Principali tecniche di cromatografia per la separazione delle proteine

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1 Principali tecniche di cromatografia per la separazione delle proteine Gel filtrazione Interazioni idrofobiche Scambio ionico Affinità La cromatografia è un metodo di separazione che si basa sulla differente ripartizione dei composti di una miscela tra una fase mobile ed una fase stazionaria fissa. I composti da separare sono introdotti nella fase mobile e si ripartiscono lungo la colonna cromatografica in funzione della loro affinità relativa per la fase mobile e per la fase stazionaria. La separazione dei componenti di una miscela si ottiene in seguito alle interazioni chimiche che avvengono tra le molecole disciolte nella fase mobile e la superficie della fase stazionaria: queste interazioni possono avvenire con la superficie stessa del supporto solido, con un liquido che ricopre il supporto in modo omogeneo o ancora con molecole ad esso legate in maniera covalente. Dal momento che i diversi componenti della miscela da separare interagiscono in maniera differente con la fase stazionaria, si muovono lungo la colonna cromatografica con velocità diverse: i composti che sono più affini alla fase stazionaria si muovono in media più lentamente di quelli che sono più affini alla fase mobile. 1

2 Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico Iniettore Pompa Fase Stazionaria RIVELATORE Fase mobile Scarico Colonne per HPLC Rivelatori per HPLC 2

3 adsorbimento Esclusione molecolare o Gel filtrazione L interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto). Le molecole piu grandi si distribuiscono solo nel volume Vo (volume escluso), quelle piu piccole nel volume totale Vt quelle intermedie nel volume Ve. Il coefficiente di partizione Kav = (VeVo)/(VtVo) Kav puo andare tra 1 (Ve=Vt: mol. piccole) e 0 (Ve=Vo: mol grandi) Per molecole di forma simile, c e proporzionalita tra il coefficiente di partizione (Kav) e il logaritmo del Peso Molecolare. La cromatografia per gelfiltrazione e usata anche analiticamente. 3

4 Esclusione molecolare o Gel filtrazione Applicazioni della cromatografia ad esclusione molecolare Purificazioni Determinazione M r Dissalazione Concentrazione Analisi proteinaligando Esempi di sostanze purificate con questa tecnica: virus, proteine, enzimi, ormoni, anticorpi, acidi nucleici, polisaccaridi. Molto usata anche per separare le forme monomeriche da quelle polimeriche. A differenza dell elettroforesi, con questa tecnica e possibile la stima della massa molecolare anche in condizioni native, se si confrontano proteine di forma simile. Dal momento che le proteine e altre macromolecole biologiche hanno dimensioni molto piu grandi rispetto ai sali e ad altre piccole molecole, questa tecnica e particolarmente efficiente per rimozione di sali cambio di buffer Soluzioni di sostanze ad alto peso molecolare possono essere concentrate Questa tecnica e comune mente usata per studiare il legame reversibile tra macromolecole e loro ligandi a basso peso molecolare. Puo essere anche usata per la determinazione di costanti di equilibrio. Determinazione peso molecolare Una proteina sconosciuta eluisce a 170 ml: 40,000 Da (40KDa) 4

5 Cromatografia per interazione idrofobica PRINCIPIO: sfrutta l idrofobicità superficiale delle proteine (residui Amminoacidici non polari) FASE STAZIONARIA: matrice inerte a cui sono legati gruppi idrofobici (gruppi ottilici, fenilici, butilici ecc) FASE MOBILE tampone polare A concentrazione salina decrescente (riduzione degli effetti idrofobici) A concentrazione di detergente crescente Con variazione di ph Cromatografia per interazione idrofobica (HIC) È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d acqua ordinate le proteine tendono così ad interagire fra loro ( salting out ). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. È una cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. L eluizione può essere fatta con forza ionica decrescente oppure per spiazzamento con detergenti non ionici (Tween 20, Triton X100). LIGANDO Porzione idrofobica Proteina Molecole d'acqua Molecole d'acqua liberate in seguito alla legate in modo ordinato interazione idrofobica alla superficie idrofobica alla superficie idrofobica LIGANDO Porzione idrofobica Proteina O O CH 3 OH Butil Sefaroso O OH O CH 3 Octil Sefaroso O OH O Fenil Sefaroso Alchil Sefaroso O CH 3 O CH 3 OH CH 3 5

