Viene ricercata la traccia specifica lasciata dal virus sul sistema immune. Diagnosi sierologica

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1 La diagnosi virologica indiretta: diagnosi sierologica - i metodi indiretti Viene ricercata la traccia specifica lasciata dal virus sul sistema immune Diagnosi sierologica Si basa sull utilizzo di tecniche sierologiche che sfruttano la specificità del legame tra un antigene e l anticorpo prodotto nei suoi confronti. La diagnosi sierologica viene preferita alla ricerca diretta del virus ü nelle infezioni virali scarsamente viremiche o in cui è documentata una scarsa produzione di virus; ü nei casi in cui anticorpi di classe IgM sono presenti all esordio dei sintomi; ü nei casi in cui la presenza delle IgG indica l infezione con un virus persistente 1

2 Alcune definizioni Titolazione: valutazione quantitativa degli anticorpi nel siero del paziente (IgG, IgM, IgA) Sieroconversione, aumento titolo anticorpale tra fase acuta e fase convalescente dell infezione Infezione primaria: prima volta che un individuo viene infettato da un agente patogeno Reinfezione: alcuni agenti patogeni possono reinfettare lo stesso individuo (gli Ab già in circolazione NON sono protettivi) Titolo Abs Tipico profilo sierologico in risposta all infezione virale SINTOMI Risposta primaria Lenta comparsa Basso titolo Breve durata IgM IgG (Linfociti B memoria) Il cambio di classe è determinato dalla cooperazione con cellule TH di vario tipo che rilasciano citochine che inducono il riarrangiamento secondario. Le IgM sono le prime a comparire, poi compaiono le IgG TEMPO Se siamo ri-esposti allo stesso antigene VACCINO RICHIAMO Risposta secondaria Rapida comparsa Alto titolo Persistente Criteri per la diagnosi sierologica di infezione primaria Ø Presenza di IgM Ø Sieroconversione o aumento del titolo anticorpale delle IgG e/o IgTot di almeno 4 volte tra il siero della fase acuta e quello convalescente Attenzione! 1) La singola determinazione di IgG se positiva è solo indicativa di pregressa infezione. se negativa non significa necessariamente assenza d infezione (fase acuta) 2) La positività per IgM non sempre indica infezione recente o in atto (riattivazioni, alcune infezioni croniche) Durante la reinfezione/riattivazione le IgM possono essere assenti o presenti a basso titolo 2

3 Criteri per la diagnosi sierologica di infezione pregressa Criteri per la diagnosi sierologica di reinfezione/riattivazione Ø Presenza di anticorpi (sufficiente un singolo siero, memoria immunologica) Ø Per i virus persistenti la presenza di anticorpi significa infezione acquisita in epoca non precisabile e presenza del virus (es. HSV, CMV, HIV) Ø Per i virus non persistenti la presenza di anticorpi significa infezione acquisita in epoca non precisabile Ø Deve pre-esistere la dimostrazione di una precedente sieropositività Ø Può essere rilevato un aumento del titolo anticorpale Ø Può essere rilevata la presenza di IgM Ø La diagnosi sierologica di reinfezione o riattivazione è sempre difficile da conseguire Reazioni sierologiche nella diagnosi virologica ü Saggi immunoenzimatici (ELISA o EIA) ü Saggi di immunofluorescenza (FIA) ü Saggi di emoagglutinazione ü Saggi di fissazione del complemento ü Saggi di neutralizzazione dell infettività ü Applicabili in due direzioni Cerco l anticorpo (serve l antigene di riferimento) Cerco l antigene (serve l anticorpo di riferimento) Formato dei saggi immunoenzimatici Saggio indiretto (ricerca IgG e/o IgM) Saggio competitivo (ricerca IgG) Saggio a cattura (ricerca IgM) Saggio combinato (ricerca Abs + Ags) 3

4 Determinazione di anticorpi con EIA di tipo indiretto ELISA indiretta s s Ab coniugato anti Ig umane anti IgG o anti IgM positivo siero Igtot Antigene Test molto sensibile, può essere quantitativo, Determinazione di anticorpi con EIA di tipo competitivo s s Ab coniugato anti IgG di topo ELISA competitiva MoAb di topo anti Ag siero positivo Antigene Test molto specifico, può essere meno sensibile 4

