fig.5.18: Selezione soglia automatica 5-40

63 Genikon Rispetto alla modalità precedente la funzione è molto più limitata perchè nei contrasti consente solo di modificare la luminosità dell immagine e come per la precedente modalità la sogliatura. Rispetto alla precedente ha però il beneficio di modificare anche la luminosità su singole regioni. Le altre icone hanno la stessa funzionalità prevista dalla precedente procedura. Fig.5.19: Soglia automatica Soglia automatica Adattiva Anche in questo caso la modalità è selezionabile dalla voce OPZIONI del menu principale. Fig.5.20: Selezione Soglia automatica adattiva La soglia adattiva rispetto alla precedente tende a uniformare il contrasto sull immagine 5-41

64 Fig.5.21: Selezione Soglia automatica adattiva Inoltre sempre rispetto all automatica consene di imporre un filtro graduato sull immagine che generalmente modifica il contrasto dell immagine ed apporta benefici al punto di fuoco. Anche per questa modalità le icone restanti presentano sempre lo stesso significato della soglia manuale. La scelta della diversa modalità di sogliatura è a discrezione dell operatore. In generale l adattiva è la più semplice da utilizzare ma anche più restrittiva della manuale che invece dà piena disponibilità di funzioni all operatore. N.B.: durante questa operazioni di sogliatura controllare attentamente che una soglia troppo alta non provochi la frammentazione dei cromosomi: in particolare controlliamo i satelliti dei cromosomi della classe D che sono più chiari e più critici. Il controllo è semplice poiché la diversa colorazione dei contorni consente di intravedere quando stiamo dividendo un cromosoma. E bene comunque non tenere la soglia troppo bassa perché rischiamo di dover eseguire successivamente troppi tagli di cromosomi in manuale in quanto il sistema riconoscerà più gruppi che cromosomi singoli. Nel caso in cui si siano fatte delle fusioni il sistema automaticamente presenta tutte le immagini che costituiscono la cellula (immagine principale più fusioni, sulle quali, singolarmente secondo il contrasto dell immagine, dobbiamo sottrarre il fondo). 5-42

65 Genikon 5.7 Fusione di cromosomi esterni al campo Dopo avere confermato la soglia per l immagine principale e per ogni fusione (vedi avanti come acquisire cromosomi esterni al campo) dobbiamo passare alla fusione dei cromosomi. L immagine dei cromosomi esterni al campo è sulla finestra principale e dobbiamo trasferire i cromosomi mancanti nell immagine principale. Selezioniamo tutti i cromosomi mancanti con il tasto di sinistra del mouse e facciamo click sull icona di trasferimento automatico, oppure trasferiamoli uno ad uno selezionandoli e tenendo premuto il tasto di sx del mouse dalla finestra grande del fuse a quella della metafase minore in basso; se dei cromosomi rimangono da separare possiamo utilizzare le funzioni di taglio offerte dall ambiente di fusione. Fig.5.22: Fusione dei cromosomi nella metafase I cromosomi passano sulla piastra principale in alto a sinistra in fila e sono caratterizzati da una F ; il numero sulla F indica da quale fusione provengono. Nel caso in cui si desideri spostare un cromosoma, è sufficiente posizionarsi sopra con il tasto di sinistra del mouse e, tenendo premuto, è possibile posizionarlo su una nuova collocazione. Altrimenti con il tasto di sinistra del mouse i cromosomi possono essere trasferiti uno per volta dall operatore semplicemente selezionando il cromosoma sulla fusione e con il tasto di sinistra premuto trasferire sull immagine della metafase nella posizione desiderata. Al termine invertiamo le due immagini per avere a schermo maggiore l immagine della metafase completa digitando col tasto sinistro del mouse sull immagine della metafase. L acquisizione è finita possiamo procedere ad acquisire un altra cellula o ad elaborare l immagine appena digitalizzata. 5-43

66 5.8 Controllo automatico del fuoco sull immagine Sempre in ambiente d acquisizione, Genikon offre una funzione importante che si può utilizzare anche se il microscopio non è dotato di un controllo elettronico del fuoco. Digitando sull'icona del controllo automatico del fuoco il sistema chiede di seguire la seguente procedura: Fig.5.23: procedura per la cattura d immagini utilizzando la funzione di fuoco automatico Al termine il sistema mostra l immagine della sequenza che ritiene essere la più a fuoco. 5-44

67 Genikon 6 Analisi ed Elaborazione delle immagini Genikon offre due ambienti per analizzare le immagini acquisite. Il primo, definito Analisi, è dedicato all analisi visiva ed alla conta dei cromosomi. Il secondo, definito di Elaborazione, offre invece tutte le funzioni per separare e cariotipizzare le metafasi. Se non siamo soliti contare o analizzare a vista le metafasi possiamo direttamente passare alla separazione dei cromosomi ed alla relativa cariotipizzazione. Ad entrambe le procedure si accede dalla toolbar principale. Alla fase di elaborazione si accede anche dalla videata dell ambiente principale di Genikon con un doppio-click analizzare sul tasto di sinistra del mouse nella finestra relativa all immagine. Entrambe le procedure prevedono che sia stato aperto il caso e che sia stata caricata o acquisita almeno una metafase. 6.1 Ambiente d Analisi delle metafasi Il processo d analisi delle metafasi consente di contare in automatico e /o manuale e di appaiare manualmente gli omologhi. Fig.6.1 Toolbar d Analisi Fig.6.2: Analisi delle metafasi a pieno schermo 6-1

68 6.1.1 Conta dei cromosomi Nell Ambiente Analisi troviamo una finestra principale di lavoro associata ad altre otto finestre della galleria. Posizioniamoci sulla finestra principale la cellula che dobbiamo analizzare. Ci sono due possibilità di conta: Abilita a contare in automatico i cromosomi. Un cromosoma identificato presenta un punto rosso. Per rimuovere un dot, se la conta è errata, è sufficiente digitare il tasto di destra del mouse, la conta automaticamente si aggiorna Abilita a contare in manuale i cromosomi utilizzando il tasto di sinistra del mouse. Sui singoli cromosomi compare un punto rosso (nel campo chiaro) o verde (nella fluorescenza); per eliminarlo è sufficiente posizionarsi sopra e digitare il tasto di destra del mouse, automaticamente la conta è aggiornata. Sulla parte destra in basso all immagine è infatti indicato il numero degli oggetti contati dall operatore e dal sistema, (la conta eseguita può essere diversa se eseguita dall operatore o dal sistema che considera cromosomi si come un oggetto singolo). Per annullare la conta eseguita ed iniziarne una nuova è sufficiente premere il tasto Appaiamento degli omologhi Fig.6.3 Appaiamento degli omologhi Con la funzione:,si appaiano gli omologhi e si esegue un Analisi Visiva. Sono offerte una serie d icone corrispondenti ad ogni coppia d omologhi. Si seleziona il cromosoma e si digita il tasto dx del mouse sul numero di coppia corrispondente. 6-2

69 Genikon Per tornare all inizio della fase di riconoscimento si utilizza l icona seguente, che cancella tutti i numeri collocati in precedenza. E possibile procedere in sequenza ed il sistema presenta a due a due le coppie; oppure se desideriamo passare da una coppia di cromosomi ad un altra senza seguire alcun ordine, dobbiamo digitare il tasto di sinistra del mouse sul numero corrispondente alla coppia specifica sulla toolbar del menu infine è possibile selezionare il numero d interesse dalla legenda attivata mediante il tasto destro del mouse. Il sistema assegna colori ben precisi alla casella del numero d appartenenza. Se i cromosomi identificati sono due, la casella si colora di verde, se il cromosoma è singolo blu ed infine se i cromosomi sono tre il colore sarà rosso. 6.2 Ambiente di Elaborazione Offre le funzioni per separare, analizzare e cariotipizzare i cromosomi. L ambiente è identico nelle diverse modalità di lavoro quali campo chiaro, fluorescenza o FISH. Fig.6.4: Menu d Elaborazione in primo piano cariotipo Le funzioni variano a seconda se stiamo visualizzando la metafase o il cariotipo Fig.6.5: Menu d Elaborazione con in primo piano metafase 6-3

70 6.2.1 Gestione immagini in Ambiente d Elaborazione Il sistema mostra, nel menu di elaborazione, 8 immagini in galleria che possono essere spostate in primo o secondo piano digitando il tasto di sx sull immagine che si desidera, a queste si aggiungono altre tre immagini di dimensione maggiore. Le otto immagini della galleria possono essere visualizzate a maggior ingrandimento digitando il tasto di destra del mouse sull immagine prescelta seguito dalla voce visualizza. Con questa modalità possiamo confrontare metafasi tra loro e se desideriamo possiamo caricare a sinistra anche un altro caso consentendo così di confrontare immagini provenienti da casi differenti. Nel caso in cui sulla finestra a maggiore ingrandimento ci sia il collage, è possibile trasferire dall immagine della galleria un cromosoma per copiarlo sul collage semplicemente selezionando il cromosoma e, tenendo premuto il tasto di sinistra del mouse. Dobbiamo inoltre ricordare che sull immagine principale possiamo ingrandire Fig.6.6 Barra Elaborazione su cariotipo o metafase digitando con il tasto centrale del mouse; se desideriamo muoverci sull area ingrandita possiamo digitare il tasto destro nel punto sul quale desideriamo muoverci. Abbiamo già 6-4

71 Genikon osservato che una volta ingradita l immagine con visualizza possiamo scorrere a maggiore ingrandimento tutte le immagini della galleria utilizzando le frecce di avanti ed indietro della tastiera Toolbar d elaborazione dei cromosomi Abbiamo visto che si tratta di due diverse Toolbar con funzioni diverse e specifiche. In particolare se abbiamo in primo piano la metafase avremo anche la funzione della creazione del cariotipo mentre se in primo piano è posizionato il cariotipo compariranno le funzioni di allineamento degli omologhi e raffronto degli ideogrammi. Vediamo comunque in dettaglio le singole funzioni. La barra strumenti, in particolare per le operazioni di separazione dei cromosomi, è rappresentata da funzioni che lavorano in manuale o in automatico secondo la complessità dei raggruppamenti degli oggetti. Vediamo in sequenza le diverse funzioni associate alla Barra Strumenti d Elaborazione: Selezione di tutti gli oggetti Deselezione di tutti gli oggetti Colorazione oggetti Ripristina oggetti eliminati Eliminazione oggetti Valutazione dei profili Aumenta contrasti con filtri Modifica luminosità Ripristina contrasti originali Divisione automatica Divisione manuale Dissovrapposizione Auto Dissovrapposizione manuale Auto Divisione di più gruppi Disegno assi Unione oggetti Annotazione e testi Creazione collage Eliminazione collage Invio oggetti al collage Modifica fondo collage Creazione manuale Cariotipo Creazione automatica Cariotipo 6-5

72 Con la creazione del cariotipo si aggiungono le seguenti Icone: Allineamento centromeri Allineamento per lunghezza Posizione centromeri Ingrandimento Raddrizzamento Pulizia dei cromosomi Conta numero di bande Inversione livelli Aggiustamento cromosoma ad ideogramma Confronto omologhi Ideogrammi in manuale Ideogrammi in automatico Identificazione delle strutture sulla metafase e\o sul cariotipo Sia sulla metafase che sul cariotipo, gli oggetti uniti si identificano mediante contorni a colori continui. Il numero di cromosomi uniti sulla metafase dopo il processo di acquisizione dipende dal valore di soglia che abbiamo immesso sulla nostra immagine; tanto più alto è il valore imposto della soglia e tanto più divisi risulteranno i cromosomi. In alcuni casi è comunque impossibile separare tutto con la sola sottrazione del fondo e 6-6

73 Genikon dobbiamo necessariamente procedere ai tagli manuali o automatici; rischieremmo di perdere informazioni importanti relative ai cromosomi (per esempio satelliti). Fig.6.6: Agglomerati Il sistema consente di identificare subito ed in toto quali sono gli agglomerati da separare (Fig.6.6) comunque per analizzare in dettaglio quali sono i cromosomi uniti e disgiunti è necessario passare con il mouse sulle strutture alle quali siamo interessate ed il sistema mostra contorni continui o separati che evidenziano eventuali gruppi o cromosomi singoli Selezione e deselezione di cromosomi Se dunque passiamo sui cromosomi senza digitare il mouse il sistema mostra dei quadrati tratteggiati che indicano se i cromosomi appartengono o no allo stesso gruppo. Fig.6.7: Oggetti evidenziati dal cursore del mouse prima della selezione Nel caso precedente il rettangolo è tratteggiato ma unico per i due cromosomi, ciò indica che dovranno essere separati. Per selezionarli dobbiamo digitare il tasto di sinistra del mouse sull oggetto desiderato. Fig.6.8: Oggetto selezionato 6-7

74 In questo caso il rettangolo è continuo ed indica che i due cromosomi sono uniti ed è su questi che possiamo lavorare per effettuare la separazione. N.B.: Nelle divisioni è possibile selezionare contemporaneamente più gruppi ed il sistema lavorerà su tutti in una volta Pseudocolore Un altra funzione, appartenente sempre al menu di elaborazione, aiuta l operatore a controllare quali sono i cromosomi separati e non: è la funzione dello pseudocolore:. I cromosomi sono mostrati in colori differenti se sono separati, stesso colore se sono uniti. Possiamo agire su quelli da dividere anche lasciando ON la funzione dello pseudocolore ma non è raccomandabile poiché è difficile analizzare gli oggetti. Fig.6.9: Oggetti senza pseudocolore Fig.6.10: Oggetti con pseudocolore La funzione dello pseudocolore ha un diverso effetto se dal menu preferenze selezioniamo attiva la funzione indicata in Fig Fig.6.11 Opzione che applica colori casuali ai contorni 6-8

75 Genikon In questo caso il sistema evidenzia con colori uguali i contorni di cromosomi uniti come rappresentato in Fig.6.9. Fig.6.11 Identificazione unioni mediante contorni Separazione di cromosomi uniti Esistono due tipi d unione: a) unione con contatto; b) unione con sovrapposizione. La procedura di separazione è completamente diversa. A Separazione di cromosomi uniti per contatto Dalla barra strumenti dell ambiente d analisi possiamo scegliere se separare in manuale o in semi automatico o in automatico (la scelta dipende dal grado di complessità dell unione). Separazione manuale Procedere come segue: 1. Selezionare la funzione di separazione manuale e semi - automatica dalla toolbar: ; 2. Selezionare il gruppo di cromosomi da separare; 3. Con il tasto di sinistra del mouse tracciamo la poligonale passante per i punti di contatto tra i cromosomi. Mantenendo premuto il tasto del mouse, la poligonale è tracciata in modo continuo, eseguendo invece dei click successivi con il tasto di sinistra è possibile tracciare una poligonale a tratti. Il sistema agisce solo sui cromosomi selezionati dall operatore; 6-9

76 4. Terminare la poligonale facendo click con il tasto di destra del mouse; 5. E possibile effettuare nuovi tagli, ripetendo i passi tre e quattro; 6. Eseguire un ultimo click sul tasto di destra del mouse se tutti i cromosomi del gruppo selezionato sono separati. Il sistema mostra i contorni dei cromosomi separati ed aggiorna la conta in basso a destra. Se si desidera annullare l operazione di taglio è possibile tornare indietro con la funzione di undo. Separazione semi automatica Per il taglio manuale e semi automatico risulta utile la funzione di ingrandimento di porzioni dell immagine; tale funzione si attiva digitando due volte il tasto di sinistra del mouse sul particolare dell immagine che desideriamo ingrandire oppure utilizzando il tasto centrale del mouse. Per tornare alle condizioni originali è sufficiente eseguire doppio click sull immagine ingrandita oppure premere il tasto centrale del mouse. Procedere come segue: 1. Selezionare all inizio la funzione di separazione manuale e semi automatica dalla toolbar: ; 2. Selezionare il gruppo di cromosomi da separare; Fig.6.12 Selezione di un oggetto 3. Posizionarsi con il puntatore del mouse nel punto di taglio desiderato. Fig.6.13 Posizionamento sul punto di taglio 4. Eseguire un singolo click con il tasto di destra del mouse; 6-10

77 Genikon Fig.6.14 Separazione semi - automatica Il sistema mostra i contorni dei due cromosomi separati ed aggiorna la conta in basso a destra. Separazione automatica Procedere come indicato: 1. Selezionare i gruppi che si desidera separare in automatico. E possibile selezionare più gruppi di cromosomi in contemporanea. In questo caso è necessario prestare attenzione a tutte le separazioni che effettua il sistema ed al fine di rilevare tagli scorretti su cui intervenire successivamente; Fig.6.15: Seleziona multipla 2. Utilizzare l icona di taglio automatico: oppure eseguire un click sul tasto di destra del mouse; 3. Il sistema ad ogni click sul tasto destro del mouse separa un cromosoma dal gruppo, circoscrivendolo con un colore differente dal resto del gruppo. Fig.6.16: Cromosomi generati dalla separazione 6-11

78 Nel caso in cui non funzioni la separazione automatica o nel caso in cui non sia stata precisa, possiamo utilizzare l undo per procedere poi con il taglio manuale. B Separazione di cromosomi uniti in sovrapposizione Come per la divisione per contatto possiamo scegliere dalla barra strumenti se separare in manuale o in automatico. Dissovrapposizione manuale Come per il taglio se non funziona la separazione automatica (si seleziona il gruppo e si attiva la precedente funzione di dissovrapposizione automatica) possiamo utilizzare la modalità manuale. Nel caso in cui si presenti una situazione molto complessa è bene utilizzare la funzione di disegno degli assi dei singoli cromosomi (vedi avanti). Come si procede: 1. selezioniamo il gruppo; 2. Selezioniamo l icona di separazione manuale: ; 3. Con il mouse, usando il tasto di sinistra posizioniamo quattro punti sugli angoli dell incrocio; Fig.6.17: Dissovrapposizione manuale 4. Al termine digitiamo il tasto di destra del mouse. Anche in questo caso il sistema mostrerà il tipo di taglio circoscrivendo i cromosomi con un bordo colorato. Fig.6.18: Cromosomi dopo dissovrapposizione 6-12

79 Genikon Dissovrapposizione automatica Per prima cosa è necessario selezionare i cromosomi da separare; in questo caso è possibile lavorare su più gruppi di cromosomi in contemporanea. Come si procede: 1. si seleziona il gruppo (o più gruppi); 2. si preme il tasto di dissovrapposizione. Nel caso in cui il sistema non riesca ad agire in automatico (avverte l operatore con un messaggio) procediamo in manuale. N.B.: il sistema non ricrea in maniera arbitraria le bande del cromosoma sottostante ma lascia quelle del cromosoma posizionato superiormente. Separazione di gruppi complessi di cromosomi mediante disegno degli assi Utilizziamo il disegno degli assi se si tratta di un unione complessa: Fig.6.19: Disegno dell'asse 1. Selezioniamo sul gruppo sul quale desideriamo agire; 2. Selezioniamo l icona per disegnare gli assi; 3. Procediamo con il tasto di sinistra del mouse nel disegno dell asse su ogni cromosoma (anche in questo caso possiamo procedere in continuo tenendo premuto il mouse o a tratti digitando più volte il tasto di sinistra del mouse).vedremo comparire insieme all asse il contorno dei cromosomi identificato dal sistema; 4. Al termine di ogni cromosoma digitiamo il tasto di destra; 5. Disegnati tutti gli assi digitiamo nuovamente il tasto destro per terminare. Per questa particolare separazione l utente può decidere, utilizzando il menù di personalizzazione, quanto margine può portarsi dietro un dato cromosoma e quindi quanto è lo spessore dei cromosomi. Si consiglia di tenere questo valore un po più largo perché questo faciliterà l identificazione sul foglio del cariotipo dei cromosomi che provengono da un overlapping (generalmente 125 % è un valore medio buono per cromosomi non troppo allungati. 6-13

80 Fig.6.20 Definizione nelle "Opzioni" dello spessore dei contorni N.B.: Se lavoriamo con un valore di spessore troppo basso è possibile che con il disegno degli assi, se non siamo estremamente precisi e non passiamo esattamente nella parte centrale del cromosoma, vengano eliminate delle porzioni di cromosoma. Dovremo selezionare nuovamente i frammenti e riunirli al cromosoma mediante la funzione d unione oppure possiamo utilizzare la funzione di undo per ritornare all inizio della divisione degli assi. Nell immagine seguente è illustrato il caso in cui lo spessore medio dei cromosomi sia basso rispetto ai cromosomi che stiamo analizzando. Fig.6.21:Frammenti di cromosoma Separazione completamente automatica Genikon offre un ulteriore funzione di separazione dei cromosomi da utilizzare nel caso in cui si lavori con piastre non troppe complesse. Come si procede: 1. Selezioniamo tutti i gruppi da dividere; 2. Premiamo l icona seguente. E necessario che l operatore controlli attentamente tutte le separazioni effettuate dal sistema per correggere eventuali errori Unione di frammenti di cromosoma Sempre dalla Barra principale possiamo utilizzare la funzione di unione di due cromosomi rappresentata dalla seguente icona:. E necessario selezionare uno per volta con il tasto di sinistra del mouse, i due frammenti che desideriamo unire; 6-14