6 Le fasi stazionarie idrofobiche sono: Octylagarose, Phenylagarose che contengono gruppi funzionali nonpolari come alcani o gruppi aromatici. La miscela proteica viene disciolta in un tampone di alta forza ionica [1M(NH4)2SO4] Si userà o un gradiente di forza ionica che deve essere discendente oppure si usa un gradiente di ph crescente per aumentare l'idrofilicità della proteina oppure lo spiazzamento selettivo mediante molecole che hanno una affinità per la fase stazionaria maggiore di quella della proteina. Grazie alla natura delle interazioni idrofobiche e alla forza ionica, la cromatografia idrofobica e la cromatografia di scambio ionico possono convenientemente essere usate sequenzialmente. Ad esempio, dopo uno scambio ionico la proteina si trova in condizioni di alta concentrazione salina, in questo modo può essere caricata direttamente su una colonna idrofobica. Al contrario, una colonna idrofobica viene eluita in condizioni di bassa concentrazione salina che è un requisito per far legare le proteine su una resina a scambio ionico. l'hic viene svolta con un solvente acquoso e con variazioni di forza ionica per eluire la colonna. Le proteine tipicamente si legano nella forma nativa attraverso gruppi idrofobici presenti sulla loro superficie. Lo stato nativo viene mantenuto durante le condizioni di eluizione. Cromatografia a scambio ionico PRINCIPIO: attrazione fra particelle cariche di segno opposto. Proteine > carica dipende dal loro pi e dal ph soluzione Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina scambiatrice di ioni. Esistono due tipi di resine: gli scambiatori anionici e gli scambiatori cationici. A seconda del ph di ionizzazione della proteina si possono usare scambiatori forti o deboli; scambiatore forte è quella resina che è ionizzata a ph elevato, al contrario quella debole. Un proteina ionizzata a ph 10 richiede l'uso di uno scambiatore forte, mentre se una proteina è ionizzata a ph 6 basta uno scambiatore debole. 6

7 Cromatografia a Scambio Ionico La cromatografia a scambio ionico si basa su interazioni di tipo elettrostatico. Il ph del sistema gioca un ruolo fondamentale in questo tipo di cromatografia dato che tramite sue variazioni si può far variare le cariche sia della fase stazionaria che delle molecole analizzate. Particella funzionalizzata con gruppi ionizzabili (FASE STAZIONARIA) SCAMBIATORE Controioni Proteina anionico 7

8 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Metodi di eluizione Gradiente di forza ionica Gradiente di ph Competizione per lo scambiatore tra ioni e molecole analizzate Variazione della carica delle molecole comporta il distacco dallo scambiatore FS FS ESEMPIO Cromatografia a scambio anionico SAX Tre proteine: A: pi = 5, B: pi = 6, C: pi = 7 Punto isolelettrico di una proteina: ph al quale la carica netta di una proteina è uguale a 0 Più basso Tre è proteine: il punto isoelettrico di una proteina maggiore è la proporzione tra i suoi gruppi acidici e quelli basici e viceversa. ph = 8 ph = 6,5 SAX A 3 ad eluire B 2 ad eluire Interazione forte Interazione media SAX A 3 ad eluire B 2 ad eluire C Interazione C debole 1 ad eluire 1 ad eluire ma non si lega alla FS poiché al di sotto del pi presenta carica netta positiva! Eluita con il volume morto, non sottoposta al processo cromatografico ESCLUSA Nella cromatografia a scambio ionico si possono distinguere cinque fasi: 1) Diffusione della molecola alla superficie dello scambiatore. 2) Diffusione della molecola attraverso la struttura della matrice sino al sito di scambio. Questa fase dipende dal numero di legami crociati presenti e dalla concentrazione della soluzione. 3) Scambio di ioni al sito di scambio. Questo passaggio si realizza instantaneamente ed è un processo che va all'equilibrio. Quanto maggiore è la carica della molecola da scambiare, tanto più forte è il legame, e meno facilmente può essere sostituita da altri ioni. 4) Diffusione dello ione scambiato attraverso lo scambiatore fino alla superficie. 5) Distacco selettivo dello ione attraverso lo scambiatore grazie all'eluente e diffusione della molecola nel volume esterno. Il distacco selettivo si ottiene modificando ph o forza ionica. 8

