Corso di formazione sulla sorveglianza delle arbovirosi in Friuli Venezia Giulia

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1 San Giorgio di Nogaro, Corso di formazione sulla sorveglianza delle arbovirosi in Friuli Venezia Giulia Il laboratorio regionale di virologia Prof. Pierlanfranco D AGARO Università di Trieste

2 Infezioni emergenti West Nile Virus Epidemia negli USA dal 1999 Epidemia in Italia dal 2008 TBEV Endemico in Europa Centro Orientale Italia Nord Est dagli anni 80 Chikungunya Endemico in Africa Orientale e Oc. Indiano Epidemia nel 2007 in Italia (Emilia Romagna) Dengue Endemico in paesi equatoriali In Europa?

3 ARthrpode BOrne VIRUS Virus: Artropodi: Flavivirus West Nile Virus TBEV Usutu Dengue Febbre gialla Togavirus Alphavirus (Chikungunya) EEE, WEE, e VEE Bunyavirus CCHF Toscana Virus Sicilia Virus Reovirus Blutongue (vet.) Zanzare Flebotomi Zecche

4 Ciclo di trasmissione degli arbovirus X Vettore B/C Vettore A Serbatoio Serbatoio Vettore A Ciclo selvatico Vettore B Uomo X Vettore B/C Ciclo urbano Spesso l uomo è ospite terminale, non è in grado di trasmettere l infezione

5 Elementi del ciclo Competenza del virus per il vettore: capacità di replicarsi e di concentrarsi nelle ghiandole salivari Virus Vettore Ambiente Ospite Densità di ospite e vettore Suscettibilità dell ospite per il virus: livelli elevati di viremia

6 Variabili che condizionano il ciclo Trasporto di merci e animali Aumento dei viaggi per turismo o lavoro Importazione e adattamento di nuovi artropodi vettori Importazione e adattamento di nuovi agenti patogeni Ampliamento dell areale di distribuzione dei vettori indigeni Allungamento della stagione favorevole alla trasmissione Modificazioni socio-economiche Modificazioni climatiche

7 West Nile Virus Flavivirus Lineage 1 EU, Isr./USA, AUS, Africa Lineage 2 Africa Centr., EU Lineage 3 EU. Centr Lineage 4 - Caucaso Lineage 5 - India.. Culex pipiens

8 West Nile Virus Famiglia: Flaviviridae Genere: Flavivirus, Complesso Antigenico della Encefalite giapponese Il Complesso include: virus Alfuy, Cacipacore, Encefalite giapponese, Koutango, Kunjin, Encefalite della Murray Valley, Encefalite di St. Louis, Rocio, Stratford, Usutu, West Nile, e Yaounde. Flaviviruses: dimensioni simili (4060nm), dotati di mantello, nucleocapside a simmetria icosaedrica, genoma a RNA+ a singola catena di circa 10,00011,000 basi),

9 Patogenesi Incubazione: 2-14 gg (fino a 21gg) Patogenicità 20% forme lievi: febbre, mal di testa, nausea, vomito, linfonodi ingrossati, rash cutanei. Questi sintomi possono durare pochi giorni, 1% forme gravi: febbre alta, forte cefalea, astenia, disorientamento, tremori, disturbi alla vista, torpore, convulsioni, fino alla paralisi e al coma. 1 encefalite letale (10% delle forme neuroinvasive)

10 West Nile Virus Vettori Zanzare del genere Culex Altre zanzare (Aedes, Anopheles, Aedomya, ecc) Zecche (Hyalomma, Dermacentor, Rhipicephalus, ecc) Ospiti Uccelli (Passeriformi) Roditori Rane Pfeffer and Dobler Parasites & Vectors 2010, 3:35

11 Introduzione e adattamento Anno N specie zanzare WNV casi di West Nile disease negli USA ( ), (44%) forme neuroinvasive 771 morti (3.9% sul totale; 9.0 % delle forme neuroinvasive chilometri K.O. Murray et al. Vet. Res. (2010) 41:67

12 2012 Nel 2012 (novembre) sono stati segnalati negli USA casi, il numero più alto dal 2003; di questi presentavano forme neuroinvasive e 242 sono morti Casi totali Forme NI Letalità

13 Italia 1998 epidemia di WNV in 14 cavalli in Toscana (Padule di Fucecchio), non casi umani 2004 Ordinanza Ministero della Salute, , Piano di sorveglianza nazionale per la encefalomielite di tipo West Nile 15 siti di sorveglianza della West Nile negli animali Padule di Fucecchio Laguna Marano Venezia Laguna Sud Valli di Comacchio Sentina Trasimeno Foce Vomano Lago di Sabaudia Foce Bifemo Manfredonia Stagno di S'Ena Arrubia foce Neto Serre Persano Stagni costieri di Vendicari Lago di S.Giuliano