81 Genikon 1. Digitiamo l icona per unire i due frammenti. 2. Attenzione Genikon consente di riunire solo due oggetti alla volta e solo quelli selezionati tutto ciò è dovuto ad un controllo interno del sistema Funzione unione oggetti rapida Nel caso in cui desideriamo unire due frammenti possiamo utilizzare il tasto di sinistra del mouse tenuto premuto tra i punti che sono da congiungere, rilasciando il tasto di sinistra automaticamente i due frammenti saranno uniti Fig.6.22 Unione oggetti tramite mouse Selezione di tutte le strutture Consente di selezionare tutti i cromosomi in una sola volta. Se desideriamo modificare il contrasto su tutti i cromosomi con un solo passaggio, possiamo utilizzare l icona di selezione di tutti e poi scegliamo il valore di contrasto. Esiste un altra possibilità per selezionare più oggetti in una sola volta. Se utilizziamo il tasto di sinistra e poi trasciniamo il mouse (tenendo premuto il tasto di sinistra) viene disegnato un rettangolo che ingloba e seleziona in automatico le strutture in esso contenute. E una funzione utile per selezionare e cancellare in una sola volta tanti piccoli frammenti Deselezione di tutte le strutture Con questa funzione possiamo deselezionare in una sola volta tutti gli oggetti selezionati sull immagine:. E l esatto opposto della funzione precedente. Deseleziona tutto ciò che è stato selezionato. 6-15

82 Eliminazione di strutture La funzione consente di eliminare tutti gli oggetti selezionati sull immagine. Come già detto gli oggetti possono essere selezionati uno per volta, a gruppi utilizzando il mouse e disegnando rettangoli d inclusione, tutti insieme con l icona già sopra descritta. Le strutture eliminate possono essere rese invisibili se nelle opzioni di personalizzazione abbiamo selezionato di non voler mostrare gli oggetti eliminati. Se invece abbiamo selezionato di mostrarli, gli oggetti rimarranno visibili ma circoscritti con un bordo rosso che indica la loro eliminazione dalla conta e quindi dal successivo cariotipo Ripristino di una struttura eliminata Se erroneamente abbiamo cancellato una struttura che è invece essere un cromosoma possiamo utilizzare questa funzione per ripristinarla:. Dobbiamo selezionare l oggetto eliminato (come detto risulta circoscritto di rosso) e digitiamo il tasto di ripristino. Automaticamente l oggetto ricompare anche sul cariotipo e si aggiorna anche la conta cromosomica Correzione sfondo e luminosità E la funzione che consente di scurire o schiarire gli oggetti selezionati. E possibile decidere se si desidera lavorare su tutti i cromosomi o su singoli o su alcuni. Si apre un sottomenu che consente di operare con due funzioni: luminosità e sfondo (Fig.6.23). Le due funzioni lavorano in combinata e l effetto è complessivo è dunque meglio agire prima con una, studiare l effetto e poi con entrambe associate. Fig.6.23: Correzione luminosità e sfondo Luminosità Consente di schiarire i cromosomi se portiamo il cursore verso valori positivi, o scurire se andiamo verso il negativo. Il valore centrale zero non ha naturalmente effetto. L intervallo 6-16

83 Genikon di valori validi va da 10 a 10. Questa funzione si utilizza se abbiamo cromosomi troppo o poco contrastati. La funzione agisce solo sui cromosomi selezionati; per procedere possiamo prima vedere l effetto dopo aver selezionato i cromosomi da variare, spostando il cursore, quando raggiungiamo un buon contrasto, dobbiamo digitare il tasto d assenso verde per rendere la modifica effettiva. Solo dopo quest operazione la modifica sarà mantenuta e sommata alle operazioni successive. Se dunque desidero schiarire i cromosomi devo lasciare il fondo tra i valori 0 e 255 mentre il cursore della luminosità si sposterà da 0 a +10. Sfondo Agisce invece sul fondo della nostra piastra: permette di ottenere cromosomi con più o meno fondo. I valori possibili per i due cursori sono tra 0 e 255. L effetto del fondo è molto utile se abbiamo metafasi con molto citoplasma. Anche se con l effetto della soglia il fondo si pulisce è possibile che i singoli cromosomi rimangano circoscritti di una patina grigia che viene anche riportata poi sul cariotipo. Se dunque per esempio stiamo lavorando in campo chiaro possiamo eliminare questo contorno selezionando i cromosomi sui quali desideriamo lavorare ed alzando in positivo il valore del fondo.se invece lavoriamo in fluorescenza selezioniamo i cromosomi sui quali desideriamo lavorare e diminuiamo il valore del fondo. Con questa modalità parte del fondo dovrebbe scomparire. Anche in questo caso la funzione agisce solo sui cromosomi selezionati; per osservare come agire possiamo prima vedere l effetto spostando il cursore e quando raggiungiamo un buon contrasto possiamo digitare il tasto d assenso verde. Solo dopo quest operazione la modifica sarà mantenuta e sommata alle operazioni successive Funzione di affinamento dei contorni Anche questa funzione apre una finestra che offre differenti modalità di affinamento dei contorni. Consente di utilizzare filtri specifici a seconda della modalità di lavoro: G/R/Q/dapi. Per ogni serie di filtri possiamo avere tre livelli di potenza. Oltre alle due serie specifiche per le bande G/Q è offerta anche la possibilità standard di utilizzare filtri affinamento o smorzamento che possono essere combinati per ottenere algoritmi specifici. 6-17

84 Fig.6.24: filtri disponibili e potenza Anche l aumento o diminuzione del contrastoo agisce unicamente sui cromosomi selezionati Ripristino dei cromosomi Riporta i valori di contrasto, luminosità e di affinamento dei cromosomi alle condizioni originali:. Non è un Undo poiché non annulla solo l ultima funzione ma riporta i contrasti dell immagine così com era stata acquisita dopo la sottrazione della soglia Profilo Consente di osservare la distribuzione dei livelli di grigio lungo l asse del cromosoma. In teoria cromosomi omologhi dovrebbero mostrare lo stesso profilo; in realtà il profilo varia secondo il livello di despiralizzazione del cromosoma. Un esempio di profilo è riportato in Fig Fig.6.25: Profilo di un cromosoma Ideogrammi di confronto Esistono due diverse modalità di costruzione d ideogrammi. Una modalità manuale ed un automatica. Qualunque sia la modalità gli ideogrammi che si ottengono possono essere trasferiti sulle immagini del collage, cariotipo o metafase per eseguire confronti Modalità manuale Il tasto apre il menu degli ideogrammi per la costruzione manuale. Per l ideogramma trasferito su cariotipo, metafase o composizione sono disponibili una serie d utility accessibili mediante legenda (fig. 6.23). Per accedervi è sufficiente posizionarsi sull ideogramma e premere il tasto destro del mouse. NB: La lista delle funzioni si mostra solo con ideogramma NON SELEZIONATO. In caso 6-18

85 Genikon contrario la pressione del tasto destro del mouse comporta la separazione dell ideogramma nel punto di posizionamento del cursore. Fig.6.26 Lista funzioni dell ideogramma Utility ideogramma Voce legenda Bande R MOSTRA BANDE Descrizione La selezione della voce in oggetto consente un aggiornamento in tempo reale della visualizzazione. Nel rispetto della risoluzione scelta si può visualizzare il bandeggio di tipo G oppure quello di tipo R. La selezione della voce comporta la visualizzazione delle etichette NOME BANDA al passaggio del cursore sulla banda dell ideogramma NON SELEZIONATO. Per etichettare in modo permanente una banda è sufficiente eseguire un click con il tasto sinistro del mouse sulla banda d interesse. Per la rimozione è sufficiente un secondo click. Le etichette inserite permangono anche in seguito alla deselezione della voce MOSTRA BANDE. 400 L immagine dell ideogramma è aggiornata in tempo reale al variare della risoluzione 6-19

86 scelta. COLORE La voce in oggetto apre una tabella colori su cui è possibile scegliere o creare un nuovo colore da associare al bandeggio. MODIFICA ETICHETTA E possibile inserire una stringa descrittiva dell ideogramma oppure modificare quella esistente. RUOTA La selezione di questa voce di legenda comporta una rotazione dell ideogramma nella direzione indicata dal cursore del mouse. Lo spostamento del cursore causa un incremento o diminuzione dell angolo di rotazione. Un click sul tasto sinistro del mouse convalida l angolo di rotazione visualizzato. NB: Nell ipotesi in cui sia desiderabile eseguire una rotazione di 180 o ribaltamento dell ideogramma in esame è consigliabile l impiego dell apposita funzione accessibile dal tasto Per l oggetto ideogramma sono attive le seguenti funzioni: Separazione Un ideogramma può essere separato in qualsiasi punto. La funzione si attiva selezionando l ideogramma d interesse con il tasto di sx del mouse, ci si posiziona in un punto interno 6-20

87 Genikon alla banda in corrispondenza del quale si desidera eseguire il taglio e quindi digitando il tasto destro del mouse si effettua la divisione in due frammenti. Unione Per eseguire l operazione d unione non è necessario allineare i due oggetti da unire. E sufficiente selezionare i due elementi e quindi premere il tasto d unione Fig.6.24 Unione di due frammenti d ideogramma L ideogramma risultante assume come angolo di rotazione quello eventualmente posseduto dall oggetto di testa. L unione è sempre eseguita mantenendo le posizioni relative Modalità automatica Il tasto apre la finestra d editing delle anomalie ideogrammi in modalità automatica Per prima cosa è possibile la risoluzione di banda alla quale desideriamo lavorare e la scelta è da digitando sulla finestra seguente il valore prescelto Fig.6.27 Identificazione risoluzione di bandeggio E inoltre possibile rappresentare gli ideogrammi normalmente in G ma se si desidera possiamo selezionare la modalità in R Fig.6.28 Selezione bande R 6-21

88 Possiamo inoltre selezionare il colore che desideriamo imporre ai frammenti che indicano l aberrazione (nella figura è rappresentato il rosso) Fig.6.29 Definizione colore E anche possibile eliminare il colore deselezionando il flag. Per iniziare a costruire l anomalia è necessario specificare quale anomalia stiamo analizzando. E possibile scegliere fra traslocazioni, delezioni, inversioni, duplicazioni selezionando la finestra seguente Fig.6.30 (a/b) descrizione del tipo d aberrazione Dobbiamo ora indicare al sistema quali sono i cromosomi interessati: Fig.6.31 Segnalazione cromosomi E necessario posizionarsi con il mouse sull ideogramma e spostarsi lungo l asse per vedere scorrere il numero di banda ci fermiamo alla banda d interesse. Eseguiamo la stessa cosa sul secondo cromosoma interessato. A questo punto per rappresentare gli ideogrammi con l anomalia digitiamo mostra sul menu seguente: Fig.6.32 Risultato Ideogrammi 6-22

89 Genikon Questi due ideogrammi possono essere trasferiti sull immagine della finestra maggiore nel menu d elaborazione, utilizzando il tasto di sinistra mantenuto premuto e trascinando il mouse sulla finestra interessata. Possiamo decidere se mantenere nel nostro archivio Fig.6.33 Archiviazione Anomalie questo tipo d anomalia digitando Aggiungi nel menu seguente. Nel riaprire il menu successivamente noteremo che il tipo d anomalia rimane e possiamo richiamarla senza dover ricreare gli ideogrammi corrispondenti Aggiustamento dimensione ideogrammi a cromosomi Accade spesso di dovere ingrandire il cromosoma e dover poi, per analizzare le bande, aggiustarlo alla stessa dimensione dell ideogramma. Dopo aver trasferito sul collage cromosoma ed ideogramma selezioniamo entrambi e digitiamo la funzione di autoaggiustamento: Fig.6.34 Senza auto_aggiustamento Fig.6.35Con auto_aggiustamento Undo La funzione di undo consente di tornare indietro dall ultima operazione eseguita:. 6-23

90 Salvataggio Consente di salvare le modifiche effettuate sull immagine ( ) Uscita dall ambiente d elaborazione Esce dall ambiente d elaborazione e salva le modifiche effettuate. Ogni volta che esco da questo menu il sistema chiede all utente se si desidera salvare le modifiche effettuate sull immagine Creazione e modifica del cariotipo Fig.6.36 Modalità automatica Fig.6.37 Modalità manuale Terminata la separazione dei cromosomi possiamo procedere alla creazione del cariotipo. Il cariotipo può essere creato in automatico o in manuale; la differenza fondamentale tra le due procedure consiste nel fatto che mentre col cariotipo automatico è il sistema che mostra una proposta del riconoscimento dei cromosomi, nel caso del cariotipo manuale è l operatore che assegna ad ogni cromosoma il numero specifico di classe. Il sistema in automatico appaia gli omologhi in base alla lunghezza, posizione del centromero e distribuzione dei livelli di grigio. Nel caso di creazione del cariotipo in modalità automatica il sistema discrimina, in base alla modalità di acquisizione impiegata, il tipo di bandeggio ed il tipo di cromosomi (corti, medi lunghi) in analisi. Unica eccezione: l acquisizione in CAMPO chiaro, in questo caso l utente è tenuto ad indicare se trattasi di un bandeggio di tipo G oppure R. A creazione avvenuta l immagine della metafase passa nella finestra in basso a sinistra ed il cariotipo si sposta sulla finestra principale. 6-24

91 Genikon Fig.6.38: Cariotipo Aggiustamento del cariotipo Genikon può commettere errori nel riconoscimento di alcuni cromosomi, in questo caso è opportuno eseguire un aggiustamento del cariotipo. La gestione delle finestre delle immagini è la seguente: per spostare la finestra della metafase sulla finestra principale facciamo click con il tasto di sinistra del mouse sull immagine della metafase; per visualizzare un altra metafase e cariotipo (le immagini delle metafasi e dei cariotipi sono sempre legate insieme) digitando il tasto sinistro due volte sulla metafase della galleria, la carichiamo insieme al cariotipo. Se vogliamo aumentare il valore d ingrandimento digitiamo il tasto centrale del mouse digitando nuovamente il tasto centrale torniamo a fattore d ingrandimento uno. La possibilità di spostare le due immagini della metafase con il cariotipo è una funzione molto comoda. Se non abbiamo separato due cromosomi che risultano uniti sul cariotipo possiamo selezionare la coppia unita, invertire l immagine del cariotipo con quella della metafase dove automaticamente risultano selezionati e procedere come al solito alla divisione Automaticamente ciò che facciamo sulla metafase si esegue anche sul cariotipo e viceversa (consideriamo comunque che i cromosomi possono essere divisi direttamente anche sul cariotipo). Vediamo ora come aggiustare la posizione dei cromosomi sul foglio del cariotipo. Per spostare un cromosoma: selezioniamo il cromosoma da spostare con il tasto sinistro del mouse; teniamo premuto e spostiamo il mouse fino al raggiungimento della posizione corretta; il cromosoma si sposta seguendo i movimenti del mouse. Rilasciamo il tasto del mouse quando il cromosoma è posto nella giusta posizione. Se desideriamo invertire due cromosomi uno con l altro è 6-25

92 sufficiente selezionare il primo e sovrapporlo al secondo automaticamente saranno scambiati. Per rovesciare completamente un cromosoma (di 180 ) è sufficiente digitare tasto di destra del mouse sul cromosoma da invertire. Per ruotare parzialmente un cromosoma è sufficiente tenere premuto il tasto di destra del mouse e muovere il mouse sul cromosoma interessato: il sistema mostra lo mantenendo sul fondo il cromosoma originale, rilasciando il mouse il sistema lascia l ultima angolatura Formato del cariotipo e posizione dei centromeri Esistono funzioni ulteriori che consentono di aggiustare il formato del cariotipo e la posizione dei centromeri. Queste funzioni sono attive nel momento in cui è stato creato il cariotipo e solo ora compaiono sulla toolbar. La prima funzione ( ) si utilizza per allineare tutti i cromosomi rispetto al centromero. Normalmente i cromosomi sono tutti allineati alla base (Fig.6.20); con questa funzione il sistema allinea tutti i cromosomi di una stessa riga sul centromero più alto (Fig.6.37). Fig.6.39: Allineamento cromosomi alla base Fig.6.40:Allineamento cromosomi per centromero Quando i cromosomi sono allineati sul centromero, la posizione del centromero individuata dal sistema è evidenziata con dei tratti orizzontali. Qualora il sistema non avesse individuato correttamente il centromero, è possibile intervenire manualmente per mezzo della funzione che si attiva con l icona. Il cursore del mouse cambia in, ed ora è possibile fissare la posizione corretta dei centromeri. 6-26

93 Genikon La seconda funzione è l autoallineamento: consente di riaggiustare il formato del cariotipo a seconda della lunghezza dei cromosomi ( ). Può essere utilizzata contemporaneamente alla funzione d allineamento sui centromeri Fig.6.41: Cariotipo non autoallineato Fig.6.42: Cariotipo autoallineato Tra la prima immagine e la seconda si nota che il sistema varia l utilizzo dello spazio in basso sfruttando tutto il foglio. Se dunque abbiamo cromosomi particolarmente allungati il sistema consente di riaggiustare il foglio del formato per fare collocare correttamente anche cromosomi di tale tipo Modifica dei cromosomi I tasti e servono per ribaltare i cromosomi selezionati nei due sensi. E anche possibile ingrandire i cromosomi selezionati per mezzo della funzione (scalatura). Si apre la finestra di Fig.6.43, dove è possibile scegliere un ingrandimento tra 50 e 200 %. Fig.6.43: Modifica della geometria 6-27

94 Ritocco dei cromosomi Fig.6.44 La gomma ha dimensioni differenti selezionabili E possibile ritoccare eventuali cromosomi che presentano alcune parti sgradevoli alla vista, come residui dovuti a delle separazioni approssimative. Si può utilizzare la funzione della gomma, dopo aver selezionato un cromosoma. Quando il tasto è in posizione ON, se ci si avvicina con il cursore del mouse, tenendo il bottone di sinistra premuto, si noterà che la parte di cromosoma prossima al cursore scompare. La sequenza di Fig.6.45 mostra un cromosoma che necessita di un ritocco, e come la funzione suddetta cancelli il cromosoma modificando in maniera appropriata il contorno. Fig.6.45:Cromosoma prima e dopo il ritocco Conteggio delle bande Genikon presenta una funzione che calcola automaticamente il numero di bande di un cariotipo. L icona da selezionare è. Il risultato del conteggio è espresso in basso a destra dell immagine cariotipo usando una notazione che riduce il risultato all intervallo di valori più probabile. La funzione è di tipo ON/OFF. La funzione è attiva e presente quando in primo piano è collocato il cariotipo. 6-28

95 Genikon Aggiunta di testo e frecce E possibile inserire testi e frecce nella metafase, nel cariotipo e nel collage, premendo il tasto. Fig.6.46: Strumenti d editing La finestra che si apre (Fig.6.46) permette anche di scegliere il tipo di carattere e il colore. Permette inoltre l introduzione di Frecce. Una volta introdotte le frecce sull immagine possono essere anche successivamente modificate digitando il tasto dx del mouse. Fig.6.47 Editing d immagine Creazione d immagini composizione Per trasferire gli oggetti selezionati, per fare dei confronti o per incollare oggetti di diversa natura, premere il tasto. In questo modo è creata (se non c è già) un immagine composizione (s inizia con C1). Per incollare oggetti provenienti da altre immagini, digitare il tasto destro del mouse sull anteprima dell immagine che ci interessa, scegliere la 6-29

96 voce Visualizza dal menù che compare, e trascinare gli oggetti che ci interessano sulla composizione, utilizzando il tasto di sinistra premuto. Mediante il tasto è possibile aggiungere una o più composizioni vuote. La loro eliminazione è eseguibile mediante l icona seguente. consente di invertire il colore di sfondo della composizione corrente; se per esempio dobbiamo trasferire cromosomi da Fish possiamo imporre alla composizione il fondo nero.le composizioni a corredo di un caso sono visibili in galleria selezionando: nell ELENCO DEI VETRINI. La visualizzazione della singola composizione nell AMBIENTE D ELABORAZIONE IMMAGINI è resa possibile dall organizzazione in FOLDER. Un semplice click con il tasto sinistro del mouse sull etichetta della composizione d interesse, la dispone in primo piano Confronto tra omologhi Fig.6.48: Composizione C1 in primo piano E possibile confrontare tra loro tutti i cromosomi del caso corrente che sono stati attribuiti alla medesima classe utilizzando la seguente funzione: Si apre la finestra mostrata in Fig Fig.6.49: Finestra per il confronto tra omologhi Nelle caselle bianche è necessario inserire il numero della classe di omologhi che desideriamo visualizzare; sarà così possibile confrontare in contemporanea 2 coppie di omologhi relative a tutti i cariotipi creati in precedenza ed appartenenti a quel caso specifico. Se selezioniamo la voce mostra ideogramma il sistema visualizza sulla sx anche l ideograma relativo alla coppia selezionata. I cromosomi possono essere anche modificati dimensionalmente utilizzando la seguente icona: 6-30

