Natalina Antonella Marchi

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1 ANALISI CITOFLUORIMETRICA DEL DNA E IMMUNOMARCATORI NEL CARCINOMA A CELLULE TRANSIZIONALI DELLA VESCICA Natalina Antonella Marchi TSLB Anatomia Patologica ULSS 17 Monselice-Este

2 Il carcinoma della vescica rappresenta il 70% delle forme maligne dell apparato urinario. La sua incidenza aumenta con l età, passando: -dal 25% per la fascia di età compresa tra i 59 e i 69 anni -al 93% per quella compresa tra i 75 e i 79 anni. Tale patologia colpisce maggiormente i maschi rispetto alle femmine con un rapporto di 3:1.

3 La maggioranza dei carcinomi vescicali, il 97%, è rappresentata dal carcinoma a cellule di transizione mentre, l adenocarcinoma ha una frequenza del 2% e, nell 1% dei casi, si riscontra il carcinoma a cellule squamose. Il TCC origina di solito nella zona tra la base della vescica e il trigono e sulle pareti laterali. Le cellule appaiono giganti con nuclei ammassati ed un rapporto nucleo citoplasma aumentato; la maturazione cellulare risulta incompleta e le mitosi sono frequenti.

4 Il sistema di stadiazione che viene impiegato è la classificazione TNM. Tale classificazione permette di valutare le neoplasie vescicali in base all estensione locale ( T ), all interessamento dei linfonodi regionali al di sotto della biforcazione delle arterie iliache comuni ( N ), alla presenza o meno di metastasi a distanza ( M ).

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6 Il grado di malignità istologica viene rappresentato dal grading (basso grado e alto grado), andando da un grado più basso di anaplasia compatibile con la malignità, ad un grado di malignità più elevato. Con questo parametro si intende indicare la modulazione della differenziazione cellulare e la frequenza di anormalità nella morfologia delle cellule. Altro parametro di valutazione importante ai fini della diagnosi e della prognosi di malattia è l angioinvasività.

7 L angiogenesi è un processo biologico mediante il quale nuovi capillari sono formati da vasi pre-esistenti. L angiogenesi si attraverso 5 fasi. 1) Aumento della permeabilità del vaso; 2) Incremento della sintesi degli enzimi proteolitici; 3) Migrazione delle cellule nell area in cui c è lo stimolo angiogenico. 4) Fase di differenziazione in cui le cellule passano da una forma fibroblastoide ad una poligonale. 5) Fase di stabilizzazione e maturazione dei vasi, le cellule muscolari lisce si addensano all interno della parete del vaso formando una nuova matrice extracellulare compie passando

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9 I regolatori del ciclo cellulare La proliferazione tumorale dipende dallo sconvolgimento della normale progressione del ciclo cellulare e del suo controllo. Le proteine associate al ciclo cellulare annoverano cicline e chinasi ciclina dipendenti che regolano la normale proliferazione delle cellule.

10 Sono stati riconosciuti due tipi di meccanismi per il controllo del ciclo cellulare: una cascata di fosforilazioni proteiche che transita una cellula da uno stadio al successivo; checkpoints prestabiliti che monitorano il completamento di eventi critici e rinviano, se necessario, la progressione del ciclo alla fase seguente.

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12 A questo gruppo di proteine appartengono p21, p 27 e Ki-67. P21: proteina regolata da p53, inibisce la cdk2 (ciclina chinasi dipendente) e gioca un ruolo centrale nel checkpoint in G1. L inibizione delle proteine cdk è essenziale per entrare in fase S. P27: proteina inibitrice che si lega, mediante il suo dominio N-terminale, a cdk2 bloccando il sito attivo dell enzima.

13 Il ruolo della proteina p21 come variabile prognostica è controverso poiché studi condotti su questa proteina hanno dato risultati discordanti, mentre sembra avere un valore prognostico la diminuzione dell espressione di p27 nel carcinoma della vescica.

14 Ki-67 è una proteina nucleare codificata da un gene che mappa sul cromosoma 10 il cui locus però non è stato ancora ben caratterizzato, essa si accumula soltanto quando la cellula si trova allo stato proliferativo, dalla fase G1 alla mitosi.

15 Studi biochimici hanno evidenziato che la maggior parte di Ki-67 è legata ad una frazione di cromatina densamente impacchettata, probabilmente eterocromatina. Altri la descrivono come una proteina che possiede una funzione di rilievo nella condensazione della cromatina mediante la sua regione Cterminale, fungendo da raccordo tra i cromosomi e il loro apparato mitotico nella regione Nterminale.