14 West Nile Iceberg Source: United States Centers for Disease Control and Prevention, US CDC

15 Sorveglianza animale polli cavalli

16 cavalli infetti in otto provincie di tre regioni (Emilia Romagna, Veneto e Lombardia) Nove casi umani, otto con forme neuroinvasive nelle province di RO, FE e BO Prevalenza di WNV (RTPCR) in uccelli: Gazza ladra (Pica pica), 9.1% Cornacchia (Corvus corone), 7.4% Piccione selvatico (Columba livia), 12% Euro Surveill. 2009;14(40):pii=19353.

17 casi di forme neuroinvasive nelle provincie di RO, VE, FE, BO, MO e MN (4 decessi) Sieroprevalenza 1.5% e 3.1% negli agricoltori dell Emilia e del Veneto % nei donatori di sangue (FE) 1.2% nei donatori d organo italiani Donatori organo positivi Euro Surveill. 2009;14(40):pii=19353.

18 Dati del Ministero della Salute

19 Dati EpiCentro ISS

20 WNV endemico? Il ruolo della fauna aviaria stanziale nell endemizzazione non è chiara Per quanto riguarda i vettori: La trasmissione verticale di WNV nelle zanzare è stata dimostrata in laboratorio e sul campo WNV è stato trovato in pools di zanzare Culex pipiens in diapausa invernale a New York nel 2000 ad indicare la capacità del virus di sopravvivere all inverno nei vettori La femmina adulta rappresenta la forma svernante in diverse specie del genere Culex; le femmine che vengono fecondate nel tardo autunno vanno incontro ad un periodo più o meno lungo di diapausa e le uova vengono deposte solo in primavera, quando le condizioni climatiche sono favorevoli.

21 Clinica Sesso Età data residenza WNND M (ML) 45 31/08/201 2 Chions WNND M (VAG) 50 05/09/201 2 Latisana WNND F (CP) 72 06/09/201 2 S.Canzian d.i. Asint. F (CD) 61 07/09/201 2 Muzzana del T. WNND M (DI) 61 08/09/201 2 Morsano al T. WNF M (KF) 61 08/10/201 2 Castions d.s. Asint. M (DFG) 26 10/09/201 2 Mortegliano n Human cases 3

22 Definizione di caso di malattia neuro invasiva da WNV Ministero della Salute, DGPRE, P-14/06/2013

23 Criteri di laboratorio Ministero della Salute, DGPRE, P-14/06/2013

24 Definizione di caso CASO POSSIBILE: non applicabile CASO PROBABILE: qualsiasi persona che soddisfi i criteri clinici e almeno uno dei seguenti due criteri: Correlazione epidemiologica Un risultato a un test di laboratorio per un caso probabile CASO CONFERMATO: qualsiasi persona che soddisfi i criteri clinici e/o il rispetto di almeno 1 dei criteri di laboratorio per caso confermato Ministero della Salute, DGPRE, P-14/06/2013

25 Diagnosi sierologica ELISA Immuno-fluorescenza Neutralizzazione

26 ELISA IgM cattura 1. Pozzetto rivestito con anticorpi di capra anti IgM umane 2. Siero del paziente alla diluizione 1: per 1 ora 3. Antigene ricombinante West Nile Virus per 2 ore HRP HRP 4. Anticorpi monoclonali anti-flavivirus coniugati con HRP per 30 HRP HRP 4. Substrato TMB e H2O per 10

27 Interpretazione dei risultati sierologici Nei test sierologici gli anticorpi per WN virus crossreagiscono con quelli di altri flaviviruses (JE, SLE, YF, Dengue). I test di Neutralizzazione (PRNT) sono più specifici e devono essere utilizzati per confermare una probabile infezione. Le IgM possono persistere per più di sei mesi/un anno; I residenti in aree endemiche possono avere IgM persistenti da una precedente infezione. Poiché le IgM non attraversano la barriera ematoencefalica, la presenza di IgM nel LCR è fortemente suggestiva di interessamento del SNC.