97 Genikon Se spostiamo da dx a sx diminuiremo la dimensione. Con la seguente icona invece possiamo spostare da sx a destra i cromosomi nel caso in cui non sia possibile visualizzarli tutti perché sono stati fatti molti cariotipi. Anche in questo caso il tasto: collage.,serve per trasferire i cromosomi selezionati nel Raddrizzamento di un cromosoma Fig.6.50 Cariotipo non raddrizzato Fig.6.51 Cariotipo raddrizzato Per rendere attiva la funzione sono stati selezionati tutti i cromosomi e selezionata la funzione di raddrizzamento. Naturalmente lo scopo maggiore si ottiene quando lavoriamo su un collage e desideriamo eseguire un confronto con gli ideogrammi. Fig.6.52 Raddrizzamento cromosomi su collage 6-31

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99 Genikon 7 Analisi in FISH Genikon anche per l analisi in FISH acquisisce immagini monocromatiche per piano di fluorescenza ed impone ad ogni singola componente uno colore scelto dall operatore. Fig.7.1: Analisi in FISH Il programma della FISH è integrato nella stazione con quello della cariotipizzazione ed utilizza, infatti, gran parte delle funzioni che abbiamo già esaminato per il campo chiaro e la fluorescenza. La gestione dei casi è identica all altro due modo (campo chiaro e fluorescenza); nella fase d acquisizione si osservano alcune peculiarità che facilitano l operatore ad acquisire sequenze d immagini corrispondenti ai singoli fluorocromi. 7.1 Acquisizione d immagine in FIS L ambiente della FISH si abilita nel momento in cui in fase d acquisizione si seleziona l icona della FISH: Creazione della lista d acquisizione dei fluorocromi Rispetto alla fase d acquisizione standard in campo chiaro e/o fluorescenza il programma consente di creare una lista di fluorocromi che corrisponde alla sequenza con la quale li desideriamo fotografare. 7-1

100 Fig.7.2: Creazione di un profilo Introduciamo il nome della lista, o nel caso in cui si sia già lavorato col Sistema, possiamo richiamare la lista dalla memoria del Sistema Fig.7.3: Ricarica di una sequenza precedentemente impostata Creazione nuovi fluorocromi Se il Sistema è vergine dovremo introdurre noi i fluorocromi e definirne anche il colore ( ). Fig.7.4 Inserimento nuovo fluorocromo Introduciamo il nome del nostro fluorocromo e definiamo ora il colore, nel caso del DAPI è per esempio azzurro Fig.7.5 definizione del colore Fig.7.6 selezione del colore Per scegliere il colore corretto, ci posizioniamo con il tasto di sx del mouse sul colore prescelto, digitiamo poi OK per accettare. 7-2

101 Genikon Possiamo scegliere il nome del filtro associato sul microscopio, nel caso in cui al sistema sia interfacciato un microscopio motorizzato. Fig.7.7 Selezione del filtro corrispondente sul microscopio E inoltre possibile per ogni fluorocromo scegliere il numero di piani d acquisizione e la distanza fra ognuno nel caso in cui sia presente sul microscopio un controllo automatico del fuoco. Generalmente la definizione del numero di piani e lo spessore è a discrezione dell operatore. Fig.7.8 Definizione del numero di piani per singolo fluorocromo Trasferimento fluorocromi alla lista Una volta definiti i fluorocromi, possiamo trasferirli alla lista. 7-3

102 Fig.7.9Trasferimento dei fluorocromi sulla lista Teniamo premuto il tasto di sinistra del mouse sul nome e trasciniamolo a sinistra, consideriamo che la lista della sequenza corrisponde a quella d acquisizione. Nel caso in figura il primo fluorocromo da acquisire sarà il dapi e seguiranno FITC e Trita. Automaticamente il Sistema definisce il primo fluorocromo come counterstain ma questo sarà modificabile in ogni momento. Da questo momento in poi nella lista rimarranno memorizzati: colore, filtro e piani focali mentre i valori di set UP della telecamera devono essere testati durante la fase d acquisizione ed ogni volta memorizzati all interno della lista. Se invece il fluorocromo è stato inserito nella lista per la prima volta consideriamo che i valori del set up sono tutti al minimo Memorizzazione della lista dei fluorocromi Per rendere la lista attiva salviamola per poterla utilizzare altre volte. Fig.7.10 Memorizzazione della lista Abbiamo visto che nel caso in cui ci sia una motorizzazione (ruota o microscopio) è nella definizione del fluorocromo che dobbiamo assegnare il filtro. N.B. le opzioni di collegamento a ruota o Microscopio motorizzato si mostrano automaticamente a questo livello solo se nel Menu delle personalizzazioni abbiamo selezionato di interfacciare una specifica periferica al sistema. Se per esempio è stato selezionato il microscopio E1000 il sistema mostrerà sotto alla lista del colore la lista dei filtri da associare a quel fluorocromo. In particolare poiché l installazione di un microscopio motorizzato è fatta all origine a questo livello sarà già nominato il nome del fluorocromo specifico con la sistemazione del corretto blocchetto per la fluorescenza. Per definire il counterstain della lista utilizziamo l icona seguente: 7-4

103 Genikon Per cambiare la posizione della selezione del counterstain è sufficiente digitare due volte il tasto di sinistra del mouse sulla sx del nome del fluorocromo: Fig.7.11 Definizione del counterstain Il profilo della lista può essere salvato in maniera tale che tutte le volte che desideriamo lavorare con quella specifica sequenza dovremo semplicemente richiamarla dalla memoria. Fig.7.12: Conferma di aggiornamento del profilo E sufficiente premere su Sì. Ogni volta che variamo qualcosa sul profilo se desideriamo salvare la modifica dovremo nuovamente aggiornarlo Acquisizione dei fluorocromi Possiamo ora procedere all acquisizione dei fluorocromi. N.B.: Con i sistemi di cariotipizzazione e FISH automatici è fondamentale che i microscopi siano completi dei filtri corretti per i fluorocromi che vengono utilizzati. In particolare è indispensabile che i filtri siano selettivi per ogni fluorocromo. 7-5

104 E impossibile lavorare con filtri a doppia o a tripla banda a meno che non si spostino le eccitazioni d ogni fluorocromo. Con questa tecnica si ottengono ugualmente fluorescenze singole ma di intensità luminosa ridotta rispetto ai singola banda poiché comunque sia stiamo lavorando con un dicroico ed un barriera a tripla banda. E inoltre necessario precisare che con il sistema è possibile lavorare con microscopi in manuale oppure in automatico (se al microscopio sono collegate ruote filtri o microscopi motorizzati). Se il microscopio è manuale l operatore dopo ogni acquisizione di un singolo fluorocromo deve spostare il blocchetto corrispondente alla sonda successiva presente nella sequenza. Se invece ho una ruota filtri o un microscopio motorizzato è il sistema che seleziona la lunghezza d onda e presenta sul monitor l immagine live dei fluorocromi appartenenti alla sequenza. Per iniziare ad acquisire le immagini dobbiamo selezionare le icone di acquisizione: ( oppure ). A differenza delle altre modalità dobbiamo poi però utilizzare nuove funzioni per memorizzare le singole fluorescenze, in particolare il simbolo della macchina fotografica collocato sulla destra del nome d ogni fluorocromo. Prima di digitare il tasto di acquisizione dell immagine è necessario che le immagini siano ben contrastate ed eventualmente se necessario variamo i valori di set UP della TV CAMERA utilizzando le regolazioni a disposizione. Come per la fluorescenza dobbiamo valutare che l esposizione sia corretta (nella finestra delle regolazioni) altrimenti non vedremo sul monitor nessun immagine. Una volta ottenuto il contrasto corretto e messo a punto il fuoco dobbiamo salvare il set-up per il particolare fluorocromo in maniera tale che la successiva sequenza che andremo ad acquisire non avrà più bisogno di alcun aggiustamento. Se digitiamo sull icona della telecamera il sistema memorizza l immagine del primo fluorocromo (DAPI) mostra l immagine a destra in piccolo e passa al fluorocromo successivo. A questo punto è necessario spostare il blocchetto della fluorescenza (se il sistema è automatizzato lo farà da solo) e nuovamente dobbiamo controllare le regolazioni per il secondo fluorocromo. Anche in questo caso memorizziamo il valore delle regolazioni come abbiamo fatto per il primo fluorocromo. Dovremo fare queste operazioni per tutti i fluorocromi presenti nella sequenza poiché Genikon deve, almeno per la prima volta, memorizzare i valori di luce corretti per ogni probe. Al termine digitiamo sul simbolo di termine di acquisizione come accadeva per le altre modalità di acquisizione. 7-6

105 Genikon Il sistema mostra subito l immagine di composizione (denominata FH) che però se il preparato non è molto buono dovrà essere elaborata nella sottrazione della soglia. 7.2 Sottrazione della soglia per immagini Fish E importante eliminare il fondo da ogni fluorocromo (immagine) acquisito nella sequenza. Fig.7.13: Sottrazione del fondo da un'immagine acquisita sul counterstain Lo slide del contrasto funziona esattamente come nel campo chiaro o QFQ. Le altre icone invece hanno il seguene significato: : Annulla le zone definite in precedenza Aggiunge nuove ROI all immagine selezionata Cancella una ROI Quesa funzione rispetto al campo chiaro consente di disegnare le regioni di interesse con modalità diversa dalla mano libera E dunque possibile disegnare rettangoli, cerchi che facilitano la selezione di piccole spot. Questa icona consente di identificare con una sogliatura le soglie sottraendo in modalità automatica tutto il fondo. 7-7

106 Iniziamo dal counterstain poiché il sistema tiene in considerazione il fondo come soglia massima sul quale verrano poi adesi gli altri piani di fluorescenza. Fig.7.14: Sottrazione del fondo da un'immagine acquisita sul counterstain Solo sul counterstain è visibile tutta l immagie e solo sul counterstain possiamo filtrare e vedere il controno. Sempre e solo sul counterstain è possibile memorizzare il default per le cellule successive. Tutto ciò che non rientra nel counterstain e presente invece negli altri piani di fluorescenza verrà comunque non considerato dal sistema. Il sistema mostra i contorni relativi alla soglia ed al grado di separare degli oggetti presenti nel counterstain con la stessa modalità già osservata nel campo chiaro e per la fluorescenza (bande Q). Anche in questo caso possiamo aumentare il valore di soglia facendo attenzione a non sottrarre troppo dal contorno perché questo equivale ad eliminare anche segnali che stanno sui bordi dei cromosomi. (per esempio nel caso dei Telomeri). Una volta accettata la soglia per il counterstain possiamo analizzare quella relativa agli altri piani di fluorescenza. Fig.7.15: Selezione dei fluorocromi non COUNTERSTAIN A differenza del DAPI se andiamo a selezionare le singole componenti (in alto a sx dell immagine principale). Possiamo o agire in toto sull immagine muovendo lo slider o selezionando il range di lavoro. Invece sulle immagini dei singoli piani possiamo 7-8

107 Genikon selezionare singole regioni di interesse ed aggiungerle al piano singolo del fluorocromo intenificando o diminuendo la potenza di singoli spot. Per disegnare una regione disegnamo con il mouse lo spot ed agiamo successivamente sul contrasto. Fig.7.16: Prima della definizione della ROI Fig.7.17: definizione della singola ROI Quando la regione ha il giusto contrasto possiamo procedere ad aggiungerla utilizzando l apposita icona: Il sistema aggiunge solo le due spot della componente della fluorescina. 7-9

108 Possiamo disegnare altre zone ed aggiungere via via le singole spot. Al termine quando tutte le spot di nostro interesse sono trasferite digitiamo il tasto di assenso. Nel caso in cui non si desideri lavorare su singole spot è sufficiente sogliare tutta l immagine relativa a quello specifico piano di fluorescenza per modificare con un solo passaggio il contrasto ad esso relativo Quando tutte le componenti appartenenti alla lista di acquisizione sono state modificate ed elaborate accetiamo definitivamente la sogliatura utilizzando il tasto di consenso: In particolare e solamente su quest immagne (FISH) è possibile aggiustare eventuali shift avvenuti sull immagine causati da errori dell operatore o del microscopio. Se lo shift è fisso Fig.7.17 Calibrazione degli offset possiamo memorizzarlo sulla lista di acquisizione per avere la correzione effettiva ogni volta che catturiamo un immagine. In particolare l utilizzo delle frecce nere consente di spostare a dx,sx, alto e basso le spot sul counterstain. Quando è avvenuta la correzione possiamo selezionare la lista (SPECORANGE in questo caso) e salvare la variazione con il tasto di assenso. Fig.7.18 salvataggio delle modifiche Fig.7.19 Prima del riallineamento Fig.7.20 Dopo il riallineamento 7-10

109 Genikon Dobbiamo ricordare che Genikon consente di ritornare sempre sulla sogliatura. Per fare questo, è sufficiente ritornare al menu principale e digitare il tasto di destra con visualizza Fig.7.21 Sogliatura di immagini memorizzate E necessario fare attenzione poiché nel caso in cui sia stato eseguito il cariotipo l operazione di sogliatura cancella il cariotipo precedentemente creato. 7.3 Acquisizione 3D focus in Fish Questa funzione della Fish consente di eseguire acquisizioni in fluorescenza su più piani per i singoli fluorocromi immessi nella lista. L operatore deve decidere a priori quanti piani ed il relativo spessore che desidera acquisire; il sistema al termine dell acquisizione dei fluorocromi mostra le immagini dei singoli fluorocromi ognuna delle quali sarà costtuita dalla somma di tutti i piani focali identificati. La procedura è simile all acquisizione in FISH standard e per iniziare come per la FISH dobbiamo entrare nel menu di aquisizione dala Main toolbar: Fig.7.22 Introduzione alla Fish automatica 7-11

110 Prima di fare questo dobbiamo considerare che il sistema ricerca una telecamera che supporta il modulo (attualmente:cohu DS2Mcooled,HamamtsuORCA) ed un microsocpio che abbia lo spostamento automatico dei filtri (90i-Testa digitale +80i- 80i con fuoco prior); sarà dunque necessario che sotto al menu OPZIONI tali periferiche siano selezionate ed attive, altrimenti non sarà possibile procedere oltre. Fig.7.23 Configurazione hardware per FISH automatica 3Dfocus Digitando l icona seguente si entra in acquisizione nuova voce: e si apre il menu relativo alla sequenza dei fluorocromi alla quale si aggiunge una Fig.7.24 Attivazione fuoco automatico L attivazione del fuoco automatico prevede la creazione di fluorocromi ai quali l operatore ha assegnato : Colore 7-12

111 Genikon Filtro corrispondente di fluorescenza Numero di piani e spessore da acquisire Come in precedenza, nella fish standard, introduciamo le prime due voci relative al colore e filtro e decidiamo il numero di piani e lo spessore tra un piano e l altro da acquisire per quel particolare fluorocromo. Fig.7.25 Definizione numero di piani di acquisizione Quando il sistema si apre generalmente propone su un fluorocromo nuovo come default un numero di piani pari a 6 ed uno spessore tra un piano e l altro pari a 200 micron. Questi valori possono essere modificati dall operatore stesso in virtu del tipo di campione che desidera analizzare. Sarà infatti di solito necessario uno spessore maggiore sui tessuti ed uno minore sui campioni citologici. Al termine salviamo come sempre il fluorocromo. Possiamo ora creare una lista di acquisizione all interno della quale metteremo i piani di fluorescenza decisi. Prima di passare ad una acquisizione automatica dobbiamo però tenere conto di alcune cose: Quando il sistema passerà alla fase automatica non consentirà di modificare i livelli della camera che, come già sappiamo dalla FISH, per la prima volta che si inserisce un nuovo fluorocromo sono posizionati a zero. E dunque fondamentale richiamare la lista che abbiamo appena creato, disabilitare il fuoco automatico e procedere in manuale per ogni fluorocromo appartenente alla lista. 7-13

112 Controlliamo per ogni fluorescenza l immagine live e salviamo il set up della telecamera per fluorocromo. Ora siamo pronti per procedere con la fase automatica. Possiamo riabilitare l acquisizione su più piani di fuoco. Digitando l icona di fuoco automatico, in realtà si accede a tre distinte funzioni. La prima funzione serve per visualizzare in falsi colori, la seconda è relativa al fuoco automatico su più piani. La terza ed ultima funzione (individua spot) effettua una sottrazione automatica del fondo direttamente sull immagine somma di tutti i piani di fuoco. Fig.7.26Attivazione fuoco automatico A QUESTO PUNTO SIAMO PRONTI PER PROCEDERE CON UNA ACQUISIZIONE AUTOMATICA: Digitiamo la seguente Icona pe procedere:. Il programma in automatico farà le seguenti operazioni: Seleziona il filtro Apre lo shutter del microscopio Seleziona l esposizione e contrasto della camera Ricerca il piano focale migliore Acquisisce uno stack di immagini Elabora la serie di immagini e crea l immagine fusione dei diversi piani focali. Seleziona il fluorocromo successivo nella lista e ripete tutti i passi effettuati per il primo fluorocoromo. Durante la fase di acquisizione si mostra come viene svolto il processo ed è possibile, se l operatore lo ritiene opportuno, annullare con il tasto di STOP la sequenza. Quando tutti i fluorocromi appartenenti alla lista sono stati acquisiti il sistema si ferma e mostra l immagine di merge elaborata. Il trattamento di questa immagine sarà identica in tutte le fasi alla fish standard non automatica. 7-14

113 Genikon Fig.7.27 Visualizzazione del processo di acquisizione Fish 3D 7.4 Analisi della FISH L ambiente d analisi presenta in gran parte le stesse funzioni del campo chiaro e/o fluorescenza; una delle differenze fondamentali consiste invece nella presentazione delle immagini poiché nel caso della FISH si tratta di sequenze d immagini e non di singole immagini. Per spostare le immagini della metafase e dell immagine in pseudocolore o dell eventuale collage digitiamo il tasto di sinistra sull immagine che desideriamo invertire. Fig.7.28 Analisi d immagini FISH 7-15

114 Il programma consente di lavorare sulle due immagini principali: a) Immagine di Fusione che mostra tutte le componenti della sequenza insieme in overlay a colori. Su quest immagine se desideriamo lavorare possiamo anche selezionare le singole componenti utilizzando la lista dei fluorocromi in basso a destra. Se per esempio selezioniamo il DAPI possiamo modificare nel contrasto solo il DAPI oppure possiamo variare il colore nella barra strumenti che mostra la lista dei fluorocromi; Immagine contenente la somma delle tre singole. In questo caso il programma mostra un immagine alla volta secondo ciò che selezioniamo in alto a sinistra sulla finestra. Queste immagini possono essere in bianco e nero e/o a colori utilizzando la funzione di colore dalla toolbar d analisi. Anche in questo caso possiamo agire sulle singole componenti in modalità separata per aumentare il contrasto o migliorare il fuoco dell immagine. Solo su queste immagini singole e non su quella di fusione possiamo eseguire dei tagli e divisioni di cromosomi. E possibile inoltre eliminare delle strutture semplicemente selezionandole ed utilizzando la funzione "elimina". Esistono invece due funzioni che sono particolari dell ambiente d elaborazione d analisi FISH: Questa funzione ( ) consente di ottenere sull immagine di fusione il DAPI invertito (e comunque il fluorcoromo definito counterstain) con sopra i singoli segnali colorati: Fig.7.29 Immagine DAPI reverse La funzione abilitata dalla seguente icona:( ) consente di spostare la posizione di un fluorocromo rispetto ad un altro nel caso in cui ci sia stato dello shift durante la fase di acquisizione, già visto con la precedente funzione di calibrazione degli offset in acquisizione. E necessario selezionare (dalla lista dei fluorocromi) la componente che desideriamo spostare e poi digitare sulle frecce per muoverci lungo gli assi x ed y. 7-16

115 Genikon Nella FISH inoltre la funzione della gomma assume nuove peculiarità: Fig.7.30 Funzione della gomma Abilitando la funzione della gomma è possibile nell immagine in FISH agire su singole componenti del blu,verde e rosso per evitare di cancellare elementi gendo su una sola componente; per fare questo dobbiamo digitare col tasto sx del mouse sulla componente desiderata. Agendo così l eliminazione di elementi visibili è facilitata: Fig.7.31 Prima di agire sulla componente TRITC Fig.7.32 Dopo l azione sulla componente TRITC Terminata l elaborazione il sistema memorizza l immagine della FISH come FH anche se, quando andiamo ad analizzare la singola cellula dall ambiente di gestione del caso, potremo osservare l immagine di fusione più tante immagini quanti sono i fluorocromi acquisiti. Se per esempio la sequenza è DAPI, FITC, TRITC avremo: a) immagine di fusione (FH) b)immagine DAPI (DAPI) c) immagine FITC (FITC)d)TRITC Le singole componenti non sono eliminabili poiché appartengono alla stessa cellula. L immagine della FISH come quella del campo chiaro può essere stampata. E necessario però avere creato in precedenza un report di stampa dove sia stata caricata l immagine della FISH anziché quella del cariotipo o metafase o collage. Sull immagine della Fish è possibile costruire il cariotipo nella stessa modalità vista con il campo chiaro. 7-17

