LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA VALUTAZIONE DI STABILITÀ DEGLI ALBERI

Transcript

1 LA BIOLOGIA MOLECOLARE APPLICATA ALLA VALUTAZIONE DI STABILITÀ DEGLI ALBERI Giovanni Nicolotti e Paolo Gonthier Università degli Studi di Torino Dipartimento di Valorizzazione e Protezione delle Risorse Agroforestali Flormart Padova 16 Febbraio

2 Perenniporia fraxinea Ganoderma resinaceum Inonotus hispidus 2

3 Valutazione della stabilità delle piante in piedi Identificazione precoce dell agente di carie coinvolto Metodi di identificazione Tecniche molecolari Analisi caratteri macro e micromorfologici dei basidiomi (Bernicchia 2005) Non sempre possibile, identificazione tardiva Analisi colture miceliari (Nobles 1965; Stalpers 1978) Isolamento in purezza Variabilità morfo-fisiologica Distinzione taxa vicini Tecniche immunologiche e biochimiche (Jellison and Jasalavich 2000; Clausen 2003) Isolamento in purezza Estrattivi del legno inibitori ELISA 3

4 Valutazione della stabilità delle piante in piedi Identificazione precoce dell agente di carie coinvolto Metodi di identificazione Tecniche molecolari Specificità Sensibilità Semplicità Introduzione Taxon specific priming multiplex-pcr applicata ad estratti di DNA da legno Impiego primer taxon-specifici disegnati su porzioni di rdna per l identificazione di basidiomiceti (Utomo and Niepold 2000; Moreth and Schmidt 2001; Sicoli et al. 2003; Suhara et al. 2005) Estrazione DNA fungino direttamente da legno (Bahnweg et al. 1998) Messa a punto di multiplex-pcr: impiego simultaneamente di più primer in una stessa reazione-presenza di più microrganismi da matrici ambientali (Elnifro 2000; Corbiere Morot- Bizot 2004) 4

5 Taxa selezionati Armillaria spp. (Agaricales, Marasmiaceae) Ganoderma spp. (Polyporales, Ganodermataceae) Hericium spp. (Russulales, Hericiaceae) Inonotus/Phellinus spp. (Hymenochaetales, Hymenochaetaceae) Laetiporus spp.(polyporales, Polyporaceae) Perenniporia fraxinea (Polyporales, Polyporaceae) Pleurotus spp. (Agaricales, Pleurotaceae) Schizophyllum spp. (Agaricales, Schizophyllaceae) Stereum spp. (Russulales, Stereaceae) Trametes spp. (Polyporales, Polyporaceae) 3 gruppi 6 gruppi (Wagner and Fischer 2002) Fasi della messa a punto 4. Primer disegnati per le multiplex-pcr Primer name Nucleotide sequence (5'-3') Tm 1 Location Use in taxon specific PCR Armi2R AAACCCCCATAATCCAATCC 56 C ITS II with the forward ITS3 Gano2R TATAGAGTTTGTGATAAACGCA 55 C ITS I with the forward ITS1f Heri2R CAGCCCTTGTCCGGCAGT 61 C nuc-lsu with the forward 25sF Hyme2R TGCDCCCCCTYGCGGAG 60 C 64 C nuc-lsu with the forward F115 HypoR GCTACGCTTAGGGGATGCTA 60 C ITS II with the forward ITS3 LaetR CCGAGCAAACGAATGCAA 54 C nuc-lsu with the forward 25sF PerR ATCTGCAAAGACCGGTAAGGT 60 C ITS II with the forward ITS3 Pleu2R AACCAGGAAGTACGCCTCAC 60 C nuc-lsu with the forward 25sF Schi2R CTCCAGCAGACCTCCACTTC 63 C ITS II with the forward ITS3 Ste2R GTCGCAACAAGACGCACTAA 58 C ITS II with the forward ITS3 TraR TTCATAGTCTTATGGAAACCGC 58 C mt-ssu with the forward MS1 25sF TGGCGAGAGACCGATAGC 58 C nuc-lsu Forward primer F115 TAAGCGACCCGTCTTGAAAC 58 C nuc-lsu Forward primer PCR product size (bp) Identified taxon 185 Armillaria spp Ganoderma spp. 200 Hericium spp. 111 Inonotus spp.; Phellinus spp. 219 Hypoxylon sp. 146 Laetiporus spp. 152 P. fraxinea. 158 Pleurotus spp. 191 Schizophyllum spp Stereum spp. 220 Trametes spp. 5