9 in genere i campioni vengono caricati in condizioni di bassa forza ionica e le sostanze che si legano alla colonna vengono eluite usando o un eluizione a gradiente o a step di un tampone che ha una forza ionica più alta. una proteina si legherà a una resina a scambio cationico se il ph del tampone è più basso del suo punto isoelettrico (pi) e si legherà ad una resina a scambio anionico se il ph del tampone è più alto del suo pi. Separazione di tre Proteine CROMATOGRAFIA di AFFINITA Principio: Separa le biomolecole sfruttando interazioni biospecifiche tra un ligando immobilizzato (fase stazionaria) e le biomolecole stesse Cromatografia di affinità Sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche. M L ML macromolecola ligando complesso attaccato alla matrice 9

10 Cromatografia di affinità Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono lavate via. La proteina di interesse viene eluita mediante diversi metodi. Spesso si utilizza una soluzione di ligando. Questo metodo necessita di accurate conoscenze sulla struttura e sulla reattività della molecola da separare. Il ligando utilizzato, che di solito è legato ad un braccio spaziatore per rendere più accessibile il legame con la proteina, deve avere le seguenti caratteristiche: il gruppo chimico da legare alla matrice o al braccio spaziatore non deve essere coinvolto nel legame con la macromolecola da purificare. Questi gruppi sono generalmente amminici, carbossilici, tiolici, alcolici o fenolici; deve essere attaccato alla matrice in modo da non interferire con la capacità di legare la macromolecola; il braccio spaziatore tra ligando e matrice deve avere una lunghezza di 610 atomi di C. Alcuni bracci sono di natura idrofobica e altri di natura idrofila. Cromatografia di affinità Resina HO O OH HO O O OH Braccio spaziatore OH OH OH Ligando 10

11 La matrice ideale da utilizzare nella cromatografia di affinità deve possedere le seguenti caratteristiche: deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare covalentemente il ligando e deve risultare stabile nelle condizioni in cui avviene tale attacco; deve essere stabile nelle condizioni di interazione della macromolecola e nella successiva eluizione; non deve interagire, se non debolmente, con altre macromolecole, per evitare un adsorbimento aspecifico; In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio (Sepharose 4B e 6B, BioGel A), gel di poliacrilammide (BioGel P) e cellulosa. Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità 11

12 Cromatografia di affinità con anticorpi COS E LA PROTEOMICA? The total PROTEIN complement of a GENOME (M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995, ) La Proteomica è lo studio del PROTEOMA Proteoma L insieme completo di proteine codificate dal genoma ed espresse in una cellula L insieme di tutte le isoforme, delle modificazioni posttraduzionali e delle interazioni delle proteine Studio delle alterazioni delle proteine in particolari condizioni: malattia, trattamento, tempo, ecc. Mentre il genoma è costante per una data cellula ed identico per tutte le cellule di un organismo, e non cambia molto all interno della specie, il proteoma è molto dinamico nel tempo, risponde a fattori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari. 12

13 PUPA FARFALLA Stesso GENOMA diverso PROTEOMA Invecchiamento Perché la Proteomica? La Proteomica ha come obiettivo lo studio dell'espressione delle proteine in diversi tessuti, liquidi biologici ed anche organi vitali Fegato, reni, cuore, ecc. Plasma, liquor, ecc. Latte, carne, ecc. Lo studio dell espressione e funzione delle Proteine e dei meccanismi fisiopatologici in cui sono coinvolte aiuta a: Comprendere quali sono i meccanismi alla base dell insorgenza di malattie Identificare le alterazioni proteiche 13

14 Modificazioni posttraduzionali Acetilazione, metilazione Fosforilazione Glicosilazione (enzimatica) Glicazione (non enzimatica) Nitrazione/denitrazione Cleavage Protein splicing Tagging Purificazione delle proteine Estrazione delle proteine Determinazione delle proteine totali Frazionamento Tecniche di separazione cromatografica ed elettroforetica Monitoraggio del processo di purificazione APPROCCIO CLASSICO PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE E BIDIMENSIONALE VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI SPETTROMETRIA DI MASSA BIOINFORMATICA 14