116 Fig.7.33Costruzione del cariotipo in FISH 7.5 Selezione delle motorizzazioni Nel caso in cui siano presenti dispositivi di motorizzazione è necessario selezionare quale è attivo. Utilizziamo nella sezione dedicata alle impostazioni la voce Acquisizione. Utilizziamo dunque la funzione OPZIONI dal menu principale ed apriamo il sotto menu d Acquisizione. Fig.7.34Menu d acquisizione delle OPZIONI Per valutare gli altri menu ed avere maggior dettagli vedere il capitolo N.15 delle personalizzazioni.il menu consente di selezionare la telecamera con la quale stiamo lavorando, il microscopio, la ruota filtri ed è possibile inoltre direttamente configurare sia la ruota filtri che il microscopio motorizzato (vedi capitolo N.15). In questa fase d acquisizione in FISH è sufficiente selezionare le varie voci. Se abbiamo una ruota filtri è necessario comunicare al sistema che modello è presente e selezionare la porta di connessione. In presenza di un microscopio motorizzato selezioniamo il modello, come nell esempio 90i. Nel caso in cui il sistema sia collegato con un microscopio motorizzato non dovremo cambiare posizione ai blocchetti passando da un fluorocromo ad un altro perché è il sistema che si sposta in automatico. Non sarà neppure necessario chiudere il percorso 7-18

117 Genikon della fluorescenza al termine della sequenza perché anche lo shutter è gestito automaticamente. La stessa cosa accade con la ruota motorizzata che posiziona i filtri d eccitazione per ogni fluorocromo ed al termine si mette in posizione di blank (chiuso). N.B.:Nel setup della telecamera è anche possibile mettere ON_OFF la ruota filtri nel caso in cui si desideri lavorare con un blocchetto a singola banda anziché con il filtro dicroico e barriera della ruota. Per quanto riguarda la Configurazione dei filtri andiamo al capitolo N Valutazione dell intensità delle fluorescenze L accesso è reso possibile dalla pressione della seguente icona:, la funzione risulta attiva solo con l immagine FISH disposta in primo piano, sia a piccolo schermo che a grande schermo. La pressione del pulsante in oggetto provoca l apertura del form DENSITÀ OTTICA INTEGRATA IN FISH: Fig.7.35 valutazione delle fluorescenze Il form in esame è così strutturato: ELEMENTO FORM DESCRIZIONE 7-19

118 Visualizzazione, in formato ALBERO GERARCHICO, delle coppie VETRINO-CELLULA del caso corrente per le quali esistono delle misure di densità memorizzate. Al momento dell apertura del form, il FOCUS è disposto in automatico sulla cellula e vetrino corrente. Prospetto delle misure eseguite e/o memorizzate. Le prime tre colonne, in colore nero, mostrano la misura di TRASMISSIONE (T = LUCE TRASMESSA/ LUCE INCIDENTE) eseguita per ciascuna componente del profilo all interno della regione d interesse. Le seconde tre colonne, in colore rosso, mostrano le misure di DENSITÀ OTTICA INTEGRATA (OD = - LOG10 T). Il numero di colonne visualizzato dipende dal numero di fluorocromi che compone il profilo d acquisizione della cellula. Il sistema NON consente l impiego del modulo con cellule acquisite con profili composti da più di sei fluorocromi. Pannello di selezione della modalità di tracciamento della ROI d interesse. Pulsante per salvataggio dati. Il salvataggio è relativo alle sole ROI tracciate per la cellula corrente. Pulsante per accesso al REPORT riassuntivo del caso in oggetto. Pulsante per esportazione, in formato PDF o EXCEL del REPORT. L apertura del form abilita il tracciamento delle ROI sull immagine FISH secondo la modalità impostata su pannello. Al termine del tracciamento il sistema esegue in automatico il calcolo delle misure e la loro visualizzazione nella lista. Per ogni nuova ROI tracciata, la 7-20

119 Genikon lista si incrementa di una riga, nell ipotesi in cui i dati ottenuti non siano d interesse è possibile rimuoverli deselezionando il check associato e quindi premendo il pulsante di salvataggio. Fig.7.36 Memorizzazione dei valori di densità ottica La rimozione dei dati comporta in automatico un aggiornamento dell immagine FISH sulla quale viene mantenuta traccia delle sole ROI memorizzate. La selezione di una fra le righe in lista comporta l evidenziazione con colore rosso della ROI associata sull immagine FISH. La funzione in oggetto, così come la possibilità di tracciare ROI su immagine FISH e il salvataggio dati, è attiva solo ed esclusivamente nell ipotesi in cui si mantenga il FOCUS, a livello di ALBERO GERARCHICO, sulla cellula corrente. Nel caso in cui l utente desideri visualizzare le misure eseguite a livello vetrino o a livello di caso, esso è tenuto spostare il FOCUS all interno dell ALBERO GERARCHICO. La lista visualizzata, poiché non è più riferita alla cellula corrente, sarà priva dei check di selezione. Il REPORT associato in automatico dal sistema organizza al suo interno i dati relativi all intero caso suddividendoli per vetrino e cellula: 7-21

120 Eventuali elaborazioni incrociate sui dati memorizzati sono rese possibili esportando il tutto in formato EXCEL e quindi elaborando i dati nel foglio elettronico di lavoro ottenuto. 7-22

121 Genikon 8 CGH 8.1 Introduzione L Ibridazione Genomica Comparativa è una tecnica citogenetica relativamente nuova utilizzata per individuare aberrazioni cromosomiche sbilanciate. La CGH permette di analizzare, per mezzo di una singola ibridazione l intero genoma evidenziando amplificazioni o delezioni di regioni cromosomiche in cui potrebbero essere localizzati geni aventi un ruolo nello sviluppo e nella progressione dei tumori. La CGH consiste dunque nell ibridazione competitiva di metafasi di cromosomi umani normali con due differenti DNA genomici (DNA tumorale e DNA normale), marcati con due diversi fluorocromi per esempio verde (fluorescina) e (rosso rodammina).per mezzo di tale ibridazione la differenza delle quantità dei DNA legati ai cromosomi,viene evidenziata dal rapporto dell intensità della fluorescenza lungo ogni cromosoma metafasico, mostrando quali regioni del genoma tumorale sono guadagnate o perse. Per eseguire la tecnica è possibile utilizzare DNA genomico estratto da campioni criopreservati o da tessuti inclusi in paraffina, permettendo così di effettuare studi di tipo retrospettivo utili per evidenziare marcatori biologici correlabili con la prognosi della malattia. Tale metodica ha inoltre il vantaggio di impiegare quantità minime di DNA estratto da biopsie o da agospirati. Con il programma devono essere dunque acquisite per ogni singola cellula le immagini del DAPI, della FITC e della Rodammina sulle quali automaticamente il sistema esegue sottrazione del fondo e valutazione del rapporto delle fluorescenze del DNA test e di riferimento, sui cariotipi delle cellule. Generalmente per convenienza si marca il counterstain in DAPI, la FITC si utilizza per il TEST e la rodammina per il DNA di riferimento. Risulta dunque evidente che per procedere ad analizzare campioni in CGH, l operatore deve avere familiarità con il programma di cariotipizzazione e con quello della FISH per procedere oltre. Inoltre le nozioni base su come gestire il caso in esame devono essere ben chiare; si consiglia dunque di esaminare i primi capitoli del manuale (gestione del caso, acquisizione e cariotipizzazione) prima di procedere oltre con il programma della CGH. 8-1

122 8.2 Acquisizione immagini in CGH Fig.8.1: Menu d Acquisizione per CGH Nella Comparative Genomica Hybridisation è necessario acquisire tre fluorocromi, dobbiamo procedere dunque come per una normale acquisizione in FISH. Dopo aver creato il caso (controlliamo che siano contenute solo cellule per analisi in CGH poiché non è corretto mescolare la CGH con altri tipi di immagine per la seguente media sui profili delle cellule), passiamo al menu di Acquisizione e selezioniamo l icona della CGH. Normalmente per evitare shift avremo delle periferiche (ruote o motorizzazioni) controlliamo che la lista dei fluorocromi creati sia definita correttamente ed i fluorocromi siano associati alla periferica idonea; carichiamo dunque la lista corretta per la CGH. (sarà DAPI FITC e TRITC). A questo punto digitiamo, come in FISH, prima sul DAPI poi sulla FITC ed infine sulla TRITC, terminiamo quindi l acquisizione. Il sistema passa a mostrare la soglia da sottrarre dall immagine del DAPI. IN LIVE: esiste la possibilità d interruzione ACQUISIZIONE in qualsiasi momento. Non è necessario acquisire TUTTI i fluorocromi presenti nel profilo. L interruzione del processo di acquisizione è resa possibile dalla pressione del pulsante l annullamento dell intera sequenza. e comporta 8.3 Sottrazione della soglia in CGH La sottrazione della soglia segue le solite procedure di sottrazione del fondo. Spostiamo la barra verso destra per aumentare il fondo, il sistema mostra i bordi dei contorni dei cromosomi più vicini. E possibile anche selezionare ROI. 8-2

123 Genikon Fig.8.2: Sottrazione soglia in CGH 8.4 Aggiustamento dello shift Fig.8.3:Immagine prima della correzione Fig.8.4:Immagine dopo correzione E fondamentale almeno per la prima volta controllare che le immagini non siano spostate (shift) e per ovviare sono forniti gli offset che consento di centrare nuovamente i due fluorocromi (TRITC e FITC) rispetto al DAPI. Sull immagine del DAPI, possiamo definire la soglia (è il fondo che si sottrae a tutte le immagini) e la luminosità. Il sistema automaticamente normalizza tutte e tre le acquisizioni. 8-3

124 Digitando il tasto d assenso comunichiamo al sistema di procedere alla valutazione dell acquisizione. Al termine il sistema mostra se accetta o no la metafase acquisita e consente di valutare i parametri d acquisizione. 8.5 Parametri di controllo per Acquisizione in CGH Fig. 8.5: Parametri di controllo della CGH Con la voce Distribuzione, per quanto riguarda il counterstain, si valuta la bontà della metafase acquisita. Una metafase è buona per l analisi CGH se i cromosomi sono ben separati ed il rapporto tra lunghezza dei cromosomi e larghezza è elevato. Sia per il DNA test che per quello di riferimento avremo i seguenti controlli: Granularità indica che un valore alto è dato da un rumore ad alta frequenza che affligge l immagine e si verifica con scarsa omogeneità d ibridazione. La voce Variazione valuta il coefficiente di variazione dell intensità della fluorescenza dell immagine. Per una buona analisi in CGH i cromosomi devono risultare intensi ed omogenei, quindi la varianza deve essere la più bassa possibile. Rapporto segnale/fondo valuta il rapporto tra l intensità degli oggetti rispetto all intensità dello sfondo. Omogeneità valuta l omogeneità del campo che indica normalmente la corretta illuminazione del campo. L operatore può decidere se la valutazione del sistema è corretta oppure se desideriamo forzare il sistema nel caso in cui il sistema abbia scartato una cellula digitiamo ugualmente l assenso e procediamo all analisi. 8-4

125 Genikon 8.6 Elaborazione d immagini in CGH Fig.8.5 Menu d Elaborazione della CGH Per ottenere i profili relativi al rapporto del DNA Test e del DNA di riferimento per prima cosa dobbiamo eseguire sull immagine della metafase del DAPI (lo standard) REVERSE il cariotipo utilizzando gli stessi tools del campo chiaro. In vero il cariotipo può essere anche costruito e si può lavorare sull immagine della metafase in fluorescenza senza invertire il DAPI. Questo dipende da come l operatore è abituato a riconoscere i cromosomi.per separare (le sovrapposizioni nel caso della CGH devono essere scartate in quanto non idonee ad un successivo esame) i cromosomi, utilizziamo tutte le funzioni già viste per cariotipizzare campioni di campo chiaro. Creiamo poi il cariotipo ed aggiustiamo eventuali errori. Se vogliamo lavorare sull immagine del fluorocromo DAPI reverse digitiamo la seguente l icona : Utilizzando sull immagine il filtro dei contrasti per bande Q l immagine sarà ulteriormente migliorata: Fig.8.6:Immagine DAPI Fig.8.7 Dapi Reverse 8-5

126 8.7 Analisi dei risultati in CGH Fig.8.8: Menu d Analisi dei profili della CGH Selezioniamo sul foglio del cariotipo la voce Risultati della CGH, la Toolbar Principale varia e mostra nuove ICONE che consentono di analizzare i dati ottenuti in maniera dettagliata. (stanno tutte sotto la voce aspetto poiché consentono di visualizzare in modalità diverse i profili ).Esistono diverse modalità per visualizzare i dati utilizzando i folder posti in alto a sinistra del cariotipo. Digitando le voci DAPI-FITC e TRITC è possibile visualizzare le singole acquisizioni dei tre fluorocromi. Con gli altri possiamo invece analizzare i risultati in modalità differenti: Fig.8.9 Ratio Fig.8.10 Ratio in reverse 8-6

127 Genikon Nella Fig.8.9 ed 8.10il sistema mostra il materiale in amplificazione o delezione direttamente sui cromosomi e in DAPI reverse. Si accede a quest'immagine selezionando RATIO dal folder in alto sulla finestra principale. RATIO2 mostra invece l immagine dei cromosomi in FISH standard con blu verde e rosso sovrapposti è presente anche il DAPI ma le componenti possono essere selezionate singolarmente. Fig.8.11 Pseudocolore (Ratio2) Nella a figura 8.9 si mostrano i valori del ratio rappresentato in blu come normale, rosso perdita di materiale e verde aumento. (l esempio in figura è una leucemia). Infine in figura 8.12 sono rappresentati i risultati della CGH con i profili delle distribuzioni dei rapporti lungo l asse del cromosoma; si accede attraverso la voce RISULTATI della CGH: Fig.8.12 Profili del RATIO lungo l asse 8-7

128 Nell immagine 8.11 i profili sono estratti da una media eseguita su un complessivo di 23 cellule. Ricordiamo che per la tecnica CGH è importante eseguire la media su un alto numero di cellule infatti da questo deriva il valore di confidenza dell esame che varia dal 95% (meno di 15 cellule) al 99% se si lavora con 100 cellule. Anche in quest immagine si nota che i profili passano dalla parte centrale del grafico senza espandersi né verso il rosso né verso il verde in quanto il campione è normale. Esistono diverse modalità di visualizzazione dei profili. A tali modalità si accede mediante le nuove icone che si aprono selezionando appunto la voce Risultati CGH. La prima icona consente di definire il SET UP: Fig.8.13 Impostazioni grafici dei profili Selezionando la voce Profili: Il sistema consente di mostrare i profili dei rapporti delle fluorescenze lungo l asse del cromosoma : a- cromosoma rappresentato sul cariotipo a sinistra b- cromosoma rappresentato sul cariotipo a destra c- media della coppia dei due omologhi d- Media sui due omologhi della classe di tutte le cellule del vetrino e- Media delle cellule di tutti i vetrini Sulla parte sinistra viene invece si mostra in anteprima il grafico della distribuzione del profilo. L Ampiezza consente di ingrandire il profilo Centro di posizionare il profilo 8-8

129 Genikon La voce Intervallo consente di definire il range dei valori da 0 a 2. I valori di default sono da 0,75 ad 1,25. Il posizionamento del profilo su uno indica perfetta normalità senza né amplificazione né delezione. La modifica di questo valore influenzerà unicamente la visualizzazione dei profili senza modificare il valore della fluorescenza rilevata. Il range di confidenza può essere fissato al 99% o 95% (indica il range all interno del quale si ritrovano il 95% o il 99% degli oggetti esaminati). La seconda icona consente di analizzare singolarmente ogni classe d omologhi mostrando le singole fluorescenze (Dapi,FITC,TRITC) e l immagine del ratio. Fig.8.13 Icona visualizzazione dei singoli cromosomi Il colore blu indica normalità con ratio 1, rosso indica ratio<1 delezione e verde >1 amplificazione. Per ultimo si mostra invece come appare il ratio del profilo appartenente alla singola classe d omologhi. E inoltre possibile mostrare anche in contemporanea l ideogramma della classe in esame. Nella visualizzazione è consentito analizzare in contemporanea 2 differenti cromosomi in contemporanea. La terza icona consente di eseguire un analisi statistica dei profili relativi ai vetrini acquisiti. Apre automaticamente il seguente menu: Fig.8.14 Analisi dei profili 8-9

130 E necessario introdurre la classe del cromosoma che desideriamo analizzare per esempio classe 3, specifichiamo il valore del range di lavoro, da 0,75 a 1,25 sarà lo standard. Sullo stesso grafico sono mostrate in contemporanea la perdita ed il guadagno. Con la barra (utilizzando il tasto di sinistra del mouse) possiamo portarci su quella che desideriamo analizzare e controllare per osservare se esiste perdita o aumento del DNA. Se desideriamo osservare separatamente le perdite o l aumento del DNA è necessario digitare l'icona seguente che mostra alternativamente valori. Fig.8.16 Separazione a dx e sx aumenti e perdite Per analizzare insieme o separatamente i due omologhi dobbiamo utilizzare l icona seguente (vale anche per i profili): Fig.8.18Unione aumenti e guadagni Infine per analizzare i profili del ratio utilizziamo: Fig.8.17 Visualizzazione dei profili Automaticamente il sistema mostra i profili delle distribuzioni delle fluorescenze. 8-10

131 Genikon Anche sui profili è possibile posizionare la barra di controllo per vedere su quale banda esiste la variazione. I profili inoltre possono essere analizzati separatamente tra cromosoma di destra e quello di sinistra. Il profilo sul singolo cromosoma mostra l andamento del rapporto. Se il profilo infatti passa tutto dalla linea centrale vorrà dire che il cromosoma è normale. Se invece il profilo si sposta verso il verde o il rosso avrà aumento o perdita di DNA. 8.8 INTERPRETAZIONE DEI PROFILI E importante definire il livello di confidenza. Se lavoriamo con oltre cento cellule cariotipizzate possiamo avere il 99% se invece lavoriamo con un numero di 15 cellule, il livello di confidenza scenderà a 95%. Il profilo sul singolo cromosoma mostra l andamento del rapporto. Se il profilo infatti passa tutto dalla linea centrale vorrà dire che il cromosoma è normale ed il rapporto è 1. Se invece il profilo si sposta verso il verde o il rosso avrà aumento o perdita di DNA. Se per esempio abbiamo una trisomia sul DNA TEST, un ratio di 3(test):2(controllo) o 1.5:1 dobbiamo allora aspettarci 1.5:1 dobbiamo allora aspettarci nell area amplificazione. Nel caso di una monosomia invece dovrebbe essere 0.5:1. Questi ratio lavorano con DNA puramente tumorale ed i valori del default di 1,25 per amplificazione e 0,75 per delezione sono fissati per compensare questa contaminazione. Se invece il rapporto del campione è 50:50 di tumorale rispetto al normale dobbiamo calcolare nuovamente il ratio. La CGH, come il campo chiaro la fluorescenza e FISH, è gestibile anche a FULL SCREEN utilizzando l icona seguente: 8-11

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133 Genikon 9 Analisi in Multiplex FISH La tecnica della Multiplex Fish si avvale dell acquisizione di 5 immagini di una metafase marcata in fluorescenza con fluorocromi specifici (+ dapi per il counterstain). Le immagini acquisite singolarmente, mediante l utilizzo di filtri specifici sul microscopio, sono successivamente fuse mediante sistemi computerizzati per realizzare una singola immagine composta. All interno dell immagine di fusione, ad ogni singola coppia d omologhi è associato un colore specifico derivante dalla sua composizione nei flurorofori. La composizione in % di fluorocromo per la singola coppia di cromosomi è assegnata in base al KIT che si utilizzato.per l analisi in Multiplex Fish valgono le considerazioni svolte nell ambito dell analisi in FISH.Anche in questo tipo d analisi, il sistema acquisisce immagini monocromatiche per ogni singolo fluorocromo imponendo ad ogni componente uno pseudocolore definito in precedenza dall operatore.il programma della multiplex Fish è integrato nella stazione con quello della cariotipizzazione e FISH standard ed utilizza infatti gran parte delle funzioni che abbiamo già esaminato per il campo chiaro la fluorescenza e la FISH. La gestione dei casi è identica alle altre due modalità d acquisizione mentre nella fase d acquisizione si osservano alcune peculiarità che facilitano l operatore ad acquisire sequenze d immagini corrispondenti ai singoli fluorocromi. 9.1 Acquisizione d immagini in Multiplex L ambiente della MULTIPLEX FISH si abilita nel momento in cui in fase d acquisizione si seleziona la seguente icona : Definizione della lista dei fluorocromi e della mappa associata Per la creazione e definizione della lista fluorocromi si procede in modo analogo a quanto descritto nel paragrafo nell ambito della FISH. Alla lista dei fluorocromi il sistema associa in automatico una mappa in cui l operatore è tenuto a trascrivere le combinazioni dei fluorocromi valide per l identificazione delle classi d appartenenza dei cromosomi. La documentazione a corredo del KIT impiegato fornisce all utente tutte le indicazioni necessarie. 9-1

