Sintesi di prodotti commerciali

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1 Sintesi di prodotti commerciali Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri 1

2 Endonucleasi di restrizione I microrganismi produttori di endonucleasi di restrizione proteggono il proprio DNA tramite: 1. Metilazione del DNA 2. Localizzazione dell enzima nello spazio periplasmico (gram-) Circa 500 enzimi disponibili, isolati da un ampio gruppo di microrganismi Per semplificare la produzione: clonaggio e espressione in E.coli Produzione di endonucleasi di restrizione in E.coli Come evitare la digestione del DNA di E.coli da parte di un enzima di restrizione estraneo? Clonare ed esprimere il gene della endonucleasi di restrizione + il gene dell enzima di modificazione (metilazione) Conveniente solo se i geni della endonucleasi di restrizione e dell enzima di modificazione (metilazione) sono vicini nel cromosoma 2

3 Esempio di strategia utilizzabile 1. Genoteca di un microrganismo donatore in E.coli 2. Crescita delle cellule in terreno liquido selettivo (+antibiotico) 3. Purificazione DNA plasmidico totale 4. Trattamento con l endonucleasi di restrizione target 5. Trasformazione di E.coli con il plasmide trattato => Crescita dei cloni contenenti l enzima di modificazione => Analisi dei cloni per la presenza dell enzima di restrizione Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri 3

4 Sintesi della vitamina C (acido L-ascorbico) Procedimento industriale Sintesi della vitamina C (acido L-ascorbico) Produzione microbica di acido 2-cheto-L-gulonico (2-KLG) Acetobacter Gluconobacter Erwinia Sanno trasformare il glucosio in acido 2,5- dicheto-d-gluconico (2,5-DKG) Corynebacterium Brevibacterium Arthrobacter Trasformano 2,5-DKG in 2-KLG grazie all enzima 2,5-DKG-reduttasi 4

5 Sintesi della vitamina C (acido L-ascorbico) Produzione microbica di acido 2-cheto-L-gulonico (2-KLG) Varie fasi enzimatiche unica fase enzimatica Sintesi della vitamina C (acido L-ascorbico) Produzione microbica di acido 2-cheto-L-gulonico (2-KLG) Approccio più semplice: Isolare il gene 2,5-DKG-reduttasi di Corynebaterium e farlo esprimere in Erwinia 5

6 Sintesi della vitamina C (acido L-ascorbico) Produzione microbica di acido 2-cheto-L-gulonico (2-KLG) 2,5-DKG-reduttasi 6

7 Mutagenesi per migliorare l attività catalitica e la stabilità dell enzima 2,5-DKG-reduttasi Modello eseguito al computer Mutagenesi per migliorare l attività catalitica e la stabilità dell enzima 2,5-DKG-reduttasi 12 mutanti Glu192 Arg Gly55/57 Ala aumento dell attività aumento della stabilità 7

8 Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri 8

9 Sintesi degli aminoacidi Produzione mondiale: 800,000 tonnellate/anno Acido L-glutammico >400,000 tonnellate/anno PRODUZIONE ATTUALE Estrazione da idrolisati proteici Prodotti di batteri gram-positivi Corynebacterium Brevibacterium mutagenizzati e selezionati per individuare i ceppi in grado di sovraprodurre certi aminoacidi Miglioramento della sintesi di aminoacidi in Corynebacterium e Brevibacterium implica: a) Conoscenza dettagliata dei pathways biochimici di sintesi b) Vettori di espressione adatti c) Protocollo di trasformazione efficiente 9

10 Via biosintetica del triptofano in C. glutamicum Antranilato sintasi Produzione di triptofano da parte di C.glutamicum mg/ml di coltura C.glutamicum selvaggio 0.48 C.glutamicum selvaggio + plasmide (ANS)

11 Via biosintetica del triptofano in C. glutamicum 3-deossi-D- arabinoeptulosonato-7- fosfato sintasi Antranilato sintasi Antranilato fosforibosiltransferasi Probabile alternativa futura: Produzione di aminoacidi in E. coli (vie metaboliche e procedure di manipolazione molto ben caratterizzati) 11