5 Determinazione dell anticorpo con EIA di tipo cattura L evoluzione dei saggi immunoenzimatici nella diagnosi d infezione da Virus dell Immunodeficienza Umana (HIV) Anti IgM umane Siero Antigene virale Coniugato MoAb anti virus e s Substrato e s Prima generazione (marzo 1985): formato indiretto, lisato virale Seconda generazione (1987): formato indiretto, Ag ricombinanti/peptidi aumento sensibilità e specificità Terza generazione (1994): formato detto sandwich ( Ag-Ab-Ag) Migliore sensibilità in sieroconversione (IgM, IgA, IgG) Quarta generazione (1999): rilevazione simultanea di anticorpi e antigene gag p24, ulteriore riduzione della fase finestra Spesso utilizzato per la conferma di reattività IgM di un saggio indiretto I saggi di 1 a generazione (anti-hiv IgG) I saggi di 2 a generazione (anti-hiv IgG) Indirect anti-human assay format EIA Indirect anti-human assay format EIA Plasma/Serum Sample Plasma/Serum Sample Bead HIV-1 Viral Lysate + Enzyme Conjugate Enzyme conjugated anti-human IgG Bead Substrate Detection of anti-hiv-1 IgG Bead + Recombinant HIV-1 (& HIV-2) proteins/peptides Enzyme Conjugate Enzyme conjugated anti-human IgG Bead Substrate Detection of anti-hiv-1 IgG Improved specificity and sensitivity Antibody detection for newly discovered (1986) HIV-2 5

6 I saggi di 3 a generazione (anti-hiv IgG e IgM) I saggi di 4 a generazione (HIV Ag + Ab Combo) Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA Direct (sandwich) assay format EIA or CMIA Plasma/Serum Sample Plasma/Serum Sample Microparticle Recombinant HIV-1 (& HIV-2) proteins/peptides + Enzyme Conjugate Enzyme or acridinium conjugated to recombinant HIV-1/2 proteins/peptides Microparticle Substrate or H 2 O 2 Detection of anti-hiv-1 IgM & IgG Microparticle + Recombinant HIV-1/2 proteins/peptides & anti-p24 antibodies p24 Enzyme Conjugate Enzyme or acridinium conjugated to recombinant HIV-1/2 proteins/peptides & anti-p24 antibodies Microparticle Substrate or H 2 O 2 Detection of anti-hiv-1 IgM & IgG The covalently bound acridinium ester will produce chemiluminescence in the presence of hydrogen peroxide Detect IgM and IgG antibodies Improved seroconversion sensitivity and specificity Incorporated HIV-1 Group O reagents (mid-90 s) Detect IgM and IgG antibodies Detect HIV-1/2/O antigens Improved seroconversion sensitivity over antibody assays Diagnosi d infezione acuta Ramp-up viremia DT = 21.5 hrs Peak viremia: geq/ml HIV combo Western Blot per la ricerca di anticorpi Ø Gli antigeni virali sono separati in base al peso molecolare mediante elettroforesi e adsorbiti su una membrana Ø Il contatto fra membrana e siero del paziente immobilizza gli anticorpi contro gli specifici antigeni nella loro localizzazione Ø E un test più specifico rispetto al test EIA indiretto eseguito su piastra (preparato antigenico totale) Fiebig et al. AIDS 2003 test di screening basato sull'antigene permette la diagnosi precoce con un ritardo rispetto alla viremia di 4-7 giorni. 6

7 Western Blot Conferma della sieropositività per HIV-1 Determinazione di anticorpi mediante immunofluorescenza indiretta p17 + 1: Controllo Positivo 2: Controllo Negativo Campione A: Negativo Campione B: Indeterminato Campione C: Positivo (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) Cellule infettate con HSV sono fissate sul vetrino e cimentate con diluizioni scalari di siero in esame. Dopo incubazione e lavaggio con tampone viene aggiunto un anticorpo anti IgG o anti IgM umane coniugato con fluoresceina Individuazione anticorpi mediante inibizione dell emoagglutinazione (emoagglutinoinibizione, HAI) Titolazione dell Ag Titolazione dell Ab Reazione di emoagglutinazione 1:1024 1:8 1:4096 <1:8 1:512 pos pos neg neg Emoagglutinazione Inibizione della Emoagglutinazione Diluizione di Ag o siero 1: Alcuni virus (es. Influenza, Morbillo, Rosolia) hanno proteine di superficie che si legano alla membrana dei globuli rossi di varie specie. La presenza di anticorpi sierici nei confronti di questi virus può essere messa in evidenza mediante inibizione dell agglutinazione dei globuli rossi da parte del virus. Reazioni positive L ultima diluizione dell antigene capace di agglutinare le emazie L ultima diluizione del siero capace di inibire l agglutinazione delle emazie da parte dell antigene specifico aggiunto in quantità standardizzata. 7

