PROBLEMI CONNESSI ALL USO DI PESTICIDI IN AGRICOLTURA

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Albino Gasparini
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1 PROBLEMI CONNESSI ALL USO DI PESTICIDI IN AGRICOLTURA COSTI DI PRODUZIONE SVILUPPO DI POPOLAZIONI DI INSETTI RESISTENTI NON SPECIFICITÀ DEGRADO AMBIENTALE DANNI ALLA SALUTE DELL UOMO

2 PROTEASI Enzimi che catalizzano la rottura idrolitica dei legami peptidici. Alcune proteasi rompono solo legami peptidici adiacenti a uno specifico residuo aminoacidico, frammentando quindi il peptide in modo riproducibile e in un numero di peptici che può essere predetto (esempi tripsina, chimotripsina). Tripsins: catalizza l idrolisi di quei legami peptidici il cui gruppo carbonilico è fornito da un residuo di Lys o Arg come residuo carbossi-terminale. Chimotripsina: per la sua azione idrolitica richiede la presenza di una grossa catena alifatica o aromatica sul lato carbonilico del legame peptidico suscettibile. Questa diversa specificità dipendente da piccole differenze nella struttura del sito di legame del substrato. Nella chimotripsina la catena alifatica o aromatica del substrato si adagia in una tasca non polare. Al contrario nella tripsina uno dei residui di questa tasca (serina) è sostituita da un aspartato, che può formare un legame elettrostatico forte con la carica positiva della catena laterale della Lys o Arg.

(esempi tripsina, chimotripsina). Tripsins: catalizza l idrolisi di quei legami peptidici il cui gruppo carbonilico è fornito da un residuo di Lys o Arg come residuo carbossi-terminale.

6 Inibitori di proteasi delle piante Piccole Molecole di 3-23 Kda; Numerosi residui di cisteina; Elevata termostabilità; Presenti in: - organi riproduttivi; - tessuti vegetativi; - organi di riserva (semi, tuberi); Funzione: - utilizzo delle proteine di riserva dei semi; - difesa delle piante nei confronti di insetti fitofagi e microorganismi; Espressi nelle foglie dopo: - abrasione meccanica; - trattamento con ac. Abscissico o metil-jasmonato; Reazione di inibizione: E + I EI E + I K d = [E] [I] 10-9 M [EI]- Figura 3. Caratteristiche principali degli inibitori di proteinasi.

piante nei confronti di insetti fitofagi e microorganismi; Espressi nelle foglie dopo: - abrasione meccanica; - trattamento con ac.

7 FAMIGLIE DI INIBITORI DI PROTEASI DI ORIGINE VEGETALE FAMIGLIA PROTEASI INIBITA Inibitori di proteasi a serina Soybean trypsin inhibitor (kunitz) family Trypsin and Bowman-Birk family chymotrypsin Barley trypsin inhibitor family Potato inhibitor I family Potato inhibitor II family Squash inhibitor family Ragi 1-2/maize trypsin inhibitor family Serpin family Inibitori di proteasi a cisteina (phytocystatins) Inibitori delle metallo-proteasi Inibitori delle aspartico-proteasi Papain, cathepsin B,H,L Carboxypeptidase A, B Cathepsin D Figura 4. Classificazione degli inibitori di proteasi di origine vegetale.

Ragi 1-2/maize trypsin inhibitor family Serpin family Inibitori di proteasi a cisteina (phytocystatins) Inibitori delle metallo-proteasi Inibitori delle

8 Figura 5. Schema di reazione della pianta all attacco di insetti fitofagi

9 Attacco di insetti fitofagi Segnali locali Segnali sistemici Traslocazione attraverso il sistema vascolare Pathway degli acidi octadecanoici Espressione dei geni per Inibitori di proteasi

11 Tabella 1. STRATEGIA DI TRASFERIMENTO GENICO PER L INCREMENTO DELLE DIFESE DI UNA PIANTA (1) Identificazione del meccanismo di difesa (2) Purificazione della proteina (3) Tests biologici mediante l impiego di diete artificiali (4) Tests di tossicità per i mammiferi (5) Clonaggio del gene, costruzione del vettore e trasformazione (6) Verifica dell azione del prodotto di espressione nella pianta transgenica (7) Controllo della salvaguardia ambientale e biologica

difesa (2) Purificazione della proteina (3) Tests biologici mediante l impiego di diete artificiali (4) Tests di