12 Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri Oltre 6000 antibiotici isolati da vari microrganismi Molti dei più importanti antibiotici isolati dal batterio gram-positivo Streptomyces Produzione mondiale: 100,000 tonnellate/anno 100/200 nuovi antibiotici scoperti all anno Solo 1% entra in commercio 12

13 Streptomyces: principale organismo utilizzato per produrre antibiotici Manipolazione genetica di Streptomyces Manipolazione genetica di Streptomyces 13

14 Manipolazione genetica di Streptomyces Tecnologia del DNA ricombinante: 1. Può servire a sviluppare antibiotici nuovi (+efficaci e tossici) 2. Può servire per aumentare le rese e abbassare i costi 14

15 Clonazione dei geni della biosintesi di antibiotici La biosintesi degli antibiotici richiede da 10 a 30 distinte reazioni enzimatiche => Difficile clonare tutti i geni per la sintesi di un antibiotico Strategie utilizzate: 1. Complementazione 2. Identificazione/purificazione di un enzima chiave Clonazione dei geni della biosintesi di antibiotici 1. Complementazione Ceppo selvaggio DNA cromosomiale Digestione Ceppo mutante trasformazione Selezione dei cloni che producono antibiotico Utilizzo del DNA dei cloni positivi come sonda Screening di un altra genoteca del ceppo selvaggio Costruzione di un cluster genico completo 15

16 Undecilprodigiosina (da Streptomyces coelicolor) Clonazione dei geni della biosintesi di antibiotici 2. Identificazione/purificazione di un enzima chiave Analisi biochimiche Identificazione e purificazione di un enzima del percorso biosintetico Determinazione della sequenza aminoacidica Preparazione di sonde per il gene in esame Screening di una genoteca 16

17 Sintesi di nuovi antibiotici tramite introduzione in un unico organismo di vie di sintesi di altri antibiotici appartenenti alla stessa famiglia. I nuovi antibiotici costituiscono lievi varianti strutturali degli antibiotici preesistenti e sono sintetizzati perché l intermedio di una via biosintetica può divenire substrato per un altra via. 17

18 Sintesi di varianti strutturali degli antibiotici: Actinorhodina Medermicina Granaticina Diidrogranaticina isocromanechinoni ph basico 18

19 Streptomyces: produce medermicina pij2303: reca frammento di DNA di S. coelicolor e produce actinorhodina pij2315: frammento di pij

20 Antibiotici polichetidi Sintetizzati tramite condensazione enzimatica di acidi carbossilici (acetato, propionato, butirrato) Prodotti da funghi, vegetali e actinomiceti (come metaboliti secondari) Es: eritromicina 2 classi di polichetide sintasi Sito attivo su un unico peptide Complessi di polipeptidi con siti attivi separati 20

21 Modificazione di uno dei domini catalitici = Modificazione dell antibiotico sintetizzato Condizione necessaria: aggregato di geni che codifica un particolare polichetide antibiotico deve essere ben caratterizzato Esempio: eritromicina Sintetizzata da Saccharopolyspora erythraea Aggregato genico ery (56 kb) Polichetide sintasi alterata in 2 modi diversi: 1. Eliminare attività β-chetoreduttasi 2. Modificare attività enoilreduttasi 21

22 Science ; 291: Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Pfeifer BA, Admiraal SJ, Gramajo H, Cane DE, Khosla C. The macrocyclic core of the antibiotic erythromycin, 6- deoxyerythronolide B (6dEB), is a complex natural product synthesized by the soil bacterium Saccharopolyspora erythraea through the action of a multifunctional polyketide synthase (PKS). The engineering potential of modular PKSs is hampered by the limited capabilities for molecular biological manipulation of organisms (principally actinomycetes) in which complex polyketides have thus far been produced. To address this problem, a derivative of Escherichia coli has been genetically engineered. The resulting cellular catalyst converts exogenous propionate into 6dEB with a specific productivity that compares well with a high-producing mutant of S. erythraea that has been incrementally enhanced over decades for the industrial production of erythromycin. 22