134 Nell ipotesi in cui siano specificate nella documentazione le componenti RGB degli pseudocolori da associare ai fluorocromi è possibile, in fase di definizione del fluorocromo, selezionare il corretto colore richiamando l apposito menu (fig. 9.1 ): Fig Selezione del colore dei fluorocromi Una volta definita la lista dei fluorocromi si accede alla finestra d impostazione del KIT mediante il tasto. Per ogni classe d omologhi, l utente deve indicare la corretta combinazione dei fluorocromi. Sulle colonne sono indicate le etichette di classe valide per la specie in esame, sulle righe sono riportati i nomi dei fluorocromi costituenti la lista attiva. Un semplice click con il tasto sinistro del mouse sulla casella d intersezione RIGA COLONNA inserisce un DOT di selezione (Fig.9.2.). Fig.9.2 Dot di selezione della componente sulla coppia d omologhi Fig.9.3 Impostazione del kit per la Multiplex Fish Il tasto: è da utilizzarsi al termine per convalida. 9-2

135 Genikon Nell ipotesi in cui l operatore abbia commesso un errore d impostazione della tabella, il sistema indica l errata o parziale configurazione del KIT al momento della convalida. Il sistema non permette di introdurre la stessa composizione in fluorocromi per due diverse coppie d omologhi. Il tasto di sinistra del mouse digitato su un singolo quadrato in colore consente di associare un colore specifico ad ogni classe d omologo Fig.9.4 Impostazione colore specifico per ogni classe d omologhi Fig.9.5 Selezione del colore specifico Con quest operazione si associa a ciascuna classe un falso colore calcolato sulla base dei fluorocromi marcatori e degli pseudocolori ad loro associati. La scelta di quest opzione di lavoro permette di mantenere una congruenza fra i colori visualizzati nelle immagini in pseudocolore e quelle ottenute per elaborazione. Il ripristino dei colori di DEFAULT è reso possibile dalla pressione del tasto La cancellazione delle impostazioni è eseguibile mediante il pulsante Nell ipotesi in cui il KIT impiegato preveda una diversa combinazione dei fluorocromi per il braccio p e q di una stessa classe, è possibile scindere le due componenti eseguendo un click con il tasto sinistro del mouse sull etichetta della colonna (Fig. 9.6). 9-3

136 Fig.9.6 Kit con distinzione braccio p e braccio q 9.2 Acquisizione dei fluorocromi Per l acquisizione dei fluorocromi si procede in modo analogo a quanto indicato, nell ambito della FISH. La lista dei fluorocromi è creata in base al Kit d utilizzo è chiaro che se non si ha una lista di fluorocromi corretti anche la mappa non potrà essere creata e in ogni modo la mappa utilizza gli stessi fluorocromi inseriti nella lista. Nel caso del KIT Vysis i fluorocromi sono : DAPI-Spectrum green-spectrum Orange-Far red-aqua-gold. E importante creare la lista con una sequenza che consenta di acquisire per primo il GOLD, sarà il fluorocromo col qual è possibile ricercare le metafasi. Non dobbiamo osservare o ricercare mai con il DAPI poiché fa decadere irreversibilmente il FAR RED. Primo dunque Gold, secondo segue sempre il FAR red per evitare il decadimento ed infine è consigliabile ma non obbligatorio mettere in sequenza Spectrum green, Spectrum orange, Aqua ed infine DAPI. Ricordiamoci comunque, anche se viene acquisito per ultimo, di assegnare DAPI come counterstain, perché è l immagine DAPI quella di riferimento ed è quella sulla quale il sistema andrà ad unire i 5 successivi fluorocromi. Per cambiare il counterstain è sufficiente digitare due volte col tasto sinistra del mouse sulla sx del fluorocromo prescelto. Per un KIT VYSIS la sequenza sarà dunque la seguente: 9-4

137 Genikon Fig.9.7 Lista fluorocromi KIT Vysis Una volta creata la lista possiamo procedere ad acquisire come una normale FISH selezionando i 6 fluorocromi e terminando come per una normale FISH. Al termine dell acquisizione la pressione del tasto di stop dell operazione d acquisizione apre una sessione di lavoro in cui l operatore definisce il corretto valore di soglia dell immagine DAPI e l eventuale SHIFT da applicare ad ogni fluorocromo : Fig.9.8 Definizione della soglia in Multiplex fish Una volta corretta la soglia (normalmente si esegue una sola volta) ed eventualmente il posizionamento degli shift come avevamo visto anche per la CGH, possiamo dare l assenso al sistema per creare l immagine della metafase in Multicolor. Generalmente lo 9-5

138 shift non è presente in quanto per la Multifish abbiamo un microscopio motorizzato che normalmente non contiene aberrazioni. L allineamento eventuale deve essere fatto su ogni singolo piano di fluorescenza. Il sistema impiega qualche secondo per associare ad ogni coppia le giuste componenti di colore. Al termine mostra nel Menu d elaborazione l immagine della metafase in Multicolor 9.3 Elaborazione ed analisi Multiplex FISH Fig.9.9 Immagine in M-fish (MFISH2) La visualizzazione non è molto diversa dalla FISH. Sulla finestra principale si possono scambiare per la visualizzazione le sei singole immagini relativi ai piani di fluorescenza mentre nella galleria già sono visualizzate in singola immagine. Ciò che personalizza la Mfish, è la presenza di due nuove visualizzazioni che corrispondono alla MFISH1 e MFISH2. MFISH1 è lo pseudo-colore associato dal sistema ad ogni coppia d omologhi in base al criterio del kit in uso. MFISH2 è l immagine della sovrapposizione dei sei fluorocromi in base ai colori assegnati nella lista d acquisizione. E importante deselezionare (utilizzando l icona in alto a dx sulla finestra principale) la componente del DAPI che non apporta informazione ma serve solo per riconoscere e separare successivamente i cromosomi. La selezione della componente del DAPI in questa fase di visualizzazione introduce solo motivo di disturbo e falsa l immagine. 9-6

139 Genikon Fig.9.10 Immagine in Mfish (MFISH1) La MFISH1 è invece l immagine in colori assegnati dal sistema che non corrispondono necessariamente a quelli della MFISH2. Sono falsi colori e spesso consentono di evidenziare parti di cromosomi in maniera rapida e sicura. A questo livello in ogni modo ciò che interessa è passare alla creazione del cariotipo. La procedura standard prevede di selezionare l acquisizione del DAPI e di utilizzare il REVERSE per facilitare il riconoscimento e la divisione dei cromosomi. Comunque se l utente lo desidera è possibile cariotipizzare anche sul DAPI a colore. Fig.9.11 Immagine in DAPI reverse La procedura di separazione dei cromosomi è sempre la stessa già utilizzata con il campo chiaro, la fluorescenza e la CGH. Il sistema offre la Toolbar completa per migliorare l aspetto dei cromosomi ed effettuare la separazione. 9-7

140 Fig.9.12 Toolbar d Elaborazione in M-FISH N.B. Come per la CGH è ovvio che non sia corretto utilizzare cromosomi in sovrapposizione poiché nei punti d overlapping il risultato è falsato. Una volta separati tutti i cromosomi possiamo procedere alla creazione del cariotipo utilizzando la funzione di cariotipo automatico. L operatore può aggiustare in qualsiasi momento la posizione dei cromosomi. Fig.9.13 Cariotipo in M-FISH Al termine della creazione del cariotipo sono offerte alcune funzioni speciali per analizzare il cariotipo di una M-FISH. In particolare si offre nella toolbar una nuova icona che consente di aprire la Mappa dei fluorocromi: 9-8

141 Genikon Questa funzione è importante perché apre sotto all immagine del cariotipo la mappa dei fluorocromi. L abilitazione della mappa dei fluorocromi abilita nuove funzioni specifiche per la M-FISH. a)sia che si sia in visualizzazione della MFISH1 che MFISH2 se eseguo una selezione su una coppia di omologhi, il sistema mostra l immagine in bianco e nero con in overlay il colore di appartenenza di quel dato cromosoma. Per esempio in figura 9.14 abbiamo selezionato la Coppia d omologhi N.2 ed il sistema mostra che una parte del braccio p del N.2 è traslocata sul q del 3. Fig.9.14 Selezione di una coppia di omologhi in multicolor Tenendo premuto il tasto ctrl possiamo selezionare più di 2 cromosomi alla volta Fig.9.14 Selezione multipla 9-9

142 b)inoltre se passiamo sui singoli cromosomi sia in metafase che sul cariotipo si visualizza il numero di appartenenza, nel caso in cui sia aperta la Mappa Fig.9.15 Visualizzazione della componente d appartenenza b) Se infine selezioniamo in basso il colore possiamo variare lo pseudocolore di appartenenza della classe In particolare possiamo osservare il default relativo al kit Fig.9.16 Visualizzazione del default Oppure quello previsto dallo pseudocolore Fig.9.17 Visualizzazione del colore reale 9-10

143 Genikon Se vogliamo variare alcuni cromosomi dobbiamo utilizzare la solita voce del colore relativa ad un singolo cromosoma. Clicchiamo sul tab del colore sotto ai singoli cromosomi. Fig.9.18 Variazione dello pseudocolore della classe d appartenenza 9.4 Analisi dei singoli cromosomi in MFISH Anche per la multicolor come per la CGH e la FISH viene data l opportunità di analizzare i singoli crosmomi in dettaglio utilizzando l icona seguente dalla Toolbar principale: La visualizzazione è simile alla CGH. Il sistema consente di analizzare in contemporanea 2 coppie di omologhi e di rappresentare rispettivamente tutti i singoli piani della fluorescenza, l immagine della MFISH1 della MFISH2 ed il profilo somma di tutti i piani di fluorescenza: 9.18 Analisi dei singoli cromosomi 9-11

144 Anche per la Mfish come per la CGH possiamo variare la dimensione dei cromosomi, scambiare il cromosoma dx col sx ed analizzare con la linea bianca ogni singola banda identificazione delle bande 9-12

145 Genikon 10 Ideogrammi Gli ideogrammi possono essere visualizzati con tre differenti valori di risoluzione (450, 550, 850). Ad ogni click per impostare la risoluzione, gli ideogrammi sono aggiornati in automatico nella finestra di visualizzazione. La selezione dell opzione consente di visualizzare gli stessi ideogrammi in bande R. E possibile visualizzare in automatico tutte le bande presenti sull ideogramma oppure in alternativa possiamo vedere le bande singole passando con il mouse sull ideogramma a sinistra. E possibile copiare un ideogramma sul cariotipo o su un immagine di composizione per confrontare cromosomi all ideogramma. Fig.10.1.: Ideogrammi 10.1 Anomalie Nell ambiente in esame è possibile creare e successivamente archiviare le aberrazioni cromosomiche d interesse. 10-1

146 Fig.10.2 Anomalie ideogrammi Per trasferire l anomalia ottenuta al collage o metafase o cariotipo è sufficiente utilizzare il tasto di sx premuto sull ideogramma e spostare il mouse da sx a dx Editing anomalie 1. Nella sezione ANOMALIE selezionare l aberrazione da comporre. 2. Sulla base dell aberrazione scelta selezionare nelle sezioni IDEOGRAMMA 1 e IDEOGRAMMA 2 la classe dei cromosomi coinvolti. La banda o l intervallo di bande interessate sono identificate dalle frecce ETICHETTA BANDA MOBILI presenti a lato degli ideogrammi. Le scelte eseguite nelle due sezioni di editing comportano un aggiornamento in automatico dell etichetta descrittiva dell anomalia. Fig Etichetta anomalia La pressione del pulsante "mostra" nella sezione RISULTATO mostra l aberrazione Il sistema esegue in automatico la composizione dell ideogramma o degli ideogrammi risultanti per le anomalie di seguito indicate: Anomalia Espressioni Descrizione 10-2

147 Genikon DELEZIONE INVERSIONE del (Cl) (Bnd1) del (Cl) (Bnd1 Bnd2) inv (Cl) (Bnd1 Bnd2) Eliminazione terminale Eliminazione interstiziale ovvero del tratto di bande comprese fra Bnd1 e Bnd2 Inversione del tratto di bande comprese fra Bnd1 e Bnd2 TRASLOCAZIONE t (Cl1; Cl2) (Bnd1; Bnd2) Traslocazione dup (Cl) (Bnd1) Duplicazione unica banda DUPLICAZIONE INSERZIONE dup (Cl) (Bnd1 Bnd2) Duplicazione del tratto di bande comprese fra Bnd1 a Bnd2 inv dup (Cl) (Bnd1 Bnd2) Duplicazione ed inversione del tratto di bande comprese fra Bnd1 a Bnd2 ins (Cl1; Cl2) (Bnd; Bnd1 Bnd2) Inserzione del tratto da Bnd1 a Bnd2 di Cl2 al posto della banda Bnd in Cl1 inv ins (Cl1; Cl2) (Bnd; Bnd1 Bnd2) Inserzione ed inversione del tratto da Bnd1 a Bnd2 di Cl2 al posto della banda Bnd in Cl1 Tabella 10 Aberrazione automatiche E possibile trasferire su cariotipo, metafase o su composizione l ideogramma ottenuto nella sezione RISULTATO. Per l ideogramma copiato è attiva in automatico la visualizzazione dell etichetta descrittiva dell anomalia. In base alle esigenze è possibile modificare in tempo reale la visualizzazione degli ideogrammi selezionando la risoluzione desiderata (400, 550, 850), il tipo di bandeggio (R) oppure il colore da associare alla sezione anomala dell ideogramma risultante Archiviazione anomalie Nella sezione ARCHIVIO ANOMALIE è possibile memorizzare l anomalia ideogrammi avvalendosi del pulsante aggiungi. La selezione del tipo d aberrazione eseguita nella sezione ANOMALIE, attiva una ricerca automatica il cui esito è visualizzato nella finestra della sezione d ARCHIVIO. Nell elenco visualizzato la selezione di una delle voci comporta la generazione dell ideogramma anomalo. L eliminazione di una delle voci d elenco è resa possibile, previa selezione, dall impiego del tasto elimina. 10-3

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149 Genikon 11 Foglio di lavoro Il foglio di lavoro è un documento correlato alla Conta cromosomica, all Analisi visiva (appaiamento degli omologhi) ed al Cariotipo eseguito sul caso specifico. L icona seguente abilita l apertura del foglio di: ed è collegata al Menu principale. Tale icona è in ogni modo accessibile anche dal Menu d Elaborazione e da quello d acquisizione. Fig.11.1: Il Foglio di lavoro L inserimento dei dati sul modulo è eseguito manualmente dall operatore ed il foglio costituisce il corrispettivo di quello cartaceo che normalmente è utilizzato nei laboratori di citogenetica. Il foglio di lavoro di lavoro è strettamente associato all archivio infatti è possibile digitando col tasto sx del mouse su una delle voci di intestazione delle colonne selezionare un campo specifico: Fig.11.2 Associazione dei campi al foglio di lavoro 11-1

150 Se le voci sono associate le intestazioni delle colonne diventano rosse. Fig.11.3: Associazione dei campi al foglio di lavoro Se anziché digitare il tasto sx utilizziamo il dx sull intestazione, il sistema consente di introdurre una specifica personalizzata dall operatore aprendo un menu specifico: Fig.11.4 Associazione a discrezione dell utente All interno delle colonne possiamo scrivere informazioni o anche in questo caso utilizzare le tabelle se sono state associate: Fig.11.5: Utilizzo delle tabelle 11-2

151 Genikon L icona di stampa consente un anteprima del foglio e la stampa del medesimo. Fig Anteprima della stampa foglio di lavoro Naturalmente tutti i dati associati o scritti sul foglio di lavoro verranno automaticamente salvati e saranno accessibili ogni qual volta che verrà aperto il foglio di lavoro da un qualsiasi menu

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153 Genikon 12 Stampa immagini e dati Digitando l icona della stampante ( ) nella toolbar principale, si apre la finestra per creare o richiamare il report del paziente Finestra di controllo Fig.12.1: Finestra di controllo delle stampe Tale finestra consente di eseguire tutte le operazioni possibili a carico di un report. Con Crea /Modifica è possibile creare o modificare visivamente un report. Carica consente di caricare da disco un report precedentemente salvato. Quando si apre il pannello di controllo è automaticamente caricato l ultimo report utilizzato. Stampante permette di scegliere la stampante da utilizzare e la modifica delle sue proprietà. Con Anteprima si visualizza l anteprima di stampa del report corrente in base alla stampante selezionata. Stampa permette la stampa del report. Il Tasto permette di gestire le immagini dell archivio presenti nel report Come creare un nuovo Layout di stampa Fig.12.2: barra degli strumenti dell'ambiente per la generazione di report 12-1

154 Barra delle funzioni Per creare un report si dispone di varie funzioni. In ordine da sinistra a destra abbiamo: nuovo: crea un nuovo report; apri: carica un report salvato in precedenza su un disco; salva: salva su disco il report corrente; anteprima: mostra l anteprima di stampa; seleziona: consente di selezionare all interno del report uno o più oggetti. Se passiamo con il puntatore del mouse su un dato oggetto questo assume la forma di mano; l oggetto è selezionato con il tasto di sinistra del mouse è delimitato da un rettangolo. Se durante la selezione si tiene premuto il tasto [Ctrl] sulla tastiera, è effettuata una selezione multipla. Gli oggetti selezionati in modalità multipla possono essere spostati insieme in un altra posizione. Tenendo premuto il mouse si sposta il rettangolo in una nuova posizione. Al momento del rilascio gli oggetti sono trasferiti nella nuova posizione. Per deselezionare è sufficiente fare click su una zona vuota del report o su un altro oggetto senza premere [Ctrl]; testo: con il cursore del mouse, tenendo premuto il tasto sinistro, si traccia un rettangolo(tratteggiato) che indica la zona all interno della quale verrà inserito il testo. Rilasciando il mouse il bordo del rettangolo diventa solido ed all interno è visualizzato un cursore di testo lampeggiante. Si può ora scrivere il testo desiderato all interno del rettangolo. Una volta terminata la scrittura si deve premere all esterno del quadro. E possibile variare le dimensioni del rettangolo si scrittura tramite i quadrati di selezione. E sempre possibile cambiare il carattere premendo il tasto di destra del mouse; linea: è utile per tracciare delle linee. Si deve premere il pulsante sinistro del mouse in un punto e tenendolo premuto si traccia una retta fino alla posizione desiderata. 12-2

155 Genikon Tenendo premuto il tasto [Ctrl] sulla tastiera, la linea sarà tracciata solo nelle direzioni cartesiane. E possibile variare il colore della retta agendo sulle barre degli strumenti; rettangolo: traccia degli oggetti rettangolo. Si preme il tasto sinistro del mouse in un punto desiderato e si traccia un rettangolo delle dimensioni desiderate. Rilasciando il pulsante è creato il rettangolo. Il colore si varia agendo sui controlli della barra degli strumenti. Il rettangolo si può successivamente ingrandire o ridurre agendo sui vertici del medesimo; immagine: permette l inserimento di immagini all interno del report. Premiamo il tasto di sinistra del mouse in un punto del report e teniamo premuto; automaticamente si traccia un rettangolo delle dimensioni desiderate (che rappresenta le dimensioni dell immagine una volta inserita). Rilasciando il mouse appare un menù a discesa con il quale si può sceglie se inserire un immagine da file oppure dall archivio. Se scegliamo di prendere un immagine da file, si mostra una finestra di dialogo che consente di caricare un immagine tipo Bitmap, Tiff, Jpeg, Targa o Gif. (teniamo presente che il report non include l immagine all interno, ma mantiene solo il collegamento con essa); in caso di rimozione del file dalla posizione originale il report non sarà più in grado di visualizzarla e mostrerà, al suo posto, un rettangolo di colore chiaro visibile solo in fase di editing). Scegliendo l'inserimento dell immagine dall archivio si apre un sottomenu dal qual è possibile selezionare il tipo d immagine che sarà inserito in quella posizione (metafase, cariotipo, collage ed altre) 12-3

156 Fig.12.3Tipi d immagini trasferibili sul foglio di stampa E visualizzata l immagine del tipo selezionato relativa al caso, vetrino ed alla cellula selezionati. In dettaglio dunque possiamo scegliere che tipo di immagine : Metafase, In automatico viene visualizzata la METAFASE corrispondente alla cellula visualizzata in elaborazione nella finestra maggiore 12-4