28 Immunofluorescenza Reazioni crociate IgG Febbre gialla (45%) Dengue (75%) TBE (78%) IgM Febbre gialla (0%) Dengue (0%) TBE (14%)

29 Neutralizzazione Il test di Neutralizzazione con riduzione delle placche (PRNT), è il test più specifico per I flavivirus trasmessi da artropodi, e viene utilizzato per confermare le reattività con gli altri test ELISA e IF. Un certo grado di cross reattività si osserva anche con I test di neutralizzazione soprattutto in soggetti che si infettano con un flavivirus non per la prima volta. Variazioni legate allo stock virale e alle cellule utilizzate

30 Test per la dimostrazione di Virus/Antigene West Nile Sangue/liquor umani Pools di zanzare Tessuti animali 1. Metodi molecolari (0.1 pfu) 2. Isolamento del Virus (1 pfu)

31 ELISA P/N IgM #pfu/ml 150 IgG WN viremia illness DAYS POST ONSET 9 10

32 Viremia umana da WN La viremia nell uomo è bassa: Studi su trasfusioni: pfu/ml Viremia media: 24 pfu/ml L isolamento virale è raro (donatori asintomatici IgM neg) La viremia nell uomo è breve Raramente dimostrabile dopo un giorno dalla comparsa dei sintomi 2 TaqMan Positivi/ 100 Acuti IgM positivi Viremia è assente quando le IgM sono dimostrabili 2 IgM & TaqMan positivi in studi su trasfusioni

33 JF707789_Spagna HU6365/08 98 Albero filogenetico di West Nile virus lineage1/2 FJ766331_Spagna GE-1b/B AF404757_Italy_1998-eq JQ928174_Italy/2011/Livenza JX556213_Italy/2012/Livenza/ WNV_FVG_Isonzo_2012 JF719067_Italy/2009/G JF719068_Italy/2009/J HM991274_BAL-09 HM991273_TOS AY052412_Israele-98-GooKY JN858069_Italy/2011/AN JQ928175_Italy/2011/Piave Lineage 1 AF260969_Romania L1 AY278442_LEIV-Vlg DQ118127_goose-Hungary/03 AF481864_Israele-98_STD HQ671710_US/BID-V4902/ AY660002_Mex03 AF202541_HNY1999 AF260967_NY99-eqhs EF657887_3356K_NY99-crow GQ851608_Rep Centrafr B310/67 AF260968_Egitto101m AY603654_EtiopiaAn4766 JN858070_Italy/2011/AN-2 DQ318019_ArD76104_Senegal M12294_FCG_Uganda_1937 Lineage 2

34 Problemi di sicurezza CDC Implementation of Biosafety in Microbiological & Biomedical Laboratories; 4th Ed. West Nile è un virus BSL3 ELISA: Cappa Biosafety Cabinet (BSC) fino al lavaggio del siero, quindi BSL2 PRNT: BSL3 Isolamento virale: BSL3 PCR: BSC fino all aggiunta del lysis buffer, quindi BSL2

35 TBEV Tick Borne Encephalitis Virus Phylum: Virus Gruppo: Arbovirus Famiglia: Flaviviridae Genere: Flavivirus 3 SOTTOTIPI Europeo Asiatico Siberiano

36 Area di distribuzione dei vettori

37 TBE TRASMISSIONE VERTICALE: trans-ovarica TRASMISSIONE TRANS-STADIALE TRASMISSIONE ORIZZONTALE Infezione sistemica Co-feeding Pfeffer and Dobler Parasites & Vectors 2010, 3:35

38 PATOGENESI TBE Andamento bifasico Incubazione 7-14 giorni Forme neurologiche 25% 2/3 guarigione 1/3 sequele Neuropsichiatriche 10-20% Paresi, atrofie 3-11% Mortalità: 1-2% (Europa)

39 TBE in Europa

40 TBE in Italia Cases of TBE meningoencephalitis diagnosed in Italy Firenze Bolzano Trento Belluno no llu Be nto e no Tr a lz e Bo nz re Fi 0

41 Anno Totale n. casi Casi in FVG ASS n. casi % ASS % ASS % ASS % ASS % ASS % ASS % Totale %

42 La TBE nel TRIVENETO Anno primo caso TBE Totale casi TBE Media annua Quinquennio (min.-max) Popolazio ne ASL Tasso medio/ 100 mila quinquennio ULSS 1 Belluno (4-13) ASS 3 Alto Fr (2-5) ASS 6 Pordenone (0-4) APSS Trento (2-10) AS Bolzano (0-2) Siti Triveneta

43 TBEV nelle zecche in FVG ( ) Austria 2005/06: zecche, prevalenza 0.27% : zecche, prevalenza 0.28% Siti campionati Siti positivi Slovenia : zecche, prevalenza 0.36% 5 9