12 Piante transgeniche trasformate con inibitori di proteinasi di origine vegetale Inibitori di proteinasi Insetti bersaglio Piante trasformate Referenze C-II (soybean serine-proteinase inhibitor) Coleotteri, lepidotteri Colza 1, pioppo 2, patata 3, tabacco 3 1) Bonade Bottino M., 1993 CMe (barley trypsin inhibitor) CMTI (squash trypsin inhibitor) Lepidotteri Tabacco 4 Tabacco 5 2) Shuler T.H. et al., ) Marchetti S., ) Carbonero P. et al., 1993 CpTI (cowpea trypsin inhibitor) 14 K-CI (bifunctional cereal inhibitor of serine-proteinases and a-amylases) GTPI (giant taro serine proteinase inhibitor) Coleotteri, lepidotteri Lepidotteri Melo 6, lattuga 7, colza 8, patata 8, riso 8, fragola 6,9, girasole 10, patata dolce 11, tabacco 12,pomodoro 7 Tabacco 13 Tabacco 14 5) MacIntosh S.C. et al., ) James D.J. et al., ) Gatheouse A.M.R., In Press. 8) Burgess E.P.J. et al., ) Graham J. et al., ) USDA/APHIS Database MTI-2 (mustrd-serine proteinase inhibitor) Lepidotteri Arabidopsis 15, tabacco 15, colza 11) Newell C. et al., ) Hilder V.A. et al., 1987 OC-1 (rice cysteine-proteinase inhibitor) PI-IV (soybean serine-proteinase inhbitor) Coleotteri, emipteri Lepidotteri Colza 1, pioppo 16, tabacco 17 Patata 3, tabacco 3 13) Masoud S.A. et al., ) Wu Y.R. et al., ) De Leo F. et al., 1998 PI-I (potato proteinase inhibitor I) PI-II (potato proteinase inhibitor II) Lepidotteri, ortotteri Lepidotteri, ortotteri Petunia 18, tabacco 18 Betulla 7, lattuga 8, riso 19, tabacco 20, 21 16) Leple J.C. et al., ) Masoud S.A. et al., ) Beuning L. et al., 1991 Soybean Kunitz trypsin inhibitor (KTi3, SKTI) SpTi (sweet potato proteinase inhibitor) Lepidotteri Lepidotteri Patata 3, tabacco 3 Tabacco 22 19) Duan X. et al., ) Jongsma M.A. et al., ) Johnson R. et al., 1989 Tomato proteinase inhibitor I Lepidotteri Alfalfa 23, nightshade 23, tabacco20, 23 pomodoro 24 22) Yeh K.W. et al., ) Narvaez-Vasquez J. et al., 1992 Tomato proteinase inhibitor II Lepidotteri tabacco 20, pomodoro 24 24) McGurl B. et al., 1994 Figura 6. Piante trasformate con geni per inibitori di proteinasi.

et al., 1998 3) Marchetti S., 1994 4) Carbonero P. et al.

13 Figura 7. Strategia di amplificazione del gene per l inibitore MTI-2. Il prodotto di amplificazione previsto è di 162 pb (Vedi anche Figura 8). In figura è riportata la sequenza aminoacidica dell inibitore triplico MTI-2 isolato da semi di senape. Sono state sottolineate con due frecce le regioni scelte per la sintesi delle famiglie di oligonucleotidi A ed E. La distanza fra i due oligonucleotidi degeneri sono riportate nella parte inferiore della figura.

In figura è riportata la sequenza aminoacidica dell inibitore triplico MTI-2 isolato da semi di senape.