157 Genikon Cariotipo, si visualizza il cariotipo della cellula selezionata Composizione, il sistema se selezioniamo questa voce chiederà anche il numero di composizione desideriamo collocare in stampa (questo anche se è stata effettuata una sola composizione). Metafase Fish, Immagine della fish in metafase Analisi visiva (mostra l immagine della metafase con i numeri relativi alla valutazione fatta dall operatore) Conta, valutazione del numero dei cromosomi Risultati della CGH mostrati con i Profili della CGH Immagine della MFISH1 Immagine della MFISH2 Immagine della Metafase originale Immagine della fusione Immagine del cariotipo in FISH Un immagine inserita nel report può essere ridimensionata tramite i quadrati di selezione; Fig.12.4 Ridimensionamento di un immagine 12-5

158 Utilizzando i quadrati ai vertici, l immagine è ridimensionata mantenendo le proporzioni originali. Se si tiene premuto il tasto [Ctrl] è possibile ridimensionare l immagine senza mantenere le proporzioni. Sull immagine inserita se utilizziamo sul riquadro il tasto di destra il sistema consente di inserire un LABEL; il label corrisponde alle informazioni inserite dopo la fase d acquisizione (numero cellula vetrino e seguenti se sono state inserite dall operatore). Fig.12.5 Inserimento di un label sull immagine in stampa Fig.12.6 Label inserito Il label varia a seconda delle informazioni inserite sulla cellula in fase di acquisizione 12-6

159 Genikon Fig.12.7 Informazioni relative alla cellula Se dunque la funzione delle informazioni della cellula è attiva in fase di acquisizione e se abbiamo introdotto tali informazioni allora il label sarà maggiormente descrittivo, in caso contrario si limiterà ad introdurre solo il numero del caso, della cellula e del vetrino. La funzione Label è una funzione ON-OFF e si abilita semplicemente selezionandola o deselezionandola. Fig.12.8 Rappresentazione dell Etichetta inserita Associazione alla stampa dei dati dell archivio. Digitando l icona precedente si apre la lista dei campi dell archivio. Se desideriamo posizionare sul report di stampa delle informazioni relative al caso possiamo trasferirle utilizzando premuto il tasto di sx del mouse sul campo prescelto e trascinarlo sul report di stampa annulla: consente di annullare l ultima operazione compiuta; 12-7

160 fattore di zoom: è possibile selezionare il fattore di zoom da tastiera; dati da archivio: premendo questo pulsante si mostra una finestra che contiene la lista dei campi dell archivio; tenendo premuto possiamo trasferire i singoli campi sul report; Fig.12.9 Trasferimento dei dati dall archivio al layout di stampa Fig Settaggio dei dati sulla stampa I dati trasferiti dall archivio possono essere spostati sul foglio di stampa, se li abbiamo selezionati con il tasto di sx del mouse, oppure variati dimensionalmente muovendo le barre rosse a dx o sx. In relazione ai dati possiamo inoltre variare: grassetto, italico, sottolineato: impostano lo stile per il testo; allinea a sinistra, centra, allinea a destra: impostano l allineamento del testo; allineamento degli oggetti : con una multi selezione possiamo poi allineare gli oggetti a sinistra destra o centrare; 12-8

161 Genikon porta sullo sfondo: consente di trasferire l oggetto sullo sfondo od in primo piano rispetto agli altri oggetti; carattere: imposta il tipo di carattere; dimensione: imposta la dimensione; colore: imposta il colore; spessore: imposta lo spessore applicabile a linee e rettangoli; cancella: elimina gli oggetti selezionati. Sulla stampa possiamo anche introdurre testi liberi per l operatore od importare da archivio anche immagini diverse dando l opportunità di immettere sul foglio stampa anche per esempio il LOGO del laboratorio. Al termine della creazione possiamo controllare con l anteprima di stampa il tipo di report creato. Fig Anteprima di stampa Barra di stato Fig.12.12: Barra di stato dell'ambiente per la generazione di report 12-9

162 Nella parte inferiore, la barra di stato comunica le seguenti informazioni: numeri di pagina: ci indica su quale pagina ci troviamo rispetto al totale; vai a pagina: sul campo numero pagina facendo doppio-click posso inserire la pagina sulla quale desidero andare; gestione pagine: consentono di scorrere le pagine; data del sistema: è la data di sistema Righello e linee guida Premendo con il pulsante destro del mouse sopra uno dei due righelli appare un menu a tendina che consente di impostare la scala del righello stesso. E possibile impostare la scala in centimetri o in pollici. Con un click con il tasto con il tasto sinistro del mouse sopra ad uno dei due righelli e rilasciando subito il mouse si attiva l inserimento di una linea guida. Muovendo il cursore del mouse sulla pagina si può notare che questo viene seguito da una linea tratteggiata di colore blu (orizzontale o verticale a seconda del righello sul quale si è agito). Tale linea può essere portata nella posizione desiderata della pagina, facendo un altro click con il tasto di sinistra la linea è rilasciata. Le linee così create sono utilizzabili per effettuare l allineamento di più oggetti. Spostando un oggetto, quando si giunge ad una delle estremità in prossimità di una linea guida, l oggetto stesso è agganciato alla linea. Per spostare una linea guida è sufficiente premere il mouse e mantenerlo premuto; la linea seguirà il cursore e quando si è raggiunta la posizione desiderata si rilasci il pulsante del mouse. Per rimuovere una linea guida è necessario prelevarla e trascinarla all esterno della pagina. Facendo click su questo campo il cursore assume la forma di una mano che tiene un foglio; tenendo premuto il mouse spostiamoci sulla pagina, il cursore cambia di nuovo forma specificando che il foglio può essere rilasciato. Rilasciando il mouse è inserito un oggetto. Premendo il tasto di destra su qualsiasi oggetto compare un menu a tendina comune a tutti gli oggetti Gestione delle immagini del report Fig Accesso al confronto immagini 12-10

163 Genikon Per effettuare stampa fra immagini appartenenti a vetrini e cellule diverse dello stesso caso è necessario utilizzare la funzione di gestione delle immagini presente nel pannello di controllo del report. Si accede premendo il presente tasto: Generalmente a questo menu si accede quando abbiamo creato un layout di stampa con ad esempio almeno due immagini di metafasi di cellule o vetrini o casi diversi. Fig layout di stampa di due metafasi diverse Nel momento in cui apriamo il pannello è offerta la possibilità di introdurre la prima immagine della metafase Fig Pannello di controllo Generalmente il sistema mostra la cellula rappresentata e selezionata dalla galleria (Fig.12.15) se però vogliamo in stampa immagini di cellule diverse dobbiamo utilizzare il cursore per selezionare cellule diverse : Automaticamente il sistema mostra la nuova cellula sulla finestra di destra, se la cellula è confermata digitiamo il tasto di assenso, automaticamente il sistema definisce la nuova cellula come prima immagine del foglio di stampa

164 Fig Selezione di altre cellule La cellula è selezionata perché appare in rosso. Per selezionare la seconda immagine digitiamo sulla freccia Immagine Metafase Per fissarla come prima metafase dobbiamo digitare il tasto di assenso. L immagine passa a sinistra ed è memorizzata sulla stampa. Compare rossa la scritta Immagine 1 Metafase. Fig Metafase memorizzata sulla stampa Procediamo sulla scelta della seconda immagine; possiamo selezionare un altra cellula o vetrino o caso. Dobbiamo prima scambiare a sinistra utilizzando l apposita freccia l immagine della cellula 1 con una vuota. Fig Selezione seconda immagine 12-12

165 Genikon A questo punto procediamo nella scelta della seconda cellula che sarà visualizzata sulla destra. Se va bene la scelta digitiamo il tasto di assenso. Fig Memorizzazione della seconda cellula Il sistema visualizza a destra l immagine se va bene tasto di assenso (il sistema inverte con la nuova immagine la finestra a sx).procediamo ora come per la prima immagine alla selezione del caso, vetrino e numero di cellula. Nuovamente il sistema mostra a destra la nuova immagine e se è corretta digitiamo il tasto di assenso. In anteprima immagine il sistema mostrerà le due immagini di metafasi. Naturalmente se nel LAYOUT di stampa Fig Anteprima di due cellule diverse abbiamo cariotipi o FISH o altro il sistema cambierà l informazione e comunicherà: Immagine 1= cariotipo/metafase o altro. Con la stessa modalità possiamo scambiare cellule appartenenti a vetrini diversi o casi diversi e naturalmente se nel layout di stampa sono presenti altri tipi di immagini (FISH CARIOTIPO o CGH o MFISH o Collage), potremo combinare tra loro anche diversi tipi di immagini Fig Anteprima cariotipo e metafase in FISH 12-13

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167 Genikon 13 Personalizzazione dell archivio Normalmente l archivio si stabilisce con i tecnici Nikon al momento dell installazione della strumentazione poiché modifiche avanzate nel tempo potrebbero causare problemi nel caso in cui si utilizzino chiavi di ricerca che scompaiono o sono modificati nel tempo. Generalmente dunque la modifica è eseguita al momento dell installazione e variazioni nel tempo devono essere fatte con estrema cautela. Per eseguire modifiche sull archivio bisogna entrare in un programma accessorio chiamato PERSARCH. Il programma è sempre contenuto nella cartella GENIKON. N.B. E molto importante, se vogliamo effettuare delle modifiche all archivio, che l applicativo di GENIKON non sia lanciato né sulla stazione di lavoro né su altre eventuali stazioni in rete. L icona lancia l applicativo è la seguente nel caso in cui sia stato inviato al desktop: Il sistema mostra un nuovo ambiente col quale possiamo modificare la scheda. Fig.13.1: Creazione di un archivio personalizzato Le funzioni principali sotto illustrate consentono di: 13-1

168 Fig.13.2: Barra di gestione degli archivi 1-creare una scheda ex novo; 2-richiamare una scheda dalla rete; 3-salvare una nuova scheda; 4-Salvare con altro nome 4-richiamare la scheda presente sull applicativo. Generalmente si richiama la scheda dall applicativo e si procede alla sua modifica. Fig.13.3: Barra di gestione dei campi Fig.13.4 Caricamento dell archivio esistente sull applicativo Fig.13.5 Inserimento di un nuovo campo E possibile: 13-2

169 Genikon creare un nuovo campo: per aggiungere un nuovo campo a quelli già esistenti. Si apre una nuova finestra che ne consente la sua definizione. Fig.13.6: Finestra di definizione del nuovo campo Inseriamo quindi il nome del nuovo campo, il tipo (testo, numerico, note oppure data), e le dimensioni (in caratteri, nel caso di un campo testo). Indichiamo infine se si tratta di una tabella (avevamo spiegato l utilità delle tabelle e ricordiamo appunto che si tratta di quei campi nei quali possiamo inserire una lista di informazioni standard che possono essere richiamate dalla scheda paziente senza dover essere digitate ogni volta per un analisi specifica); Possiamo ora decidere la posizione e le dimensioni dei campi. Utilizzando il tasto di sinistra del mouse selezioniamo il caso e lo spostiamo tenendo premuto il tasto di sinistra. Se invece selezioniamo con il destro (sempre tenuto premuto), possiamo modificare, posizionandoci lateralmente sulla finestra del campo interessato, le dimensioni in lunghezza ed in larghezza. E infine possibile aggiungere una nuova pagina (Folder), alla quale possiamo dare un nuovo nome (p. es.: la prima pagina può essere relativa all analisi che stiamo conducendo e la seconda ai dati veri e propri del paziente). eliminare un campo indesiderato: è sufficiente selezionare il campo con il mouse e digitare l icona delle forbici; accettare le modifiche: per terminare la fase di creazione o cancellazione dei campi. E possibile inoltre creare un campo particolare denominato VERO o FALSO. E introdotto questo nuovo tipo di campo per poter inserire sull archivio un controllo sui casi completi e non. Tale modalità consente di filtrare solo i casi completi ed archiviarli in una sola selezione 13-3

170 Fig.13.8 Introduzione di un campo tipo V/F Fig.13.9 Caso completo Possiamo inoltre voler introdurre un nuovo folder nel nostro archivio utilizziamo le frecce per spostarci fino all ultimo folder aggiungendone un altro il sistema chiede se desideriamo introdurre un altro che definisce folder. Digitando su folder possiamo introdurre un nome particolare A questo punto l operatore può uscire dalla personalizzazione e salvare le modifiche. In vero il sistema chiede se si desidera salvare le modifiche. Se si decide di modificarle al termine della memorizzazione il sistema invia un messaggio di salvataggio effettuato positivamente. 13-4

171 Genikon 14 Editor di specie L editor di specie è una funzione alla quale si accede dal Menu principale di GENIKON ed è un sotto menu che permette di codificare nuove specie su cui lavorare, e di disegnarne il layout del cariotipo (). A questo ambiente si accede tramite la voce Editor di specie del menù Strumenti, nell ambiente principale. Fig.14.1 Strumenti sulla Barra principale Fig.14.2 Accesso menu di Editor di specie Fig.14.3: Editor di specie 14-1

172 14.1 Creazione di una nuova specie La creazione di una nuova specie avviene premendo il tasto, oppure scegliendo la voce Nuova dal menù Specie. Si apre la finestra per la definizione della nuova specie. Nella casella Nome della specie indicarne il nome (p. es.: Uomo ); nella casella Descrizione inserire un breve commento inerente la specie (p. es.: Specie umana ); infine indicare il numero di classi nella casella Numero di classi (nel caso dell uomo dobbiamo introdurre 24 per 22 omologhi ed i 2 eterologhi. Fig.14.4: Definizione di una nuova specie Premendo il tasto di conferma, la finestra di Fig.14.2 mostrerà tutte le classi nella parte inferiore, ed il nome della specie saranno mostrati sopra l area di lavoro. Ogni classe è indicata simbolicamente con un rettangolo. Possiamo spostare ogni coppia nella posizione desiderata Disegno del Formato del cariotipo Ora è il momento di definire graficamente come sarà il cariotipo della specie in questione Come posizionare una classe all interno dell area di lavoro Per trasferire una classe nell area di lavoro occorre trascinarla (anche a gruppi, con la selezione multipla). Si può utilizzare il menù Modifica che permette di allineare ed equidistanziare le classi. Lo stesso menù si ottiene facendo click con il tasto destro del mouse sull area di lavoro Rimozione di una classe dall area di lavoro Per rimuovere le classi selezionate dall area di lavoro premere il bottone oppure scegliere la voce Rimuovi dal menù Modifica. La stessa cosa avviene se si preme il 14-2

173 Genikon tasto [Canc] sulla tastiera. Per rimuovere tutte le classi premere il bottone menù Modifica, scegliere la voce Rimuovi tutto. oppure, dal Raggruppamento di classi Per attribuire una medesima caratteristica alle classi selezionate, scegliere la voce Raggruppa del menù Strumenti. Verrà chiesto di inserire la caratteristica, che poi comparirà a fianco di ciascuna classe Caricamento di una specie Per caricare una specie fare click sul bottone, oppure utilizzare il menù Specie (voce Apri ). Si apre la finestra di, nella quale possiamo scegliere la specie da caricare tra quelle codificate. Caricata la specie, il suo nome compare sopra l area di lavoro. Fig.14.5: Caricamento di una specie 14.4 Cancellazione di una specie La cancellazione è effettuata sempre sulla specie che abbiamo caricato nell area di lavoro (il cui nome è riportato sopra la stessa). Per eliminare la specie, premere il bottone, oppure scegliere la voce Elimina dal menù Specie. N.B.: la cancellazione di una specie risulta essere un operazione irreversibile Uscita L editor di specie si chiude tramite la voce Uscita del menù Specie, oppure con la in alto a destra. 14-3

174 N.B. I nuovi formati creati sono utilizzabili e ricaricabili solo per la creazione del cariotipo in manuale. Per rendere attivo il formato del cariotipo è necessario caricare il nuovo formato dal menu opzioni e creare un nuovo caso. Il sistema per ogni caso riconosce il medesimo formato di cariotipo e non accetta per uno stesso caso di utilizzare formati differenti. N.B. E importante precisare che la variazione dell editor diventa operativa quando si acquisiscono nuove cellule e dal menu opzioni è stata caricata la specie. Il sistema del resto quando carico un altro caso acquisito con una specie diversa automaticamente rispristina per quel caso tale specie, questo per ovviare che sullo stesso caso si mescolino specie differenti. 14-4

175 Genikon 15 OPZIONI Genikon può essere personalizzato dall utente premendo il tasto nella barra degli strumenti dell ambiente principale, oppure scegliendo la voce Opzioni del menù Strumenti. Il menu Opzioni si divide in Generale, Visualizzazione, Personalizzazione, Ambiente principale, Acquisizione. Fig.15.1 Menu delle OPZIONI 15.1 Generale (impostazioni) Le impostazioni generali sono quelle mostrate in Fig.15.2 Fig.15.2: Impostazioni generali 15-1

176 Posizione del server Serve ad indicare al programma dove si trova l archivio centrale (se si dispone di più stazioni collegate in rete) Specie di appartenenza dei nuovi casi Specifica la classe quando si fanno dei casi nuovi Impostazioni per l ambiente principale Fig.15.3: Impostazioni per l'ambiente principale L ambiente principale di GENIKON è diviso in tre parti: a sinistra la scheda con i dati del caso, al centro la struttura vetrini-cellule, e a destra le anteprime delle immagini. Per effettuare tali modifiche è sufficiente trascinare la parte che vogliamo spostare al di sopra di un altra utilizzando il tasto di sinistra del mouse. 15-2

177 Genikon Fig.15.4: dati e struttura invertiti 15.3 Impostazioni per l Acquisizione Fig.15.5: Impostazioni per l'acquisizione Il menu di acquisizione consente di definire diverse periferiche che possono essere presenti su Genikon. A seconda dell hardware presente su questo menu è necessario definirne il tipo Telecamera principale Il sistema consente di interfacciare diversi modelli di telecamere;digitando sotto la voce telecamere i modelli disponibili sono: Una Tv camera generica: normale analogica senza integrazione TV CAMERA DIGITALE Hesp Firma TV camera analogica COHU che si differenzia dalla precedente in quanto viene gestita anche l integrazione. Telecamere serie Photometrics (CoolsnapCF-Coolsnap FX) Telecamere serie Hamamatsu 15-3

178 Telecamera digitale JAI. Camera digitale DS2Mcooled e Ds5 a colori Ruota fitri Consente di selezionare la presenza di una ruota filtri. Fig.15.6 Selezione ruota filtri Genikon gestisce tre tipi diversi di ruote filtri. Una ruota filtri NIKON a 10 o 12 Filtri di eccitazione Fig.15.7 Ruota filtri NIKON 15-4

179 Genikon Ruota filtri PRIOR Fig.15.7 Ruota filtri Prior Ruota filtri rappresentata dal FAD ad otto posizioni del microscopio E1000 Fig.15.8 Ruota filtri VFAD 15-5

180 Microscopio motorizzato Fig.15.7 Selezione diversi microscopi Consente di selezionare diversi microscopi motorizzati tra i quali: E1000 NIKON Leica DMRA-2 nuova serie Nikon 90i Nikon 80i dgital head Olympus BX Configurazione filtri dei microscopi L utilizzo dell icona : consente di definire le posizioni dei filtri sia sui microscopi che sulle ruote. Se dunque abbiamo selezionato per esempio la A-presenza del microscopio E1000 a 5 posizioni e digitiamo configura i filtri otterremo l apertura del seguente menu: 15-6

181 Genikon Fig.15.8 Definizione dei filtri su E1000 E necessario introdurre il nome del filtro e la posizione. Utilizzando questa modalità quando andremo a richiamare i fluorocromi sulla lista direttamente sapremo che filtro è posizionato nelle 5 collocazioni. Sempre nel menu precedente sono fornite i test necessari per controllare la presenza del microscopio E1000. Se digitiamo la voce test il sistema controlla il collegamento dell E1000 e se le connessioni sono corrette avvisa il corretto funzionamento. Controlliamo sempre che il cavo sia collegato correttamente e la porta seriale sia corretta. Se desideriamo inoltre vedere gli spostamenti lungo i filtri di fluorescenza è necessario digitare le singole posizioni (1,2,3,4,5). Una volta inseriti i singoli filtri e l eventuale posizione di CLEAR cioè libero dobbiamo salvare la configurazione Fig.15.9 salvataggio della configurazione Nel menu dobbiamo utilizzare la voce salva configurazione utilizzando il file di default. Da questo momento in poi avremo nei controlli la gestione del microscopio E

182 Per interfacciare il microscopio LEICA utilizziamo la voce corretta: B-LEICA DMR ed il sistema mostra come è accaduto per il NIKON il menu di interfaccia: Fig Interfaccia LEICA Dobbiamo procedere come per l E1000 selezionando e nominando i singoli filtri. Anche in questo caso al termine della definizione è necessario salvare la configurazione. C_Nikon 90i Non serve configurare poiché Genikon recupera direttamente i dati dal software accessorio di settaggio NIKON I toools pe quanto riguarda la configurazione dei filtri D_Olympus BX61 Stessa cosa del 90i Configurazione ruota filtri a-ruota Nikon Fig Ruota NIKON E necessario definire se la ruota è a 10 o 12 posizione perché il ricollocamento dei filtri sia corretto. 15-8