8 Individuazione anticorpi mediante fissazione del complemento (FC) Il Complemento si fissa al complesso antigene-anticorpo e se questo è sulla membrana della cellula innesca una reazione a cascata che lisa la cellula stessa Individuazione anticorpi mediante fissazione del complemento (FC) Siero del paziente senza anticorpi antivirus Anticorpi anti-globuli rossi Globuli rossi complemento incubazione lisi non lisi Il test valuta la presenza di anticorpi nel siero del paziente in base alla sottrazione del complemento in conseguenza della formazione dell immunocomplesso (anticorpi del paziente e antigene di riferimento). Il complemento non sottratto (reazione negativa) lisa i globuli rossi del sistema di rivelazione composto da globuli rossi e anticorpi anti-globuli rossi. Antigeni virali Siero del paziente con anticorpi antivirus Fissazione del complemento Neutralizzazione dell infettività Siero acuto Convalescente Il salto di almeno 4 volte del titolo anticorpale permette di fare diagnosi d infezione RNA Diluizione del siero 1:8 1:16 1:32 1:64 Reazioni positive Il complemento fissato dal legame tra l Ag e gli Ab del siero non è disponibile per lisare gli eritrociti di montone sensibilizzati con anticorpi anti-emazie (emolisina di cavia) (sistema di rivelazione) Titolazione anticorpi neutralizzanti non più usata a fini diagnostici Gli anticorpi neutralizzanti esprimono la capacità di bloccare l infezione in vivo Usata per valutare l efficacia della vaccinazione in alcuni casi (es. anti-polio in bambini da adozione internazionale) 8

9 Utilità dei test sierologici Dipende in gran parte dai virus indagati Virus della rosolia, dell epatite A, della parotite ecc. : i sintomi della fase acuta coincidono con lo sviluppo degli anticorpi; la determinazione di IgM è utile (tipico delle infezioni sistemiche) Virus respiratori, virus delle gastroenteriti : i sintomi precedono la comparsa di anticorpi; la diagnosi sierologica è solo retrospettiva si basa sull aumento di titolo delle IgG è poco utile. (tipico delle infezioni localizzate e/o mucosali) Virus latenti, virus erpetici : in caso di riattivazione, gli anticorpi sono già presenti nel siero e le IgM possono essere nuovamente prodotte; la sierologia non è utile a meno di non essere sicuri che i sintomi sono relativi all infezione primaria. (tipico di infezioni latenti) HIV, HCV, virus della rabbia : la malattia si sviluppa mesi o anni dopo la sieroconversione; la presenza di IgG è sufficiente per fare una diagnosi d infezione. (tipico di infezioni persistenti) Problemi con la sierologia False positività : per IgM: in soggetti con altre infezioni virali (CMV, EBV) per IgM: a causa di reazioni aspecifiche (malattia reumatica, SLE, sindromi autoimmuni) per IgG: trasferimento passivo di anticorpi (trasfusioni, sieri iperimmuni, nel neonato) False negatività : per IgM: eccesso di IgG utilizzando saggi indiretti per IgG: risposta immune umorale ridotta (immunodepresso, emodializzati) per IgG: risposta immune umorale assente o debole (inf. genitali HPV) per IgG: periodo finestra prima della sieroconversione Tempi di risposta eccessivi (siero acuto e convalescente). Interferenza di fattore reumatoide in EIA indiretta per IgM Interferenza di IgG ad alto titolo in EIA indiretta per IgM 9