6 Fasi della messa a punto 4. Disegno Primer da usare in multiplex-pcr Inonotus spp./phellinus spp. Primer name Nucleotide sequence (5'-3') Tm 1 GC% Location Use in taxon specific PCR PCR product size (bp) Identified taxon FomR CCCAGCCCATGTATACAATAG nuc-lsu with the forward 25sF* 258bp Fomitiporia FuscR CACACTCCGAAGAGTGCC nuc-lsu with the forward 25sF 225bp Fuscoporia IdryaR ACCGACGCATACAACAAAGG nuc-lsu with the forward 25sF 254bp Pseudoinonotus InocuR CCTCAGTCCCCGACGGT nuc-lsu with the forward 25sF 265bp Inocutis InssR GGCGCTACATTCCCTCTG nuc-lsu with the forward 25sF 214bp Inonotus s.s. PhssR GATGTTGACCCGTCCGAC nuc-lsu with the forward 25sF 173bp Phellinus s.s. Ganoderma spp. Primer name Nucleotide sequence (5'-3') Tm 1 GC% Location GaR CAGGCAACAAGTGCGCTC 58 61% ITS1 GlR TTCACGAAGCCCCGCAAG 58 61% ITS1 GrR AAGAGCCCGCTTCACAACG 60 58% ITS1 Use in taxon specific PCR with the forward ITS1f with the forward ITS1f with the forward ITS1f PCR product size 218bp Identified taxa G. australe G.applanatum 202 bp G. lucidum 185 bp G. resinaceum G.pfeifferi Fasi della messa a punto 1. Scelta delle regioni del rdna per disegno dei primer 2. Disegno Primer da usare in multiplex-pcr 3. Valutazione efficienza e specificità Primer in PCR 4. Sensibilità Taxon specific Primer multiplex-pcr Simulazione estrazione di DNA fungino da legno 6

7 Fasi della messa a punto 7. Sensibilità Taxon specific Primer multiplex-pcr M1 M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5QC+ M M2 M 1P 2P 3P 4P 5P 1Q 2Q 3Q 4Q 5Q C+ M 1P= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution of P. hybrida 2P= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution of P. hybrida 3P= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida 4P= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida 5P= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from P. hybrida 1Q= 1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 2Q= 0.1 ng fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 3Q= 10 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 4Q= 1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii 5Q= 0.1 pg fungal DNA in wood DNA extract solution from Q. kellogii C+= 1ng fungal DNA C-= no DNA PCR protocol tested M1 M2 M3 DNA amount Species and related isolate used threshold 1 Q. agrifolia P. hybrida G. resinaceum-fgr1 0.1 pg 0.01 pg P. tuberculosus-fpt1 1pg 1pg I. hispidus-fih2 1pg 1pg H. flagellum pg 0.01 pg P. ostreatus pg 0.1 pg L. sulphureus-fls2 0.1 pg 0.1 pg Armillaria sp.-t4d 1pg 1pg S. hirsutum-dp pg 0.1 pg T. versicolor pg 1 pg S. commune-dp pg 0.1 pg P. fraxinea-fpf5 0.1pg 0.1pg U. deusta pg 0.1pg Hypoxylon sp. specific PCR Hypoxylon sp.-p1 0.1 pg 0.1 pg Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Estrazione DNA M1 7

8 Descrizione del metodo M1 Nuc-rDNA 18 S ITS1 ITS2 5.8 S 25 S Fungi Ganoderma spp. Inonotus/ Phellinus spp. ITS1F Gano2R ITS4 F115 Hyme2R 228bp bp M 1 M bp 1. Trametes versicolor 2. Phellinus punctatus 3. Ganoderma resinaceum L. DNA ladder 100 bp IT S Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Inonotus/ Phellinus spp. Ganoderma spp. 111 bp 228 bp 700 bp Estrazione DNA M1 - Estrazione non efficiente Nessun fungo presente M2 M3 8

9 Descrizione del metodo M2 Nuc-rDNA 5.8 S ITS2 25 S ITS3 Armi2R 25sF LaetR Heri2R 185bp Pleu2R Armillaria spp. Laetiporus spp. 146bp Pleurotus spp. 158bp M 2 M Hericium spp. 200bp Armillaria mellea 2. Laetiporus sulphureus 3. Pleurotus ostreatus 4. Hericium flagellum L. DNA ladder 100 bp Descrizione del metodo M3 Nuc-rDNA 5.8 S ITS2 25 S M3 ITS3 PereR Ste2R M Schi2R P. fraxinea 152bp Schizophyllum spp. 190bp Stereum spp. 240bp Mt-rDNA ssu MS1 TraR 1. S. hirsutum 100 Trametes spp. 220bp 2. T. versicolor 3. S. commune 4. P. fraxinea 9