15 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobiche Prevenzione dell aggregazione proteica e mantenimento della solubilità Prevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di estrazione Rimozione di macromolecole che possono dare interferenze Resa proteica adeguata per l analisi, che potrebbe implicare la rimozione di specie proteiche molto abbondanti Le proteine devono essere denaturate e solubili Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con: Urea (il più utilizzato agente denaturante,caotropico, capace di rompere i ponti idrogeno intra e inter molecolari) Tiourea ( denaturante usato in associazione con urea per aumentare la solubilità del campione) Agenti riducenti (capaci di rompere i ponti disolfuro) Detergenti (non ionici, utilizzati perché capaci di rompere legami idrofobici ed aumentare la solubilità proteica al relativo punto isoelettrico) Inibitori di proteasi (per quegli enzimi che riescono a rimanere attivi) ELETTROFORESI Il termine elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico. Molte molecole di interesse biologico, come gli amminoacidi, i peptidi, le proteine, i nucleotidi e gli acidi nucleici, possiedono gruppi ionozzabili e, quindi, ad ogni valore di ph sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche, sia come cationi () che come anioni (). Sotto l influenza di un campo elettrico, queste molecole cariche migrano verso il catodo o l anodo, a seconda che possiedano una carica negativa o positiva. L elettroforesi permette di valutare alcune proprietà delle proteine come il punto isoelettrico (pi) e la massa molecolare relativa (M r ). 15

16 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) La matrice di supporto della migrazione è costituita, nella maggior parte dei casi da un gel che può essere di poliacrilammide o in altri casi di agarosio. Per quanto riguarda l analisi di proteine, il supporto più diffuso è il gel di poliacrilammide che è chimicamente inerte e viene preparato facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N metilenbisacrilammide (o bisacrilammide) che viene utilizzata come agente in grado di formare legami trasversali. Il processo di polimerizzazione dei monomeri di acrilammide e bisacrilammide è un tipico esempio di catalisi radicalica e inizia con l aggiunta di un catalizzatore come il persolfato di ammonio e un iniziatore come la N,N,N,N tetrametilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (R ): S 2 O 2 8 1e SO 2 4 SO 4 Possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente: R M RM RM M RMM RMM M RMMM... dove M è il monomero di acrilammide. Formazione di un gel di poliacrilammide a partire da acrilammide e bisacrilammide 16

17 I gel di acrilammide vengono definiti in base alla percentuale totale di acrilammide presente e le dimensioni dei pori del gel sono determinati dalle concentrazioni di acrilammide e bisacrilammide impiegate, agendo, quindi, da setacci molecolari rallentando la migrazione delle proteine proporzionalmente alla loro massa molecolare: Gel al 10% di acrilammide ha setacci più ampi, quindi adatto alla separazione di molecole più grandi, rispetto ad un gel al 12%, a sua volta con setacci più ampi di un gel al 14% di acrilammide, e così via. Gel a gradiente es. 914% di acrilammide 9% 14% Nell elettroforesi la forza che muove le macromolecole è il potenziale elettrico E. La mobilità elettroforetica della molecola (μ), che è il rapporto tra la velocità V della particella ed il potenziale elettrico E, è anche uguale al rapporto tra la carica netta della molecola Z ed il coefficiente frizionale f V μ = = E Z f Elettroforesi su gel di poliacrilammide con Sodio Dodecilsolfato (SDSPAGE) 17

18 ELETTROFORESI MONODIMENSIONALE VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI Dopo la corsa elettroforetica, le proteine possono essere evidenziate mediante impiego di particolari coloranti come il Blue di Coomassie, il Nitrato d Argento o coloranti fluorescenti, capaci di legarsi alle proteine, ma non al gel, con una differente sensibilità. Ogni banda sul gel rappresenta una o più proteine con un determinato peso moledolare. La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine standard, delle quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel. 18

19 WESTERN BLOTTING (PROTEIN BLOTTING) Consiste nel trasferire inizialmente le proteine separate nel gel di poliacrilammide su una membrana di nitrocellulosa. I metodi per trasferire le proteine dal gel alla nitrocellulosa sono diversi: per capillarità (capillary blotting), per diffusione, blotting sotto vuoto ed elettroblotting. Tra questi il metodo più utilizzato per la sua velocità ed efficienza è l elettroblotting, in cui il processo di trasferimento delle proteine avviene per elettroforesi. Schema di allestimento del Sandwich per il trasferimento delle proteine. Una volta avvenuto il trasferimento si procede alla rivelazione del blot; spesso si utilizzano anticorpi specifici in grado di riconoscere una particolare proteina (anticorpi monoclonali). Il blot viene preventivamente incubato in una soluzione proteica, ad esempio albumina di siero bovina o latte in polvere, in modo da saturare tutti i siti idrofobici rimasti liberi sulla membrana; in questo modo si riducono notevolmente le interazioni aspecifiche con gli anticorpi. Il blot viene quindi incubato con una soluzione diluita di antisiero, chiamato anticorpo primario, diretta contro la proteina di interesse. Le IgG contenute nell antisiero si legano al proprio antigene, rimanendo legate al blot. Per poter visualizzare questa interazione la membrana viene incubata ulteriormente con una soluzione contenente anticorpi secondari, in grado di riconoscere la porzione costante della molecola di IgG usata come anticorpo primario. 19