183 Genikon Come per i microscopi motorizzati dobbiamo definire le posizioni dei filtri di eccitazione, la posizione di CLEAR,lo shutter e la porta seriale. Salviamo infine la configurazione come per i microscopi b-ruota filtri Prior La procedura di configurazione della ruota è esattamente identica alla NIKON Fig Ruota filtri Prior c_vfad E1000 Nel caso in cui sia presente un microscopio E800 od E1000 con una motorizzazione ad 8 posizioni dobbiamo considerare la fluorescenza motorizzata come una ruota filtri poiché il controllo è esterno alla motorizzazione del microscopio. Fig Fluorescenza ad 8 posizioni NIKON La procedura è poi identica alla definizione delle ruote. E necessario salvare come nelle precedenti configurazioni. 15-9

184 Tavolini motorizzati Dal menu di personalizzazione è consentito introdurre il tavolino merzauser mentre sul menu dello Spot counting è interfacciabile quello della Prior Fig tavolino Merzauser Soglia adattiva ed informazioni su singola cellula Sotto al sottomenu di acquisizione (sempre nelle personalizzazioni ) sono collocate altre due voci relative alla fase di cattura immagine Fig Selezione della soglia adattiva e note La voce attiva su l inserimento di informazioni su singola cellula, comporta che al momento di acquisizione dll immagine, una volta sogliata il sistema presenta un form speciale di note sull immagine specifiche. Tali informazioni le ritroveremo se desideriamo in stamap quando all immagine della cellula viene aggiunta un etichetta Tali informazioni sono inoltre editabili dall utente successivamente andando sul menu principale, in modalità singola cellula e digitando il tasto di dx del mouse sull immagine prescelta Fig Accesso alle note su singola cellula 15-10

185 Genikon Fig Modifiche note su singola cellula La selezione della soglia adattiva comporta che, al momento di sottrazione della soglia dall immagine, dopo la fase di acquisizione il sistema dia la possibilità di inserire dei filtri di normalizzazione sull immagine in modalità automatica. Avevamo già trattato nel menu di sottrazione della soglia questa funzione che è di notevole importanza e consente un aumento del contrasto. Se l operatore non ritiene mai utile avere tale filtro imposto sull immagine può deselezionare la soglia adattiva. Sempre sotto questo menu troviamo la possibilità di scegliere tra la sogliatura manuale e quella automatica. Anche queste funzioni sono ON-OFF 15.4 Impostazioni di visualizzazione 15-11

186 Fig.15.18: Impostazioni di visualizzazione A questo menu di visualizzazione sono associate numerose funzioni definite in gran parte ON \OFF cioè che se selezionate sono attive e deselezionate disattive. 1. Durante la visualizzazione di tutte le cellule, riserva una posizione in archivio per il cariotipo. Nella modalità tutte le cellule permette di mantenere accanto all immagine della metafase una posizione che associa sempre un cariotipo. Nel caso in cui non sia stato costruito ancora il cariotipo il sistema lascia uno spazio vuoto a destra della metafase. Se invece la funzione è disabilitata tutte le cellule verranno messe una di seguito all altra senza lasciare spazi vuoti

187 Genikon Fig.15.19: Immagini senza l'opzione contrassegnata Fig.15.20: Immagini con l'opzione attivata Nella visualizzazione a singola cellula, mostra anche le immagini originali Permette di vedere l anteprima delle immagini originali (solo in modalità singola cellula )

188 Fig.15.21: Visualizzazione della Raw Visualizza i fluorocromi a colori Se l opzione è contrassegnata in anteprima i fluorocromi sono mostrati a colori, altrimenti si vedranno in bianco e nero. Mostra gli oggetti eliminati Permette di mostrare/nascondere gli oggetti che sono stati eliminati. Nel caso in cui la funzione sia attiva gli oggetti eliminati sulla metafase compaiono ma sono circoscritti da un contorno rosso (o di altro colore se nella persoalizzazione lo abbiamo scelto diverso)che indica che l oggetto anche se visibile non è considerato nella conta e non sarà presente nel cariotipo. Se la funzione invece è disattivata l oggetto non compare proprio. Nel a caso in cui abbiamo cancellato un oggetto che desideriamo ripristinare sarà necessario selezionare la funzione, tornare sulla metafase ed includere nuovamente nella conta la struttura. Se non utilizziamo come ON la funzione non potremo riselezionarla ed attivare nuovamente la presenza dell oggetto con la funzione ripristina

189 Genikon Fig.15.22: Oggetti eliminati con contorno rosso Fig.15.23: Oggetti eliminati non visualizzati Oggetti eliminati non presenti in stampa La funzione consente di non vedere gli oggetti eliminati solo nella stampa mentre durante l elaborazione sono visibili ma eliminati perché circoscritti di rosso. Evidenzia gli oggetti trasferiti dalle fusioni Gli oggetti trasferiti dalle fusioni sono evidenziati con un rettangolo e con una F se l opzione è contrassegnata

190 Fig.15.24: Oggetti da fusione contrassegnati Il numero accanto alla F dipende dal numero relativo alla fusione associata. Evidenzia gli agglomerati Se la casella è contrassegnata, gli agglomerati sono evidenziati da un ellisse. Fig.15.25: Oggetti evidenziati come gruppo Evidenzia oggetti dopo le separazioni Dopo qualunque operazione di separazione, gli oggetti sono evidenziati da un bordo colorato per controllare come è avvenuta la separazione. Fig.15.26: Oggetti contornati dopo divisione 15-16

191 Genikon Seleziona automaticamente gli agglomerati dopo le separazioni Dopo qualunque operazione di separazione, gli oggetti che sono degli agglomerati sono automaticamente selezionati. Fig.15.27: Selezione automatica di gruppi dopo separazione Questa operazione consente di non dovere nuovamente selezionare per separare ancora i gruppi ma diversamente procedere con l operazione per esempio di sissovrapposizione (vedi Fig5.26) Cariotipo: evidenzia cromosomi già classificati durante la classificazione manuale Se l opzione è contrassegnata, i cromosomi già classificati sono evidenziati da un bordo colorato. Fig.15.28: Evidenzia cromosomi nel cariotipo manuale In particolare se sono due i cromosomi trasferiti il contorno sarà verde (OK) se invece >di due blu e se <2 rosso. Sfuma i cromosomi in zoom In fase di editing, se è applicato un fattore di zoom per ingrandire l immagine, i 15-17

192 cromosomi risulteranno leggermente più sfumati (opzione contrassegnata). Applica in automatico un filtraggio Mostra linee quando viene impostato l allineamento per centromero La funzione attiva consente di visualizzare e stampare le linee sul centromero. Fig.15.29Cariotipo allineato per centromero Fig Carioitpo allineato per linee Applica colori casuali ai cromosomi La funzione attiva consente di utilizzare un colore coprente o solo contorni per evidenziare gruppi di cromosomi Fig colore casuale Fig Senza colore ma solo conorno Tale funzione serve per evidenziare i cromosomi uniti in due diverse modalità. La prima copre i cromosomi, la seconda pur evidenziando i gruppi lascia intravedere i cromosomi. Spessore medio dei cromosomi Questa barra serve per impostare lo spessore utilizzato durante il disegno degli assi come percentuale rispetto allo spessore medio dei cromosomi della cellula. E necessario aumentare il valore se osserviamo che durante i tagli sono eliminate parti dei cromosomi. Fig Definizione spessore cromosomi 15-18

193 Genikon Generalmente un valor medio di 100% è buono. Distanza tra i cromosomi all interno della classe Imposta la distanza tra i cromosomi all interno della classe, durante la costruzione del cariotipo.un valore basso intorno ad 1 è comodo per osservare bene appaiati i cromosomi Fig Distanza omologhi Mostra box per classe La funzione attiva mostra le griglie che definiscono lo spazio riservato ad ogni cooppia di omologhi Forza ingresso in modalità Reverse Fig Box sul cariotipo E la funzione che consente di lavorare sempre in Q-REVERSE automaticamente una volta acquisita l immagine 15.5 Personalizzazione dei colori La personalizzazione dei colori riguarda la fase di analisi e cariotipizzazione delle metafasi

194 Per mezzo dei tasti: è possibile associare un colore per ognuna delle categorie Fig Personalizzazione dei colori riportate in Fig

195 Genikon 16 Comandi da tastiera E possibile associare alle funzioni della toolbar di elaborazione i tasti della tastiera, in modo da rendere più veloce il compito dell operatore. La pressione del bottone permette di aprire la finestra mostrata in Fig Fig.16.1: finestra per la definizione dei comandi da tastiera 16.1 Associazione di funzioni a tastiera Come associare una funzione ad un tasto della tastiera Se questa finestra viene aperta durante la fase di elaborazione, è possibile effettuare le associazioni semplicemente premendo sulla funzione che vogliamo utilizzare (ad esempio i colori casuali). Fig.16.2: Associazione di comandi a tastiera 16-1

196 Comparirà una piccola finestra con il simbolo e la descrizione del comando prescelto. Premiamo ora il tasto della tastiera al quale vogliamo attribuire quella funzione (ad esempio la barra spaziatrice). Ripetuta questa operazione per le funzioni di uso più comune, o comunque quelle che si preferiscono, la finestra si arricchirà con la descrizione dei comandi ed il tasto scelto a lato. Fig.16.3: Alcune delle possibili combinazioni di tasti E possibile utilizzare tutti i tasti della tastiera più comuni (fatta eccezione per i caratteri strani, le lettere accentate, ed altri tasti particolari quali [Esc], [F1], ecc ). Come si vede dalla è possibile utilizzare anche i tasti [Ctrl], [Alt], [Maiusc] e loro combinazioni. Se si chiude la finestra, si nota che le combinazioni di tasti sono già attive Modifica di una combinazione E possibile modificare un impostazione (dopo averla selezionata nella lista) premendo il tasto. Verrà chiesto di premere una nuova combinazione di tasti, che andrà a sostituire quella precedente Eliminazione di una combinazione L eliminazione di una combinazione selezionata avviene per mezzo del bottone. 16-2

197 16-3Genikon 16.4 Eliminazione di tutte le combinazioni impostate Il bottone rimuove tutte le combinazioni impostate Memorizzazione e richiamo di impostazioni predefinite Il tasto ha una duplice funzione: memorizzare un elenco di impostazioni e richiamarlo successivamente Memorizzazione di un elenco di impostazioni Una volta che abbiamo definito un elenco di combinazioni, per memorizzarlo premere il tasto. N.B.: la memorizzazione ha effetto solo la prima volta; assicurarsi che l elenco che si sta per memorizzare sia il più esauriente possibile Richiamo dell elenco di impostazioni Il richiamo dell elenco memorizzato si effettua tramite il bottone ripristinato va a sostituire quello corrente.. L elenco che viene 16.8 Impostazioni per la stampa dei report Fig.16.4 Impostazione stampa report 16-3

198 Ad Alcuni Layout è possibile associare tasti della tastiera potremo direttamente stampare dei layout semplicemente digitando un tasto Impostazione per l esecuzione di macro Come per il menu precedente possiamo associare dei tasti della tastiera a delle macroroutine. 16-4

199 17-5Genikon 17 Macroroutine La funzione delle macroroutine serve per associare alla tastiera dei tasti ai quali abbiamo egato una serie di funzioni ripetitive. Mettiamo per esempio il caso che desideriamo ogni volta imporre un filtro (Enhance) ad una metafase e vogliamo anche contrastare (schiarire ) ogni volta i cromosomi della stessa di un valore di +1, dobbiamo procedere come segue dopo aver selezoinato l icona delle macro: 17.1 Creazione della macroroutine Il sistema apre il menu specifico Fig.17.1 Menu Macroroutine In questo caso il sistema è nuovo e non è mai stata registrata alcuna macroroutine per incominciare a registrare utilizziamo il tasto rosso. Automaticamente il sistema consente di entrare in elaborazione e svolgere le operazioni che desideriamo memorizzare Nomina della macroroutine E prima necessario dare un nome alla macroroutine. In automatico il sistema propone un default (Macro001) che è possibile editare, semplicemente scrivendo il nome che desideriamo Fig.17.2 Nomina della macro 17-5

200 17.3 Memorizzazione della macroroutine Procediamo ora in elaborazione come al solito e per esempio eseguiamo le operazioni di selezione di tutti i cromosomi, utilizziamo i filtri di sharpen (GTG debole) e contrastiamo con il valore di +1 Fig.17.3 Creazione della macroroutine Si osserva che accanto al nome della macroroutine che stiamo creando il sistema mentre l operatore utilizza le funzioni memorizza ogni singolo passaggio. A questo punto se abbiamo concluso fermiamo la registrazione digitando il tasto in verde Fig.17.4 Chiusura di una macroroutine Il sistema ora ha in memoria una macroroutine ma non è stato associato alcun tasto da tastiera. Chiudiamo comunque il tasto del menu delle macro con il solito tasto di assenso Associazione di una macro ad un tasto Per associare un qualsiasi tasto della tastiera utilizziamo la procedura già vista nell associazione dei tasti a singole funzioni. Utilizziamo l icona solita: 17-6

201 17-7Genikon Fig.17.5 Associazione di un tasto alla macroroutine Apriamo l ulltimo folder e selezioniamo la Macro001, utilizziamo la funzione di associazione e digitiamo il tasto della tastiera (F6 per esempio) Il sistema mostra subito che tasto viene associato alla nuova macro: Fig.17.6 Tasto associato alla macroroutine Da questo momento in poi, quando siamo in elaborazione, ogni volta che digitiamo il tasto F6 il sistema eseguirà tutte le funzioni che sono state associate in automatico. Come si vede dalla figura 17.6 una macroroutine può essere eliminata singolarmente oppure con il pennello possono essere eliminate tutte in una sola volta: 17-7

202 Se torniamo ancora sul menu di creazione di una macroroutine abbiamo a disposizione altre funzioni Fig.17.7 Menu di editing delle macroroutine Partendo da sx, possiamo lanciare, creare, eliminare, importare, esportare una macroroutine ed infine eseguire un comando specifico associato ad una macroroutine. 17-8

203 18-1Genikon 18 Spot counting 18.1 Archivio Fig.18.1 Gestione casi Spot La gestione dei casi è simile alle modalità viste in precedenza. Le differenze sono: Nella main tool bar compare una nuova icona che consente di accedere all acquisizione in modalità spot counting. La modalità di acquisizione è completamente diversa e sarà descritta qui di seguito in maniera dettagliata. La selezione di un vetrino specifico per spot counting determina queste modifiche: 18-1

204 o Nella galleria delle immagini vengono visualizzati campi acquisiti su ogni specifico vetrino. Se abbiamo selezionato un singolo vetrino nella galleria immagini compaiono i campi acquisiti su quel vetrino (FOV=field of view). Se siamo in modalità singola cellula nella galleria compaiono due immagini associate a quella cellula: la prima è quello originale del fuoco, la seconda è invece l immagine elaborata. Se abbiamo selezionato la modalità tutte le cellule, nella galleria compaiono tutte le cellule elaborate. o Se digitiamo due volte sul FOV dalla galleria immagini si accede alla fase d elaborazione immagini o Quando si seleziona un vetrino acquisito in modalità Spot counting non è possibile importare alcun immagine su quel vetrino specifico ed i tools normalmente attivi appaiono non selezionabili: ( ). Se digitiamo l icona del set up. nella toolbar principale l utilizzatore può accedere alla finestra Fig.18.2 Set up del modulo Spot counting In particolare il set up consente di specificare le periferiche hardware connesse al sistema. Dobbiamo infatti considerare che per lo spot counting sono necessarie delle nuove componenti. 18-2

205 18-3Genikon tavolino motorizzato :Genikon gestisce il PRIOR e l OPTISCAN Controllo del fuoco : Optiscan ed E1000 Filtri : Non è ancora utilizzata: Tal selezione dell hardware specifico consente di abilitare una o più componenti. E fondamentale ora controllare che le porte seriale siano indirizzate correttamente Una configurazione di default si può comunque sempre richiamare digitando l apposita icona:.in particolare il default è così rappresentato: Tavolino motorizzato Optiscan prior focus drive prior optiscan com1 porta seriale L ultimo elemento importante è rappresentato dalla camera. Il modulo spot counting module lavora con camera a colori in particolare ad oggi sono interfacciate le seguenti Camere: nikon dxm1200f hesp firma Fire ware digital camera nikon ds-5mc 18.2 Ambiente di Acquisizione immagini Digitando l'icona dal Menu principale, è possibile accedere al menu Live solo se possibile accedere e se sono soddisfatte tutte le seguenti condizioni: 1. Che sia abilitato il modulo spot counting sulla chiave 2. Che il vetrino sul quale vogliamo iniziare ad acquisire sia vuoto 3. Che la camera digitale sia connessa ed interfacciata correttamente. 4. Che il tavolo motorizzato ed il controllo del fuoco siano connessi correttamente. Se una o più di queste condizioni non sono soddisfatte il programma genera un messaggio dove viene indicato l errore riscontrato. 18-3

206 Fig.18.3 Menu Acquisizione Nella barra di acquisizione compaiono ora tre nuove icone: 18.3 Calibrazione del sistema Icona di calibrazione. Consente di accedere alla menu relativo alla calibrazione del sistema. Questa operazione viene eseguita solo quando si installa per la prima volta la strumentazione e non dovrebbe essere necessaria in futuro a meno che lo strumento non venga spostato. E necessario prendere immagini a seconda dell obbiettivo che desideriamo o La telecamera in uso deve essere allineata correttamente. o L adattatore passo C non deve cambiare a calibrazione avvenuta o Calibrazioni diverse devono essere fatte per ogni obbiettivo(100x 60x) Fig.18.4 Calibrazione ottica Per creare una nuova calibrazione dobbiamo digitare la seguente icona: :. L operatore potrà editare il nome ed introdurre anche una nota specifica alla calibrazione. 18-4

207 18-5Genikon Fig.18.5 Nome e note sulla calibrazione Digitando l icona relativa all immagine della camera possiamo avere l immagine dal vivo con il micrometro di riferimento. Durante questa operazione premiamo il tasto centrale per disegnare la regione di interesse: Fig.18.6 Selezione della misura di calibrazione Settaggio dello Spot counting : è costituito da 3 tasti Definizione dell area: Fig.18.7 Definizione dell area di scansione Per definire l area procediamo come segue: 1. Digitare nel form due punti che definiscono l area rettangolare di lavoro. Poiché l immagine è live possiamo controllare da questa operazione i livelli di controllo della telecamera. 18-5

208 Step 1 Controllo set up camera Step 2Controllo set up camera sul secondo punto Step 3 Accettazione dei due punti relativi all area di scansione Al termine il sistema mostra che l area è stata definita Fig.18.8 visualizzazione dell area di scansione All interno dell area di scansione è comunque possibile selezionare una specifica area di lavoro (subregione).per effettuare ciò è sufficiente digitare il tasto di sx del mouse e tenerlo premuto fino all angolo opposto o dell area desiderata. Fig regioni interne all area totale scansione Se invece l operatore ritiene di volere lavorare sull area intera, digitiamo il tasto Area intera di scansione. 18-6

209 18-7Genikon 18.4 Definizione del tipo di analisi Prima di procedere alla scansione è necessario indicare al sistema quale tipo di campione si desidera analizzare. Attualmente Genikon è in grado di eseguire su campioni del tipo raffigurati in fig.18.9 Fig regioni interne all area totale scansione Per ogni fluorocromo è possibile definire il colore utilizzando la seguente icona: Che abilita il seguente menu: Fig definizione del colore del fluoroforo Sempre dal menu precedente possiamo accedere ad un altro form definito opzioni che consente di definire funzioni specifiche per il tipo di analisi che desideriamo svolgere. 18-7

210 Fig definizione del tipo di analisi 18.5 Inizio della scansione Inizio scansione immagine. Il sistema esegue una prescansione durante la quale è richiesto eseguire una correzione del punto di fuoco in manuale. Sempre durante questa fase è inoltre necessario eseguire un controllo delle seguenti funzioni: o Tempo di esposizione o contrasto o luminosità o gain o : le due icone consentono di trovare il primo campo valido. o : di salvare i settaggi della telecamera o : di richiamare i settaggi di default della telecamera o : di iniziare la scansione Durante il processo di scansione l utilizzatore può controllare come sta lavorando il sistema. 18-8

211 18-9Genikon Fig Visualizzazione del processo della scansione La procedura di scansione può essere interrotta utilizzando il tasto centrale della toolbar Elaborazione Al termine della scansione è possibile analizzare i risultati entrando nel menu di Elaborazione. Fig Menu di Elaborazione Nel Menu di Elaborazione troviamo una galleria specifica per lo Spot counting relativa alla visualizzazione dei nuclei. I nuclei sono divisi in tre categorie principali: Normali Anomali Non Classificati 18-9