10 Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Mhyme Inonotus/ Phellinus spp. 111 bp Mgano Estrazione DNA Ganoderma spp. 228 bp 700 bp M1 - Estrazione non efficiente Nessun fungo presente M2 Armillaria spp. Hericium spp. Laetiporus spp. Pleurotus spp. - M3 Altro fungo Schizophyllum spp. Stereum spp. Trametes spp. P. fraxinea Descrizione del metodo Multi-Hyme Nuc-rDNA ITS2 25 S 25sF PhssR FuscR FomiR InssR IdryaR InocuR Phellinus s.s. Inonotus s.s. Fuscoporia 173bp 212bp 223bp (P.tubercolosus, P.igniarius, P.tremulae) (I.andersonii, I.hispidus, I.cuticularis) (P.gilvus, P.torulosus) I. dryadeus 254bp Fomitiporia Inocutis 258bp 265bp (P.robustus, P.punctatus) (I.dryophilus, I.tamaricis) 10

11 Descrizione del metodo Multi-Hyme: Genescan analysis P.tubercolosus I.hispidus P.torulosus I.dryadeus P.punctatus I.dryophilus Descrizione del metodo Multi-Gano Nuc-rDNA 18 S ITS1 5.8 S ITS1f G. resinaceum-g. 185bp pfeifferi G. lucidum 202bp G. applanatum- G. australe 218bp GrR GlR GaR Multi-gano M M G. australe 2. G. applanatum 3. G. resinaceum 4. G. pfeifferi 5. G. lucidum 6. G. lucidum M 100 bp

12 Fomitiporia Fuscoporia Inonotus dryadeus Inocutis Inonotus s.s. Phellinus s.s. G. resinaceum- G. pfeifferi G. lucidum G. applanatum- G. australe Descrizione del metodo Prelievo Carota o tassello di legno Mhyme Mgano Inonotus/ Phellinus spp. Ganoderma spp. 111 bp 228 bp 700 bp Estrazione DNA M1 - Estrazione non efficiente Nessun fungo presente M2 Armillaria spp. Hericium spp. Laetiporus spp. Pleurotus spp. - M3 Altro fungo Schizophyllum spp. Stereum spp. Trametes spp. P. fraxinea Validazione 118 campioni di legno (tasselli o carote prelevate mediante trivella di Pressler) da piante affette da carie e con carpofori Risultati attesi da analisi visiva dei corpi fruttiferi ritrovati Risultati ottenuti da protocollo messo a punto Confronto tra i risultati attesi e i risultati ottenuti mediante protocollo molecolare 12

13 Validazione Efficienza metodo nell individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno 8% 4% 88% individuazione fungo agente di carie no funghi individuati fungo contaminante o saprofita Validazione Efficienza metodo nell individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno Specificità del metodo amplifcazione aspecifica no amplificazioni aspecifiche 13

14 Validazione Efficienza metodo nell individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno Specificità del metodo Individuazione simultanea di più taxa Validazione Efficienza metodo nell individuazione del fungo agente di carie direttamente da legno Specificità del metodo Individuazione simultanea di più taxa Specificità: Multi-Hyme (49/49 49) Multi-Gano (15/15 15) 14

15 Applicazioni e prospettive metodo complementare per affinare VTA Analisi da carote di legno estratte con trivella di Pressler Presenza agente fungino anche ad uno stadio precoce di colonizzazione Previsione dell evoluzione del processo cariogeno all interno della pianta metodo di controllo fitosanitario Standardizzazione metodo di campionamento Più approfondita conoscenza relazioni specie fungina/specie ospite metodo per studi ricerca di base e applicata Esempio applicativo Armillaria Controlli negativi Controllo positivo di Armillaria 15

16 Esempio applicativo E A B F C D Pianta (schiantata) con presenza di Armillaria Pianta con presenza di Ganoderma Pianta con presenza di Perenniporia Pianta sana Pianta non esaminata Pianta non esaminata sostituzione (giovane esemplare) INFORMAZIONI Laboratorio di Patologia Forestale c.a. Prof. Giovanni NICOLOTTI Università di Torino DI.VA.P.R.A. Patologia Vegetale Via Leonardo da Vinci GRUGLIASCO (Torino) giovanni.nicolotti@unito.it 16