16 REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (5) Usando tecniche di immunoistochimica, Ki-67 è stata localizzata, durante il ciclo da G1 a M, a livello della cromatina condensata spesso formante una struttura a reticolo. La proteina Ki-67 può assolvere un ruolo multifunzionale all interno del ciclo cellulare.

17 REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (6) Ki-67 è coinvolta attivamente nella ricostruzione della struttura della cromatina reclutando le heterochromatin protein 1 (HP1). Permane associata alle HP1 per il mantenimento della eterocromatina neoformata anche quando la cellula entra in interfase.

18 REGOLATORI DEL CICLO CELLULARE (7) La proteina Ki-67 viene definita un marker promettente da molti autori per la progressione e la ricorrenza del carcinoma superficiale della vescica ma, non è ancora certo il ruolo che può ricoprire come marker prognostico nel tumore localmente avanzato e nella metastasi.

19 Tra i geni coinvolti nella cancerogenesi il più studiato è un gene tumore-soppressore che mappa sul cromosoma 17 e codifica per la proteina p53. p53 è una fosfoproteina nucleare la quale, in risposta ai danni del DNA, rallenta o arresta la progressione del ciclo cellulare e indirizza la cellula verso l apoptosi se il danno riportato è severo.

20 La p53 viene accumulata nel nucleo delle cellule, dove agisce come fattore di trascrizione. A seconda del tipo di cellula e del grado di danno, la proteina transattiva geni che codificano sia per enzimi coinvolti nella riparazione del DNA che per inibitori del ciclo cellulare. Inducendo poi la trascrizione di geni pro-apoptotici come BAX, p53 orienta la cellula verso l apoptosi.

21 I checkpoints che vedono l attiva presenza di p53 sono da G1 a S e da G2 a M. In una cellula normale, la proteina p53 è presente in bassi livelli con emivita breve. La sua degradazione coinvolge Mdm2, una proteina intracellulare la quale si lega a p53 portandola fuori dal nucleo. Nel citoplasma viene ubiquitinata e subisce proteolisi.

22 Come risposta a danni al genoma, p53 viene stabilizzata grazie alla inibizione della degradazione Mdm2dipendente, in questo modo la proteina modificata non interagendo più con Mdm2, può essere espressa ad elevate concentrazioni. p53 agisce come attivatore della trascrizione di geni che codificano per proteine tra cui la proteina p21, che inibisce le proteine cdk che sono essenziali per entrare in fase S.

23 p53 è coinvolta anche nel checkpoint in fase G2. Questa proteina e molte altre sue proteine bersaglio sono necessarie per mantenere la cellula ferma in fase G2 dopo aver riportato danni al DNA. Nelle cellule tumorali queste proteine mancano, di conseguenza entrano in mitosi con una cinetica accelerata.

24 GENI TUMORE-SOPPRESSORE (6) Si pensa che p53 eserciti il blocco in G2 attraverso l attivazione della trascrizione di geni che codificano per p21 ed altre proteine. p21 può legare ed inibire il complesso ciclinab-cdc2 al fine di impedire alla cellula di entrare in mitosi.

25 GENI TUMORE-SOPPRESSORE (7) p53 è presente soprattutto in tumori di alto grado e stadio ed è associata alla progressione del tumore. Preparati istologici mostrano una colorazione positiva per p53 più frequentemente in tumori poco differenziati e invasivi. L incidenza di mutazione di p53 stimata mediante PCR, è più elevata nel tumore della vescica invasivo di alto grado che nei tumori superficiali e di basso grado.

26 GENI TUMORE-SOPPRESSORE (8) Evidenze sperimentali depongono per un ruolo sinergico dell espressione di p53 ed RB nella progressione del cancro alla vescica. Tumori con l alterazione di entrambe le proteine sono associati ad una prognosi infausta rispetto a tumori che esprimono il fenotipo wild tipe delle proteine.

27 GENI TUMORE-SOPPRESSORE (9) Un indagine immunoistochimica della presenza contemporanea di Ki-67 e p53, può avere valore prognostico per il cancro alla vescica che invade il tessuto muscolare. Pazienti ad alto rischio con una bassa espressione di Ki-67 e p53 possono non richiedere terapie post-operatorie aggressive, evidenziando pertanto l esistenza di una significativa correlazione tra la concentrazione di Ki-67 e l espressione di p53.