10 Le positività per IgM: Quindi La reattività per il fattore reumatoide dovrebbe essere considerata le IgM dovrebbero sempre essere confermate con test alternativi rispetto a quelli utilizzati in prima battuta: ad esempio se il primo test è un ELISA indiretto (sensibile ma poco specifico) la positività andrebbe confermata con un test ELISA cattura (meno sensibile ma molto specifico) o con un saggio in immunofluorescenza indiretta dopo aver accertato l assenza di fattore reumatoide Le negatività per IgG: Dovrebbero essere considerate possibili in soggetti immunodepressi per i quali in molte occasioni risulta opportuna la ricerca diretta (mediante utilizzo delle tecniche molecolari) del genoma nonostante la negatività degli anticorpi ad esempio nell infezione da HCV in trapiantati di midollo o in emodializzati Approfondimenti sierologici Nel corso della risposta immune esiste la possibilità di contemporanea presenza di IgG ed IgM in assenza di sintomi. Tale situazione può essere in relazione con una infezione primaria asintomatica, una reinfezione o una riattivazione. Quando tale situazione riguarda agenti teratogeni in una donna nelle prime settimane di gravidanza, è importante effettuare un approfondimento diagnostico che ci permetta di datare l infezione Si utilizza un saggio sierologico in grado di valutare l avidità degli anticorpi di classe IgG Il concetto di Avidità L avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene riflette la capacità dell anticorpo stesso di formare con l antigene legami stabili per aumento di affinità È una qualità che aumenta nel tempo essendo l espressione della maturazione della risposta immune L affinità fra Ag e Ab è una risultante di forze di attrazione e repulsione L avidità delle IgG è quindi bassa nell infezione primaria e aumenta (maturazione) in seguito Individuazione IgG a bassa affinità è indicazione di infezione primaria Test di avidità degli anticorpi Il saggio sfrutta il naturale processo di maturazione delle IgG che diventano con il tempo più affini per l antigene che le ha evocate. Il che si traduce in un aumento della forza del legame tra queste IgG e l antigene, un legame difficile da scindere con un tampone di dissociazione a base di urea o guanidinio 1M Il saggio fornisce importanti informazioni circa il tempo passato dall infezione primaria Anticorpi a bassa avidità sono indicativi di infezione recente, anticorpi ad alta avidità indicano infezione contratta almeno 2-4 mesi prima o reinfezione o riattivazione. 10

11 TEST DI AVIDITA EIA DI TIPO INDIRETTO s s s s urea Viene calcolato il rapporto percentuale tra IgG residue dopo trattamento (quelle affini) e IgG totali (es. 1/3 = 33%) siero Maturazione della avidità Ab dopo infezione acuta (indice di avidità) Indice di avidità (%) Mesi dal contagio Segue una evoluzione tipica per ogni singolo agente ricercato Variazioni dell avidità anticorpale e tempo trascorso dall infezione (virus Rosolia) Utilità del test di avidità Indice di avidità (%) indice di avidità <20% indice di avidità >20% Inf. molto recente 4 6 pregressa 18 <2 mesi >2 mesi Mesi dal contagio Permette di calcolare con una certa affidabilità il tempo trascorso dall infezione primaria Utile per datare l infezione da Toxoplasma, Rosolia, CMV nelle gravide 11