20 Gli anticorpi secondari sono marcati in modo da poter essere individuati una volta legati all anticorpo primario. Uno dei metodi più comuni di rivelazione utilizza anticorpi secondari coniugati ad un enzima. In questo caso, dopo essere stato trattato con anticorpo secondario, il blot viene incubato in una soluzione contenente il substrato dell enzima, che viene convertito in un prodotto colorato insolubile che precipita sulla nitrocellulosa. Come enzima coniugato agli anticorpi secondari viene spesso usata la perossidasi di rafano, che viene rilevata con il metodo della chemiluminescenza intensificata. In presenza di acqua ossigenata, la perossidasi ossida il luminolo, un substrato chemiluminescente, con la concomitante produzione di luce, la cui intensità aumenta fino a mille volte in presenza di un intensificatore chimico. La luce emessa può essere rilevata esponendo il blot ad una lastra fotografica. Reazione di ossidazione del luminolo 20

21 La presenza di bande colorate indica, quindi, la posizione della proteina o delle proteine di interesse. Esempio di SDSPAGE e relativo Western Blot 204 KDa 131 KDa Std 89 KDa Serum Albumin 42 KDa 31 KDa 17 KDa 7 KDa Silver Nitrate staining Immunoblot Isoelettrofocalizzazione (IEF) Questa tecnica permette di separare molecole in funzione del loro diverso punto isoelettrico. Ideale per la separazione di molecole anfotere come le proteine. Il sistema IEF più utilizzato è costituito da gel orizzontali montati su piastre di vetro o foglietti di materiale plastico. All interno del gel viene formato un gradiente di ph introducendo delle molecole chiamate anfoliti, le quali sono costituite da miscele complesse di acidi poliamminopolicarbossilici sintetici. In commercio sono disponibili anfoliti che coprono diversi intervalli di ph, sia ampi (ad esempio ph 310), che più ristretti (ad esempio ph 7 8). 21

22 Formula generica di anfoliti usati nell isoelettrofocalizzazione Una proteina in soluzione può possedere numerose cariche che le derivano dalla ionizzazione di gruppi delle catene laterali di determinati amminoacidi. Il fatto che i gruppi ionizzabili siano in forma ionica dipende dal ph del mezzo in rapporto al pk dei gruppi stessi: ad un ph superiore al pk si ha dissociazione di protoni, ad un ph inferiore al pk si ha associazione di protoni. La carica netta di una proteina ad un dato ph è la somma algebrica delle sue cariche positive e negative. Il punto isoelettrico di una proteina è il valore di ph cui la sua carica netta è 0. A questo valore di ph anche la mobilità elettroforetica è zero. Se si utilizza un gel con un gradiente stabile di ph, ciascuna proteina si muoverà fino alla posizione in cui il ph corrisponde al suo pi: in tal modo è possibile separare proteine che hanno una differenza anche di solo 0,01 nel loro pi. 22

23 Il campo elettrico applicato fa sì che le proteine si muovano fino a raggiungere i propri punti isoelettrici, nel quale, le molecole sono sotto forma di zwitterione, dunque non avendo carica non si muovono più. pi = pi = ph3 ph10 ph = 7.4 ph = 8.4 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2DPAGE) Questa tecnica combina le caratteristiche della IEF, nella quale le proteine sono separate in base alla loro carica (pi), con le caratteristiche della SDSPAGE, nella quale la separazione avviene in base al loro peso molecolare. E uno dei metodi analitici più sofisticati per la separazione di una miscela complessa di proteine, con alto grado di risoluzione PRIMA DIMENSIONE (IEF) Gradiente di ph SECONDA DIMENSIONE (SDSPAGE) PM 23

24 Esempio di 2DPAGE NL 3 pi 10 Std KDa ph 311 B ph

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