44 FVG.Forni di Sotto/ tpbm 2005 FVG.Roveredo/ tpvb Austria/U27495/Neudoerfl FVG.Raccolana/tp400/2007 FVG.Roveredo/tpACP 2006 FVG.Raccolana/tpAGM 2006 Lithuania/DQ112086/LithT413 FVG.Raccolana/tp299/2011 Finland/AJ298322/Gaeta Finland/AJ298321/ Kumlinge Lithuania/DQ112090/LithT250 FVG/H/ZT1941 (2013) Austria/U27491 Czech/Rep./DQ Austria/U39292/Hypr FVG.Bordano/tp364/2011 FVG.Pontebba/tp73/2007 FVG.Pontebba/tp99/2007 Slovenia/JQ654701/Ljubljana Finland/AJ298323/Isosaari FVG.Raccolana/tpML 2006 FVG/H/ZB1951 (2012) FVG/H/IB1946 (2012) 100 FVG.Raccolana/tp302/2011 FVG.Raccolana/tp165/2011 FVG.Raccolana/tp293/2011 FVG.Raccolana/tp296/2011 Svezia/AY601108/Toro FVG/H/PG1951 (2004) FVG.Roveredo/tp289/2007 FVG.Roveredo/tp291/2007 FVG.Roveredo/tp287/2007 China/AY182009/Senzhang China/AY217093/MDJ/01 79 Russia/DQ862460/Glybinnoe Japan/AB Japan/AB062064/Sofjin/HO Russia/DQ486861/EK/328 Finland/DQ451299/Kokkola/9 93 Finland/DQ451297/Kokkola/4 Finland/DQ451307/Kokkola/86 Finland/DQ451305/ Kokkola/84 Russia/AF527415/Zausaev AY323489/Omsk/hemorrhagic/fever TBE Asiatico Siberiano 0.02 Europeo Ceppi diversi circolano nelle zecche in FVG I genotipi isolati da pazienti sono simili a quelli presenti nelle zecche

45 Diagnosi Sierologia ELISA IgM, IgG Avidità Neutralizzazione Isolamento virale Diagnosi molecolare Real time PCR

46 TBE in immunodepressi Paziente maschio di 72 anni con linfoma B Positivo in real time PCR per le regioni 3 ncr ed env in campioni di Liquor del Sangue EDTA dal Urine dal Infezione contratta nel Carso triestino

47 Aedes albopictus Aedes aegypti Chikungunya

48 Casi importati Dati del Ministero della Salute

49 Laboratorio Diagnosi sierologica (ELISA / IF) Conferma con neutralizzazione (PRNT) Diagnosi molecolare: real time PCR (protocollo BNI) Isolamento virale (Vero E6, C6/36) Sequenziamento gene E

50 Aedes aegypti Dengue Aedes albopictus

51 Dengue Flavivirus Serbatoio dell infezione è l uomo La trasmissione verticale non è comune nel vettore. Il ciclo viene mantenuto quando un vettore competente prende un pasto ematico da un caso viremico e inietta il virus in un paziente suscettibile. Il tempo di riproduzione è di circa 10 giorni. Aedes aegypti vive in ambienti urbani ed è il più efficace vettore di Dengue.

52 Il vettore L aumento dei trasporti di beni e persone favorisce sia la rapida espansione di Aedes aegypti sia l introduzione di soggetti infetti con il virus. Aedes aegypti non è presente nei paesi dell Unione Europea continentale ma le condizioni climatiche dell Europa meridionale sono favorevoli per l insediamento di femmine o larve eventualmente importate. Aedes albopictus è un vettore meno efficace ma endemico Sud Europa.

53 Aree a rischio di trasmissione di Dengue

54 Probabilità di un epidemia di Dengue in Italia Aedes albopictus presenta una più elevata suscettibilità all infezione con DENV a livello intestinale rispetto a Ae. aegypti La disseminazione del virus dall intestino agli altri tessuti (incluse le ghiandole salivari) è significativamente più bassa in Ae. albopictus rispetto a Ae. aegypti