12 Polmonite virale Febbre elevata Infiammazione interstiziale del tessuto polmonare presenza di membrana ialina negli spazi polmonari Perdita cellule ciliate delle piccole vie, bronchiolite, flogosi peribronchiale, dispnea, Insufficienza respiratoria, bassa po2 e bassa saturazione di Hb Agente eziologico Flu A RSV, Parainfl 3 Adeno Categorie a rischio Tutti Bambini, anziani Giovani adulti Diagnosi diretta Molecolare (RT-PCR) PCR Campione clinico T. naso-faringeo BAL Asp. bronchiale CMV, HSV Immunodef. PCR BAL NO VZ Morbillo Legionella, Mycoplasma,Chamydia Pneumocystis Giovani adulti Immunodef NO (diagnosi clinica, nel dubbio ) Diagnosi differenziale sangue Diagnosi indiretta NO SI (IgM) Infezioni dei vasi e del cuore L apparato cardiocircolatorio può essere interessato da vari virus ma non è bersaglio specifico per nessun virus Gli stessi meccanismi di patogenicità alla base di esantemi o emorragie gravi sono incerti? Danni indiretti (meccanismo immunomediato) (esantema, e a seconda dello stato immunitario dengue emorragico)? Danni diretti (replicazione nelle cellule endoteliali es.arenav e filov) Le infezioni virali del cuore sono più caratterizzate Malattia Agente eziologico Danno Diagnosi diretta Miocardite Pericardite Cardiop. dilatativa Difetti del setto, pervietà dotto arterioso, stenosi arteria polmonare Coxsackie B(1-6) Coxsackie A (4 e 16) Echovirus (9 e 22) Stessi Enterovirus Rosolia Inversamente proporzionale all età Immunomed. inf. cronica Malformazione congenita Idrope fetale Parvovirus B19 Malformazione congenita Molecolare (RT-PCR) No Molecolare (RT-PCR) Molecolare (PCR) Campione clinico Biopsie cardiache, liquido pericardico Feci Liquido amniotico Urine Liquido amniotico Diagnosi indiretta FC vs Ag di gruppo Coppia di sieri No campione unico Poco efficace Non efficace ELISA (IgM) ELISA (IgM) INF. LOCALIZZATE INF. SISTEMICHE Infezioni della cute e delle mucose Sono conseguenza di infezioni localizzate Si stabiliscono in seguito ad interruzioni di continuità della barriera protettiva (strato corneo, muco) è penetrazione dei virus: virus erpetici HSV1 e 2; papillomavirus (verruche, papillomi, condilomi) Sono conseguenza di infezioni sistemiche essendo le cellule della cute, delle mucose e degli endoteli organo target per virus esantematici o virus che provocano febbri emorragiche Malattia Agente eziologico D. diretta Campione clinico Gengivostomatite Cheratocongiuntivite Recidive labiali Recidive genitali Zoster Condilomi genitali Cancro della cervice Morbillo Rosolia Varicella Quinta malattia Sesta malattia Esantemi enterovirali Erpangina mani piedi bocca Febbri emorragiche HSV1 HSV 2 VZ (riattivazione) Papillomavirus (tipi 6-11) Papillomavirus (tipi altri) Morbillo Rosolia VZ (inf. Primaria) Parvovirus B19 Herpes sesto (HHV-6) Enterovirus Arbovirus (Flaviv_Dengue). Robovirus (Arenavirus Bunyav.) Filovirus 1) Isolamento (no per HPV) 2) D. Molecolare (PCR) Spesso clinica D. Molecolare (RT-PCR ) Necessitano un preciso orientamento diagnostico ed epidemiologico Tampone da lesione Sangue Siero Urine Tampone da Lesione Sangue Siero D. indiretta MAI IgM anti Morbillo IgM anti Rosolia IgM anti VZ IgM anti Parvo B19 IgM anti HHV-6 IgM se disponibili reagenti Infezioni del sistema nervoso centrale In linea di massima rare (barriera emat.encef) ma in genere gravi (il SNC non possiede un sistema immunitario intrinseco) sono complicanze di infezioni sistemiche meningiti tipicamente a liquor limpido (meningite asettica, PBMC/ul) encefaliti generalmente di tipo diffuso a liquor limpido I virus arrivano per via ematica (direttamente o veicolati da leucociti) o per via assonale (a-herpervirus, rabbia) Malattia Agente eziologico D. diretta Campione clinico Meningite Meningoencef. Encefalite Encefalomielite Enterovirus (40%) Parotite (15%) (post-infettiva) V. Coriom.Linfoc (5%) HSV, Morbillo (rare) V. Toscana (estiva) Arbovirus (WNV) HSV-1 Morbillo Arbovirus (Flaviv. e α-togav) Morbillo (genesi autoimmune) VZ (rara) Paralisi Enterovirus (Polio, Coxs B, entero 71) Neuropatia progressiva Morbillo (PESS) JC (LMP) HTLV I (PST) HIV (AIDS demenza complex) 1) Isolamento 2) D. Molecolare (RT-PCR, PCR) Necessita un preciso orientamento diagnostico D. Molecolare (PCR, RT-PCR ) D. Molecolare (PCR) Feci Liquor Urine Liquor Liquor D. Molecolare (RT-PCR) Liquor Feci Clinica Molecolare Liquor Siero Siero Siero Siero D. indiretta IgM anti Parotite IgM anti Morbillo IgM anti Toscana IgM anti WNV NO IgM anti Morbillo Se disponibili reagenti IgM anti Morbillo NO IgG anti HTLV I IgG anti HIV 12