23 Tecnologia del DNA ricombinante: 1. Può servire a sviluppare antibiotici nuovi (+efficaci e tossici) 2. Può servire per aumentare le rese e abbassare i costi Bassa resa nella produzione su larga scala di antibiotici Causa: Limitata quantità di ossigeno (colture dense filamentose) Rimedi: Migliorare i bioreattori Sviluppare ceppi di Streptomyces capaci di sfruttare meglio l ossigeno disponibile => espressione dell emoglobina batterica di Vitreoscilla in Streptomyces => aumento di 10 volte della resa di actinorhodina 23

24 Acido 7-amminocefalosporanico (7ACA): Sintetizzato per via chimica dalla cefalosporina C Serve da materia prima per la sintesi CHIMICA delle cefalosporine Costruzione di una nuova via biosintetica di 7ACA nel fungo Acremonium chrysogenum 24

25 Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri Sintesi dell indaco Indaco = pigmento blu di notevole importanza commerciale (utilizzato per tingere capi d abbigliamento) Oggi si sintetizza chimicamente, utilizzando anilina, formaldeide, cianuro. Produzione: 13,000 tonnellate/anno => Interesse nel metterne a punto la sintesi nei batteri 25

26 Studio del plasmide NAH7 di Pseudomonas che permette al batterio di sfruttare il naftalene come unica fonte di carbonio 1) NAH7 digerito con HindIII e clonato in E.coli 2) Selezione dei trasformanti e analisi della idrolisi di naftalene marcato 3) Isolamento dei cloni capaci di trasformare naftalene in acido acetilsalicilico Osservazione: viraggio al blu di terreno contenente triptofano Caratterizzazione della biosintesi dell indaco a partire dal triptofano 26

27 Caratterizzazione della biosintesi dell indaco a partire dal triptofano Plasmide NAH7 Plasmide TOL Test di sitemi/condizioni per coltivare su larga scala ceppi di E. coli capaci di sintetizzare indaco 27

28 Tramite tecniche del DNA ricombinante: Produzione di proteine Produzione di composti a basso peso molecolare Vitamine Aminoacidi Antibiotici Coloranti Biopolimeri BIOPOLIMERI Grandi molecole multiunità sintetizzate da organismi viventi Hanno proprietà chimico-fisiche utili per il trattamento degli alimenti o nell industria farmaceutica 28

29 Manipolazione di Xanthomonas campestris per la produzione di resina xantorrea Stabilizzante Emulsionante Addensante glucosio Unità trisaccaridica X. Campestris cresce in glucosio, saccarosio o amido Obiettivo: coltivare X. Campestris su un mezzo poco costoso (p. es. il SIERO, prodotto di rifiuto dell industria casearia) => Clonaggio di geni che codificano β-galattosidasi e lattosio permeasi (laczy)+ trasferimento in X. Campestris per coniugazione => Crescita su terreno contenente lattosio 0.4% o siero 10% 29

30 Biosintesi della melanina Melanine: biopolimeri fotoassorbenti utilizzati come rivestimenti protettivi o addittivi in cosmetici Attualmente estratte da fonti naturali o sintetizzate chimicamente I geni per la biosintesi della melanina sono stati isolati dal batterio Streptomyces antibioticus 2 geni necessari per la sintesi della melanina in E.coli 30

31 Sintesi di un biopolimero proteico adesivo animale (bisso) in cellule microbiche Impossibile da sequenziare perché dopo essere secreto forma un altissimo numero di legami trasversali precursore di 130 kda: proteina formata da unità ripetitive A-K-P-S- Y(DOPA)-P-P-T-Y(DOPA)-K Problemi nel clonaggio e nell espressione: cdna ripetitivo soggetto a ricombinazione omologa (perdita di porzioni di sequenza clonata) numero troppo elevato di P, K, Y (esaurimento scorte di trna) 31

32 Costruzione di un gene sintetico codificante una proteina di 25 kda Grandezza limitata Codoni ottimizzati per espressione in E.coli In E.coli la modificazione post-traduzionale Tyr DOPA non avviene efficientemente => Ossidrilazione in vitro 32

33 Produzione dei poliidrossialcanoati Biopolimeri utilizzabili per produrre plastica biodegradabile (es: materiale per imballaggi) Poli(acido 3-idrossibutirrico) Caratterizzazione della via biosintetica in Alcaligenes eutrophus e clonaggio in E. coli acetato 33