14 LYS GIU TRY GLY GLY ASP VAL» X X X X X X = = = = = = CYS ASP TRY CYS ASN ASP SER «2 2x 2x X X X X = = = = = =

1024 2 2 2 2 2 2 4 CYS ASP TRY CYS ASN ASP SER «2 2x 2x

19 EcoRI 60 GAATTCGCATAGATCCTCTAGAGTCGACCTCGAGGCATGCAAGCTTGCGGCCGCCCTAGG 120 ACTAGTCTCGAGGCTAGCCCATGGGGACCGGGAACGGATCATGCAGTTATTTTTCTACAT 180 AAGAGCTTCGTAATAAGTAAAAACAAGCTGTCTGATCCTGGTTAGGGGGTAGAAAGTAAA 240 GTTTGCACCTGGTGGAGTAGTTCCTGGTTCGATTCTTGATTTAACTCGGGTTTGTTCAAT 300 TCGGTTTCCATCTTTAGCATGTATTGGGCTTTTAAATTAATACTGGGCTGGGCCTAGAGT 360 AATAATTTATTTTAAGAAAACCTTTCATATTACAAACAAATCAATTTTATCTCGTTTTTC 420 AGGCATATGAAAAACTCAAAAAGTAGTTAAAACTCGATATATATATATATACATGTATTT 480 ATATATATATTTAAAACAGATGGCAGCTAAATAACTTTAATGATTATTTTTTTCTCCAAC 540 GACAAAGATAAATGGCACACCCGGGTTCATTTTACGTATACGTTAACTCCAAAGTTCAGA 589 CACATAGAGAGAGAGAGAGAAG ATG GCC ATG GCA AAA AAA TCA GTT TCT M A M A K K S V S 635 TCG TTC ACC CTC ATT TTC ATC CTC GTT TTG GTT ATT TTT G gtaaag S F T L I F I L V L V I F 695 taactaactctttattttatttattttttggtaaaaactaactccgtatttttttcacat 755 atttgttaatatttgtgtggttcatagtaggattcttctctccgtgactgcattgtagca 815 cgttttgtcatatactatatgatatctgttttctctaatactctctatgtatatgtatat * 860 tgagcag AA GTG CCG GAG ATA AAA GCG CAG E V P E I K A Q GAT AGC GAG TGC CTG D S E C L 905 AAA GAA TAC GGT GGT GAT GTT GGC TTC CCT TTC TGC GCA CCT CGG K E Y G G D V G F P F C A P R 950 ATA TTT CCG ACG ATT TGC TAC ACA AGA TGC CGT GAG AAC AAG GGG I F P T I C Y T R C R E N K G 995 GCT AAA GGT GGA AGA TGC ATT TGG GGA GAA GGA ACT AAC GTT AAG A K G G R C I W G E G T N V K * 1040 TGC TTA TGC GAC TAC TGC AAC GAC AGC CCT TTT GAT CAG ATT CTA C L C D Y C N D S P F D Q I L 1094 AGA GGT GGC ATT TGA GTTCCTGCATGTGCCTTGGTTTGTGTAATAATAAATGTT R G G I Stop 1154 AAAATGGTCCAAGTAATAATGTAATAACGAGTATGTGAAATAAAAAAAAGCTCGGAAGTA 1214 TCTGAGCCTCACATGGTTTGATAATAGATGTGGTTATTGTGGTCGTGAGTCAAAGAGAGT 1274 AGTTATTAACTTTCATACTTCCCAACTTGCTAGAAGCCAAAAGATTCGTCCTAGCCCAAA 1334 GAAAAAAATAATATCTACACTTGTTTTAAAATCTTTTATGTTAAAAAGTAACTCGAATTC EcoRI Figura 9. Organizzazione del gene mti-2 identificato su un frammento EcoRI del DNA di senape. La sequenza codificante il precursore è in azzurro. La regione intronica del gene è indicata da lettere minuscole. I codoni corrispondenti al primo e ultimo aminoacido della proteina matura sono indicati da un asterisco. Le putative sequenze consenso per la RNA polimerasi II sono sottolineate; la sequenza ACGT e i segnali di poliadenilazione sono sovralineati.

AGGCATATGAAAAACTCAAAAAGTAGTTAAAACTCGATATATATATATATACATGTATTT 480 ATATATATATTTAAAACAGATGGCAGCTAAATAACTTTAATGATTATTTTTTTCTCCAAC 540 GACAAAGATAAATGGCACACCCGGGTTCATTTTACGTATACGTTAACTCCAAAGTTCAGA 589

35 Activity of selected inhibitors Trypsin (nm) chymotrypsin (nm) ntmti /- 0.CO2 >1000 Try /- 0.CO2 >1000 PLI 34 +/ /- 10 Cny4 18 +/- 5 >1000 nm Cny / /- 3

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