28 L amplificazione di oncogeni viene riscontrata in molti tumori solidi ed è spesso associata all aggressività e all esito infausto della malattia. Il proto-oncogene c-erbb-2 è una delle regioni più frequentemente amplificate nei tumori di varia origine ed in molti casi anche nel cancro della vescica. L amplificazione del gene e l elevata espressione del suo prodotto sono considerati un utile marker prognostico.

29 Il gene c-erbb-2, conosciuto anche come HER-2/neu, mappa sul cromosoma 17 ed il suo prodotto è un antigene tumorale. HER-2/neu è membro della famiglia EGFR che comprende quattro recettori correlati: HER-2/neu, HER-3, HER-4 ed EGFR. Questi recettori sono fosfoglicoproteine transmembranali con attività tirosin-chinasica.

30 Il recettore EGFR è presente soltanto sulle cellule dello strato basale (cellule immature) ed è associato alla differenziazione dell urotelio in vivo. HER-2/neu è espresso soprattutto differenziate del livello superficiale. In particolare l espressione di EGFR ed ErbB-2 aumenta la migrazione delle cellule, un passo molto importante per la formazione di metastasi. sulle cellule già

31 PROTO-ONCOGENI ED ONCOGENI (4) Il legame con l epidermal growth factor (EGF) promuove la fosforilazione del suo substrato con successivo incremento della trascrizione e della proliferazione cellulare. L espressione patologica recettore di EGF causa: - una proliferazione cellulare incontrollata; incremento dell angiogenesi riduzione dell apoptosi - del

32 L angiogenesi è essenziale per lo sviluppo e la crescita del cancro e, affinché la massa tumorale possa aumentare oltre 1-2 mm, necessita dell apporto di nutrienti ed ossigeno. Sono stati identificati un numero elevato di fattori proangiogenici e i loro recettori corrispondenti quali il: fibroblast growth factor (FGF) il platelet-derived growth factor (PDGF) angiopoietina l epidermal growth factor (EGF) vascular endothelial growth factor (VEGF)

33 Il VEGF è una glicoproteina costituita da due subunità e, il suo mrna, subisce splicing alternativo producendo quattro varianti della glicoproteina stessa. Tali isoforme, sembrano essere ugualmente capaci di stimolare, nelle cellule endoteliali la mitosi.

34 Il VEGF è considerato un fattore di sopravvivenza per le cellule endoteliali poiché inibisce l apoptosi. Esercita il suo effetto attraverso il legame ad elevata affinità a due recettori ad attività tirosinchinasica il VEGFR1 e il VEGFR2, i quali sono espressi dalla maggior parte delle cellule endoteliali.

35 FATTORI RELATIVI ALL ANGIOGENESI (4) Nella progressione tumorale l espressione di VEGF viene iperregolata: da fattori di crescita da oncogeni da stati di ipossia nel tessuto tumorale stesso. L ipossia sembra essere lo stimolo più importante, per la produzione di VEGF sia all interno della massa tumorale che nei tessuti sani.

36 La citometria a flusso permette la misurazione della fluorescenza in una sospensione cellulare che viene fatta scorrere attraverso un apparato di rilevamento mentre un fascio di luce laser eccita il fluorocromo preventivamente inserito nella cellula. L intensità di fluorescenza, determinata dallo strumento, è direttamente proporzionale alla quantità di DNA presente nella cellula e l esito della misurazione viene rappresentato in un grafico.

37 Nelle neoplasie maligne il contenuto di DNA può variare, le cellule che costituiscono il tumore possono avere una quantità addizionale o una perdita di DNA. I parametri più importanti che si possono valutare con un istogramma citometrico sono: l indice di DNA (D.I.) e la percentuale di cellule che sono nella fase S del ciclo cellulare (cellule che stanno proliferando).

38 La quntità di DNA consente di valutare aspetti importanti utili nel precisare il quadro diagnostico e spesso nella scelta di una terapia: 1) Il grado di alterazione rispetto al contenuto diploide delle cellule normali (ploidia del DNA); 2) Lo stato proliferativo individuato attraverso la consistenza numerica della popolazione in fase di sintesi del DNA (percentuale di cellule in fase S).

39 Queste informazioni si ottengono dall istogramma, risultato della misura del campione. L intensità di fluorescenza emessa da ciascuna cellula è proporzionale al suo contenuto di DNA.

40 In particolare sono riconoscibili le diverse sottopopolazioni presenti. Il primo picco corrisponde ai segnali di fluorescenza emessi dalle cellule in fase G0/G1, il secondo è relativo alle cellule in fase premitotica e mitotica (G2 + M) con contenuto di DNA doppio e la distribuzione tra di essi rappresenta le cellule in fase di sintesi. Nel caso di campioni con neoplasie, è frequente la presenza nello stesso campione di più popolazioni cellulari con diverso contenuto di DNA (tumori aneuploidi).