55 Ma Eurosurveillance, Volume 15, Issue 39, 30 September 2010 Rapid communications First two autochthonous dengue virus infections in metropolitan France, September 2010 G La Ruche ( )1, Y Souarès1, A Armengaud2, F Peloux-Petiot3, P Delaunay4, P Desprès5, A Lenglet6, F Jourdain7, I Leparc-Goffart8, F Charlet3, L Ollier4, K Mantey6, T Mollet6, J P Fournier4, R Torrents2, K Leitmeyer6, P Hilairet4, H Zeller6, W Van Bortel6, D DejourSalamanca1, M Grandadam5, M Gastellu-Etchegorry1 Eurosurveillance, Volume 16, Issue 9, 03 March 2011 Rapid communications Autochthonous dengue fever in Croatia, August September 2010 I Gjenero-Margan ( )1, B Aleraj1, D Krajcar2, V Lesnikar2, A Klobučar2, I Pem-Novosel1, S Kurečić-Filipović1, S Komparak3, R Martić3, S Đuričić4, L Betica-Radić4, J Okmadžić5, T Vilibić-Čavlek1, A Babić-Erceg1, B Turković1, T Avšić-Županc6, I Radić1, M Ljubić7, K Šarac1, N Benić2, G Mlinarić-Galinović1

56 Dengue diagnosi La diagnosi di laboratorio per l infezione da Dengue si basa sulla: Dimostrazione del virus dei suoi acidi nucleici e/o antigeni: Il virus può essere dimostrato nei primi giorni di malattia nel sangue o altri tessuti per 4-5 giorni. In questa fase l isolamento virale o le tecniche di amplificazione molecolare possono essere utilizzate per la diagnosi di infezione. Dimostrazione di anticorpi specifici: La sierologia è il metodo di scelta nella fase post acuta.

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58 Infezione primaria & secondaria La risposta anticorpale è diversa in funzione di precedenti infezioni con un Flavivirus. quando l infezione con il virus Dengue si verifica in un soggetto precedentemente non infettato o immunizzato con un flavivirus (e.g. JE, TBE), il paziente sviluppa una risposta primaria caratterizzata da una lenta crescita degli anticorpi,inizialmente di tipo IgM (dimostrabili nel 99% a 10 giorni dall esordio). Le IgM raggiungono il picco dopo due settimane e quindi calano per scomparire dopo 2 3 mesi. Le IgG sono dimostrabili a bassi titoli alla fine della prima settimana di malattia, crescono lentamente e persistono quindi probabilmente per tutta la vita. Nella infezione secondaria (infezione da Dengue in un paziente precedentemente infettato con un altro sierotipo di Dengue o un altro flavivirus), gli anticorpi, soprattutto IgG, crescono rapidamente e sono dimostrabili anche nella fase acuta ad alti livelli; le IgM sono a bassi titoli. Per distinguere l infezione primaria da quella secondaria si può utilizzare il rapporto IgM/IgG che è maggiore di 1.2 (alla diluizione del siero 1/100) o 1.4 (alla diluizione 1/20) nell infezione primaria.

59 Isolamento virale I campioni devono essere raccolti precocemente, nella fase viremica, entro 5 giorni dalla comparsa della sintomatologia. Il Virus può essere isolato da siero, plasma, linfomonociti. Il virus Dengue è termolabile e i campioni possono essere conservati a +4 C / +8 C fino a 24/48 ore. Per conservazioni più lunghe devono essere congelati a -70 C o in azoto liquido. La conservazione a 20 C anche per brevi periodi non è raccomandata. Le linee cellulari di scelta per l isolamento del virus sono le cellule C6/36 (da Ae. albopictus) o AP61 (da Ae. pseudoscutellaris) Poiché non tutti I ceppi selvaggi di Dengue sono citopatici le colture devono essere screenate mediante immunofluorescenza indiretta per verificare la crescita del virus. L isolamento virale richiede un tempo di 1 2 settimane.

60 RT PCR Real time RT PCR NASBA

61 Tecniche molecolari CASO A Mal.Inf. Udine Maschio 62 anni Proveniente Martinica 18/8 IgM 1: 160 IgG 1: 80 real time PCR: POS 8/9 IgM 1: 80 IgG >1: 200 CASO B Mal.Inf. Trieste Maschio 35 anni Proveniente Tailandia 23/12 IgM 1: 160 IgG 1: 128 real time PCR: POS

62 Conclusioni Per fare diagnosi di arbovirosi Raccogliere i campioni il prima possibile (aumenta la possibilità di positività alla ricerca diretta del virus) Raccogliere più tipi di campioni Liquor (quando indicato) Sangue EDTA Urine Sangue intero (per sierologia) Inviare subito i campioni refrigerati (NON congelati) al laboratorio di riferimento regionale (LRR); i campioni possono essere conservati a +4 C per 24/48 ore. Contattare il LRR per qualsiasi dubbio.

63 FINE! Grazie per l attenzione e la pazienza