212 I gruppi nella finestra possono essere visualizzati insieme o singolarmente ed è possibile editare ogni singola categoria quando si esegue un preview sul singolo nucleo: Fig Visualizzazione ed analisi del singolo nucleo Possiamo decidere di classificare diversamente il nucleo in esame come: o Anomalo o normale o Non classificato In figura osserviamo che il nucleo selezionato è quello in esame ed è quello sul quale si apportano le modifiche eventuali. Fig Selezione del nucleo in esame I tasti e permettono di cambiare le pagine Nella parte finale della finestra della galleria dei nuclei esiste un area dedicata ad analizzare i risultati: Fig rappresentazione del Field of View (FOV) 18-10

213 18-11Genikon Sulla finestra di sx si mostra l immagine del nucleo originale senza sottrazione del fondo. Volendo l immagine può essere ingrandita usando il tasto centrale del mouse. Nella toolbar prncipale ci sono tre tasti: o : Digitando questa icona il sistema rilocalizza il tavolino sul campo dove è collocato il nucleo. o : Digitando questa icona vengono invece mostrate le misure sull immagine. Fig rappresentazione delle misure E possibile disegnare delle misure di lunghezze che si ottengono in micron associando la calibrazione eseguita su quel specifico vetrino. E sufficiente disegnare la linea per avere il valore di misura ad esso relativo

214 19-Genikon Metaphase Finder Ricercatore di metafasi Concetti di base Il ricercatore di metafasi (Metaphase Finder) è un modulo opzionale di Genikon che permette la localizzazione e l acquisizione in automatico di metafasi all interno di uno o più vetrini. Occorre disporre della necessaria strumentazione hardware. Nello specifico: Microscopio provvisto di motorizzazione obiettivi e filtri Tavolino motorizzato Fuoco motorizzato Oil dispenser (facoltativo) Per ottenere l acquisizione delle metafasi occorre procedere attraverso più fasi di lavoro, che possono essere schematizzate in questo modo: Impostazioni preliminari Anteprima dei vetrini Individuazione metafasi Acquisizione A parte la configurazione delle impostazioni preliminari, le altre fasi di lavoro prevedono l utilizzo di un obiettivo specifico, da indicare con gli strumenti di configurazione. In particolare si parla di: Basso ingrandimento: solitamente 2x o 4x, per la creazione delle anteprime Medio ingrandimento: solitamente 10x o 20x, per l individuazione delle metafasi Alto ingrandimento: solitamente 60x o 100x ad olio, per l acquisizione delle metafasi 19_1

215 Opzioni La finestra di opzioni di Genikon presenta una sezione dedicata al ricercatore di metafasi. In questa finestra è possibile specificare di quale strumentazione si dispone. Barcode Reader: spuntare la casella se è installato un dispositivo di lettura dei codici a barre. Revolver: spuntare la casella in presenza di un revolver motorizzato non integrato nel microscopio. Tavolino Prior Selezionare il tipo di tavolino installato (1 o 4 vetrini) oppure caricatore PL-200. PLOIL Dispenser: spuntare la casella se è installato un dispositivo dispensatore di olio. Tavolino Marzhauser Selezionare il tipo di tavolino installato (4, 5 o 8 vetrini). Impostazioni preliminari Per iniziare ad utilizzare il ricercatore di metafasi, fare click sull apposito bottone della toolbar principale di Genikon. Disposizione dei vetrini sul piatto del tavolino L utilizzatore deve disporre i vetrini pronti per la scansione sui bay del piatto del tavolino. Ciascun bay ospiterà un vetrino. Attenzione: tutti i vetrini disposti sul piatto devono appartenere ad un unica modalità di lavoro (campo chiaro, oppure fluorescenza, oppure FISH, oppure SPOT COUNTING) Non sono possibili sessioni di lavoro in modalità mista es. campo chiaro e fluorescenza. L utilizzatore dovrà associare i vetrini su piatto ai corrispettivi casi presenti in archivio creandoli di nuovi se necessario. 19_2

216 Predisposizione dei casi e creazione dei vetrini in archivio Occorre predisporre uno o più casi dove verranno salvate le metafasi. In base ai vetrini disposti sul piatto del tavolino, creare un numero sufficiente di casi e/o vetrini. E possibile creare i casi ed i vetrini direttamente nell ambiente principale di Genikon, oppure utilizzare gli appositi strumenti del ricercatore di metafase. I bottoni del riquadro Caso servono per: per creare un nuovo caso; per eliminare il caso evidenziato. I bottoni del riquadro Vetrino servono per: per creare un nuovo vetrino nel caso selezionato; per eliminare il vetrino selezionato. Selezione della modalità di lavoro La modalità di lavoro si sceglie tramite la toolbar evidenziata in figura. Attenzione: la scelta della modalità di lavoro influenza tutti i vetrini sul piatto del tavolino. 19_3

217 Campo Chiaro Fluorescenza Fish Spot Counting Pulsante che consente di salvare, per la modalità di lavoro selezionata, il profilo evidenziato come default. Associazione di ciascun vetrino da scansionare ad uno specifico vetrino nell archivio con profilo di scansione Selezione del caso e del vetrino in archivio Si selezioni il caso a cui appartiene il vetrino da scansionare. Successivamente, si selezioni il vetrino che riceverà le metafasi trovate, all interno del caso selezionato. Per questa fase, si utilizzino lo liste del riquadro Elenco dei casi. 19_4

218 Selezione del profilo Esistono diversi profili di scansione pre-impostati, mostrati nella lista evidenziata in figura. Un profilo di scansione è formato da una serie di impostazioni specifiche che possono differire in base al tipo di preparato di ciascun vetrino. Per la descrizione dettagliata dei parametri che compongono un profilo, si consulti la sezione dedicata in questo manuale, oppure si contatti l assistenza tecnica Nikon. Associazione del vetrino fisico al vetrino dell archivio Per associare il vetrino fisico al relativo vetrino nell archivio dei casi, e per indicare al sistema di utilizzare il profilo selezionato, occorre premere il bottone Associa corrispondente al bay del vetrino scelto. 19_5

219 Una volta associato, sotto al bay del vetrino scelto vengono riportate le seguenti impostazioni: Nome del caso Nome del vetrino Profilo di scansione Per modificare anche solo una di queste impostazioni, occorre premere il bottone Annulla per annullare l associazione. Successivamente occorrerà modificare le scelte (come visto in precedenza) ed effettuare l associazione nuovamente (tramite il bottone Associa ). Nella figura mostrata sotto, viene mostrato come i vetrini 3 e 4 sono stati associati a casi diversi, con un diverso profilo di scansione. 19_6

220 Procedura interamente automatica Contrassegnare la casella Abilita procedura automatica per abilitare l acquisizione automatica di uno specifico numero di metafasi all alto ingrandimento. Questa procedura prevede che dopo l anteprima, il sistema inizi l individuazione delle metafasi, e, in automatico, ne acquisisca all alto ingrandimento, il numero specificato nella relativa casella di testo. Per procedere con le anteprime dei soli vetrini associati, si prema il bottone di ok: Per annullare, e tornare all ambiente principale di Genikon, premere il bottone di annullamento: Anteprima Una volta che l anteprima è iniziata, l ambiente del ricercatore di metafasi è mostrato nella figura sottostante. Prima della creazione dell anteprima, il sistema esegue alcune inizializzazioni: 19_7

221 Inizializzazione del tavolino E un operazione che prevede la completa movimentazione del tavolino. Viene eseguita solo la prima volta, e non viene ripetuta fino a che il programma Genikon non viene riavviato. Al termine delle anteprime sono eseguite alcune operazioni di autoregolazione a basso ingrandimento che avranno effetto per le anteprime successive: Rifocalizzazione Viene individuato il fuoco di riferimento a basso ingrandimento per ogni vetrino, reimpostando lo 0. Regolazione telecamera Viene effettuata un auto regolazione dei parametri della telecamera. L anteprima che viene composta, è mostrata nel riquadro in alto a sinistra. Inizialmente, la toolbar è completamente disabilitata. Dopo un breve periodo, viene abilitato il bottone di stop per consentire l annullamento dell operazione. Il bottone permette di riprendere l operazione. Al termine della fase di anteprima di tutti i vetrini selezionati, la parte in alto a destra mostra il piatto del tavolino con le anteprime. Individuazione e modifica delle aree di scansione all interno del vetrino Il sistema applica ad ogni anteprima l area di scansione predefinita per il profilo selezionato. E possibile modificare l area semplicemente andando a ridimensionare il rettangolo con il mouse. In alternativa, facendo click con il tasto destro del mouse sull anteprima si apre un menù che permette di eliminare una o tutte le aree impostate. Anche con il bottone della toolbar si possono eliminare tutte le aree. Con i bottoni e si sceglie la forma dell area di scansione che si vuole aggiungere. 19_8

222 Per aggiungere un area, semplicemente si traccia la figura direttamente sull anteprima del vetrino con il mouse, premendo il tasto sinistro. Per maggiore comodità, si possono visualizzare le anteprima in grande facendo doppio click con il pulsante sinistro del mouse sopra l anteprima di un vetrino. Si possono tracciare così le aree nella nuova finestra mostrata sotto. E possibile utilizzare i bottoni per passare in rassegna le anteprime dei vetrini, qualora sia stata effettuata l anteprima di più di un vetrino. Premere il bottone per chiudere la finestra e convalidare le modifiche alle aree. Premere il bottone per chiudere la finestra annullando le modifiche. Una volta che le aree sono state definite, si può procedere all individuazione delle metafasi. 19_9

223 Scansione e ricerca delle metafasi Per procedere all individuazione delle metafasi al medio ingrandimento si prema il bottone. Il sistema avvia la scansione dalla prima area del primo dei vetrini selezionati. Durante la ricerca delle metafasi, la finestra si modifica come indicato sotto. Nella parte in basso della finestra sono mostrate le metafasi trovate. 19_10

224 Il bottone della toolbar consente di mostrare o nascondere le anteprime delle metafasi. Attenzione: in questa fase le metafasi sono disposte in ordine temporale (nell ordine in cui sono state individuate), e non sono ordinate secondo alcun criterio di bellezza. E possibile visualizzare le metafasi per ciascuno dei bay (o vetrini) selezionati, ed anche per area di scansione. Nel primo caso si agirà sulle linguette poste sopra alle metafasi, nel secondo caso si selezionerà una delle voci Area a destra, a fianco delle metafasi. La visualizzazione delle metafasi è comunque a pagine, e sarà possibile sfogliarle agendo sui bottoni sempre a destra delle metafasi. L area che viene correntemente scansionata è evidenziata in blu. Le aree già scansionate sono contrassegnate in verde. Le aree che devono ancora essere scansionate sono evidenziate in rosso. E possibile ancora modificare le aree da scansionare, e perfino l area in fase di scansione. Per fare questo, premere il bottone di pausa scansione e procedere alla modifica delle aree come descritto precedentemente. Premere ancora il bottone per continuare con la scansione. Attenzione: se si modifica l area in fase di scansione, si perdono inevitabilmente tutte le metafasi trovate. Il bottone di stop serve per terminare il processo di scansione. Verranno mantenute le metafasi trovate per le aree completamente scansionate, mentre verranno perse quelle dell area in fase di scansione al momento della pressione del bottone di stop. Il bottone permette di terminare la scansione dell area corrente, e passare a scansionare l area successiva. Questo bottone è abilitato solo se c è un area di scansione successiva a quella corrente. 19_11

225 Uno specifico bottone della toolbar permette di scegliere se il fuoco ottimale deve essere calcolato automaticamente, oppure se si necessita di inserire manualmente una serie di punti di fuoco. = fuoco automatico (AF Automatico). = fuoco manuale (MF Manuale). La modalità iniziale di questo bottone è impostabile tramite le opzioni di scansione (vedi menù Opzioni scansione ). Acquisizione delle metafasi Premere il bottone per acquisire le metafasi all alto ingrandimento. Se invece si preme il bottone si torna all ambiente principale avendo salvato la scansione al medio ingrandimento, ma senza effettuare alcuna acquisizione all alto ingrandimento, acquisizione che potrà essere eseguita in un momento successivo. Inserimento manuale dei punti di fuoco Se è stata scelta la modalità manuale per quanto riguarda la ricerca del fuoco ottimale, si apre l ambiente mostrato in figura. 19_12

226 A sinistra è riportata l anteprima del vetrino. I punti evidenziati in blu sono già stati aggiornati, mentre il dot rosso indica il punto corrente. A destra c è l immagine in live, così com è vista dalla telecamera, con l obiettivo impostato per il medio ingrandimento. Si aprono anche altre due finestre: una è il joystick software, l altra mostra i punti di fuoco. Il sistema sceglie un certo numero di punti sui quali mettere a fuoco. Il numero di punti dipende dalla grandezza dell area. I punti scelti sono visualizzati nella finestra sottostante. I punti sono indicati da una coppia di coordinate X,Y. Il valore per l asse Z inizialmente non è assegnato. E quello che deve fare l utente manualmente. 19_13

227 Si selezioni il primo punto della lista. Il tavolino si sposta in quella posizione, e l immagine in live mostra il preparato. L utilizzatore a questo punto deve mettere a fuoco l immagine, agendo sul joystick di corredo al microscopio oppure sull interfaccia del joystick software. Una volta che l immagine è a fuoco, si prema il bottone Aggiorna punto. Il sistema riporterà nella colonna della Z il valore corrispondente a quella posizione sull asse Z. E la posizione di fuoco per quel punto. Premendo il bottone AutoFocus il sistema cerca di calcolare il valore sull asse Z ottimale per quel punto. Il bottone Auto Expo consente di effettuare l auto esposizione della telecamera. Il bottone >> permette di passare al punto di fuoco successivo. Per aggiungere ulteriori punti di fuoco, spostarsi con il tavolino su un nuovo punto, mettere a fuoco, e premere il bottone Aggiungi punto. Acquisizione vera e propria delle metafasi Si apre la finestra mostrata sotto. 19_14

228 Sulla parte sinistra è mostrata l anteprima del vetrino. Sono ben visibili, nella banda blu, i riferimenti del bay in scansione, e del vetrino così come viene registrato in archivio. Anteprime delle metafasi Nella parte inferiore sono riportate le anteprime delle metafasi trovate. E possibile mostrare o nascondere le anteprime delle metafasi utilizzando il bottone della toolbar. Selezionando un area, nella lista a fianco sulla destra, vengono visualizzate solo le metafasi di quell area di scansione. Selezionando il vetrino, vengono visualizzate tutte le metafasi di tutte le aree. Visualizzazione delle metafasi dell area 1 Visualizzazione delle metafasi dell area 2 Visualizzazione delle metafasi delle aree 1 e 2 19_15

229 Attenzione: le anteprime delle metafasi sono disposte per ordine di bellezza decrescente, quindi le prime mostrate sono le più belle, fino ad arrivare alle meno belle. La visualizzazione è a pagine, e possono essere sfogliate tramite i bottoni. Il bottone vetrino corrente. serve per eseguire la procedura di matching ovvero di centratura delle metafasi per il Selezione delle metafasi Se è stata impostata la procedura automatica, il sistema selezionerà le prime metafasi (tante quante specificato in precedenza). In caso di procedura manuale, sarà l utilizzatore a selezionare le metafasi che intende acquisire all alto ingrandimento. La selezione avviene facendo click con il tasto destro del mouse sull anteprima della metafase. L anteprima selezionata per l acquisizione viene evidenziata con un bordo blu. Passando con il cursore del mouse sopra le anteprime, si apre una finestra che mostra la metafase più in grande. Questa finestra resta visibile fin tanto che il cursore resta sopra un anteprima. Rilocalizzazione Facendo click con il tasto sinistro del mouse su di una anteprima, il sistema si posizionerà su quella metafase utilizzando l alto ingrandimento. La metafase che viene rilocalizzata avrà l anteprima evidenziata con un bordo magenta. Contestualmente il sistema si porta in live, con l immagine vista dalla telecamera mostrata in alto, sopra le anteprime. 19_16

230 Attenzione: se non è stato fatto in precedenza, il sistema richiederà di procedere al matching. Strumenti di selezione Utilizzando questi strumenti è possibile eliminare le anteprime indesiderate. Dopo aver selezionato un certo numero di anteprime, se si contrassegna la voce Mantieni e si preme il bottone di conferma il sistema eliminerà tutte le metafasi eccetto quelle selezionate. Se invece si contrassegna la voce Cancella e si preme il bottone di conferma solo le metafasi selezionate. il sistema eliminerà Il bottone cancella la selezione effettuata. 19_17

231 Acquisizione Per procedere all acquisizione, premere il bottone di avvio macro mostrato sotto. del pannello di strumenti Il sistema mostrerà il seguente messaggio. Premere Si per acquisire solo le metafasi selezionate. Premere No per acquisire tutte le metafasi (selezionate e non selezionate). Premere Annulla per annullare l acquisizione. Durante la fase di acquisizione le metafasi già acquisite sono evidenziate da un bordo verde, la metafase in fase di acquisizione avrà un bordo magenta, mentre le metafasi ancora da acquisire avranno un bordo blu. Al termine dell acquisizione, le metafasi acquisite all alto ingrandimento sono già disponibili in archivio. E possibile visualizzare le immagini acquisite oppure visualizzare l anteprima del vetrino tramite il bottone della toolbar. 19_18

232 Menù La finestra di anteprima e di scansione dispone del seguente menù, per le impostazioni e gli strumenti. Ricercatore Questo menù permette di accedere ad alcune finestre per la configurazione del ricercatore di metafasi. Calibrazione obiettivi Selezionando la voce Calibrazione obiettivi si apre la finestra mostrata sotto. 19_19

233 E possibile impostare l obiettivo da utilizzare selezionandolo dalla lista. Premere il bottone Autocalibra con rotazione per effettuare la verifica dell allineamento della telecamera relativamente all obiettivo impostato. Viene effettuata una serie di spostamenti lungo gli assi X ed Y. Al termine dell operazione il sistema calcola i due valori di rotazione della telecamera. Entrambi i valori devono essere il più vicino possibile a Attenzione: se uno dei due valori è maggiore di è assolutamente necessario contattare l assistenza tecnica. Opzioni preview Selezionando la voce Opzioni preview si apre la finestra mostrata sotto. Spuntare la casella Fuoco manuale iniziale per impostare manualmente il fuoco prima di iniziare un anteprima. Spuntare la casella Abilita inizio scansione dopo preview per avviare la procedura di ricerca delle metafasi al termine delle preview. Per definire le aree di anteprima, premere il bottone Precedura Guidata Preview. Verrà iniziata una procedura guidata che porterà l utilizzatore a definire le zone su cui eseguire l anteprima (affinché coincidano esattamente con la posizione dei vetrini nel piatto). Per regolare le impostazioni della telecamera, premere il bottone Regolazioni. Per effettuare comunque una regolazione automatica della telecamere dopo le operazioni di anteprima, spuntare la casella Auto regola. Opzioni scansione Selezionando la voce Opzioni scansione si apre la finestra mostrata sotto. 19_20

234 Queste impostazioni sono rivolte, per la maggior parte, al personale tecnico. Per l utilizzo consueto, è raccomandato che siano settate le seguenti impostazioni: Tipo scansione = Fast Standard Fuoco = AF Automatico Accelerazione rampa Z = Slow Utilizza fuoco di riferimento calcolato a basso ingrandimento = Si Ricerca AUTOMATICA da preview = Si (che prevede di calcolare il fuoco ottimale sul campo con maggior contenuto di preparato) Regolazione automatica e telecamera e shading = Si E inoltre possibile selezionare l obiettivo di scansione, ed effettuare le regolazioni della telecamera. Profili E possibile regolare i parametri dei profili di acquisizione. Questo TOOL è riservato alla assistenza tecnica ed è impiegarsi in fase di configurazione iniziale del sistema. Esci Esce dall ambiente di ricerca delle metafasi. Strumenti Nel menù, selezionare la voce Strumenti. Premere sulla voce Modalità avanzata. Il suddetto menù viene arricchito con una serie di voci che consentono di aprire delle finestre per l utilizzo di strumenti di regolazione e controllo. Regolazioni della telecamera Apre una finestra che permette di regolare la telecamera. E una finestra ad uso esclusivo del personale tecnico. 19_21

235 Joystick software Apre una finestra che permette di muovere il tavolino motorizzato attraverso un joystick virtuale. Tramite questa finestra è possibile spostare il tavolino lungo gli assi X e Y usando il pomello giallo. Per gli spostamenti sull asse Z (fuoco) si agisce sulla barra posta sulla destra della finestra. Info XYZ Apre una finestra che mostra in tempo reale le informazioni sul tavolino motorizzato (posizione negli assi X, Y e Z). Tavolino motorizzato Apre una finestra ad uso esclusivo del personale tecnico. 19_22

236 Fuoco Apre una finestra ad uso esclusivo del personale tecnico. 19_23