13 Epatiti virali Virus epatitici minori: il coinvolgimento del fegato rappresenta un epifenomeno nel quadro clinico di base picornav, adenov, paramyxov (morbillo e parotite), febbre gialla, CMV e EBV raramente possono produrre un quadro clinico prevalentemente epatitico, si tratta sempre di forme acute Virus epatitici veri e propri Virus Famiglia-Genere Trasm Malattia Diagnosi sierologica (EIA/ELISA per Ag o Ab) HAV (RNA) Picorna/Hepatovirus O/F EA IgM anti HAV Ag NO HBV (DNA) Hepadna/Orthohepad. Par. EA/EC/Epatoc. Ricerca Ag: sag, eag Ricerca Ab: IgG Anti-sAg, IgG Anti-eAg, IgG/IgM anticag HCV (RNA) Flaviv./Hepacivirus Par. EA/EC/Epatoc. Ig-tot Anti-HCV HCV core-ag HDV (RNA; def.) Deltaviridae/Deltavirus Par. EA/EC Ig-tot Anti-HDV, IgM anti- HDV Diagnosi molecolare HBV DNA controllo (attività replicativa, efficacia terapia) HCV RNA diagnosi e controllo terapia HEV (RNA) Hepeviridae/Hepevirus O/F EA IgM anti HEV Ag HEV RNA siero/feci NO Gastroenteriti virali I sintomi delle enteriti virali sono gli stessi (nausea, vomito e febbre) ma possono evolvere in: Diarrea acquosa più o meno protratta e vomito Grave disidratazione e squilibrio elettrolitico Esito fatale (se non si interviene) Sono tipicamente infezioni localizzate non ha senso cercare gli anticorpi Agente eziologico Rotavirus gruppo A gruppo B gruppo C Adenov enterici (40-41) Norovirus Astrovirus CMV Adenovirus altri sierot. Categorie a rischio Lattanti e <2 aa Bambini e adulti Casi sporadici Lattanti G. in comunità Casi sporadici Diagnosi diretta Campione clinico Rapida ICA (molecolare) Feci NO Immunodef. PCR Feci NO Diagnosi indiretta Infezioni del sistema linfoide e emopoietico Molti virus dopo la replicazione al sito di ingresso raggiungono i lifonodi regionali e da lì tramite i vasi linfatici raggiungono il torrente sanguigno che li distribuisce Molti sono in grado di replicare nelle cellule del sangue (linfociti e monociti/macrofagi o cellule del sistema reticolo endoletiale, cellule endoteliali e precursori eritroidi) determinando: Malattia Agente eziologico D. diretta Campione clinico D. indiretta Mononucleosi EBV (CMV) no Aplasia Parvovirus B19 (transitoria o pura) PCR Assetto anticorpale Leucopenia HIV (Morbillo) no SI + conferma WB HIV Linfomi (Burkit L, EBV (trasformazione) PCR Sangue no Hodgkin L, a cellule T ) PTLD (ospite trapiantato) EBV (riattivazione) PCR no Leucemie (ATL) HTLV I no SI IgG IgM Infezioni fetali e perinatali Nella fase viremica la placenta può essere attraversata e può essere sede di replicazione è i virus possono infettare il feto Tessuti fetali vengono infettati con danni sullo sviluppo organogenetico in relazione all epoca gestazionale Le stesse IgG materne (protezione passiva) sono trasmesse con una efficienza che aumenta col progredire della gravidanza Virus Tipi d infezione Diagnosi diretta Campione clinico Rosolia Cytomegalo Parvov B19 Varicella HIV HBV HCV HSV HPV Antenatale Antenatale Antenatale Antenatale (Perinatale) Perinatale (Antenatale) Perinatale (Antenatale) Perinatale (Antenatale) Perinatale Perinatale Test molecolari: Non utili nella madre Necessari nel bambino PCR PCR Sangue Liq. amniotico Urine T. vaginale T. vaginale Diagnosi indiretta SI IgM+: Avidità (madre) SI: IgM+:Avidità (madre) SI IgM SI IgM SI SI SI NO NO 13