41 LA DNA PLOIDIA (4) Nelle neoplasie maligne il contenuto di DNA può variare, nello stesso campione neoplastico è frequente la presenza di più popolazioni con diverso contenuto di DNA (tumori aneuploidi). Il parametro utilizzato è il DNA INDEX (D.I.) cioè il rapporto tra il contenuto modale di DNA in fase G1 della sottopopolazione cellulare aneuploide e quello della sottopopolazione diploide. D.I.= 1 corrisponde alla diploidia. Esempio di istogramma che presenta popolazione aneuploide.

42 IL NOSTRO LAVORO Nel nostro laboratorio abbiamo selezionato 70 soggetti con neoplasia vescicale: 50 con neoplasia di alto grado e 20 con neoplasia di basso grado. Con la classificazione TNM sono stati valutati il grading istopatologico, il grado di infiltrazione, l angioinvasione, la necrosi, l infiltrato linfocitario.

43 IL NOSTRO LAVORO Su ogni campione è stata poi eseguita immunoistochimica per: p53, Ki-67, EGFR, VEGF e, per alcuni, l Hercep Test. Su tutti i casi è stato eseguito l esame citofluorimetrico per determinare la ploidia del DNA.

44 I NOSTRI PREPARATI Sezione di tessuto con neoplasia vescicale di alto grado. Particolare con invasione vascolare. (Ematossilina-eosina, ingrandimento 10x).

45 I NOSTRI PREPARATI Sezione di tessuto con neoplasia vescicale di alto grado ed evidente necrosi centrale. (Ematossilinaeosina, ingrandimento 20x).

46 I NOSTRI PREPARATI Sezione istologica che evidenzia la presenza di p53 mutata. (Colorazione immunoistochimica, ingrandimento 10x).

47 I NOSTRI PREPARATI Sezione con colorazione immunoistochimica che evidenzia la presenza di p53. Particolare che presenta invasione di un vaso.

48 I NOSTRI PREPARATI Sezione istologica positiva per Ki-67. (Colorazione immunoistochimica, ingrandimento 40x).

49 I NOSTRI PREPARATI Sezione istologica positiva per VEGF. (Colorazione immunoistochimica, ingrandimento 10x).

50 I NOSTRI PREPARATI Sezione positiva per il marcatore EGFR. (Colorazione immunoistochimica, ingrandimento 20x).

51 I NOSTRI PREPARATI Sezione che mostra una forte positività all HercepTest. (Ingrandimento 40x).

52 RISULTATI (1) I 50 campioni con neoplasia di alto grado sono stati valutati su vetrini colorati con ematossilina eosina e di questi il 74% presentava angioinvasione, il 44% necrosi, il 78% infiltrava il connettivo sottoepiteliale mentre il 22% la tonaca muscolare (metà interna), il 44% mostrava infiltrato linfocitario. Con metodica immunoistochimica è stato visto che l 86% risultava positivo per p53, il 98% per VEGF e il 76% per EGFR.

53 Nessuno dei 20 campioni con neoplasia di basso grado presentava angioinvasione, necrosi e infiltrazione. All analisi immunoistochimica il 75% era positivo per p53, il 95% per VEGF e il 75% per EGFR. La proteina Ki-67 nei campioni di alto grado è risultata essere positiva in tutti i campioni in percentuali diverse. Tali valori sono stati correlati con gli altri parametri di valutazione.

54 RISULTATI (3) Piu del 50% dei campioni con neoplasia vescicale di alto grado ha evidenziato una alta positività per Ki-67 (40-70% delle cellule neoplastiche) e di questi il 100% presentava positività per VEGF, il 96% per p53 ed il 75% per EGFR. Piu dell 80% dei campioni con neoplasia vescicale di basso grado mostra una bassa positività per Ki-67. Il 10% dei campioni di basso grado mostra una alta positività per Ki-67 e, di questi, il 100% è positivo per VEGF, EGFR e p53.

55 RISULTATI (4) L Hercep Test è stato eseguito su 27 campioni selezionati in base alla percentuale di positività per Ki-67. Il 33% delle neoplasie vescicali di alto grado è risultato avere una alta positività per Her2/neu (range 16-60%) e di questi il 100% è risultato positivo per VEGF e p53, il 77% positivo per EGFR ed il 100% mostrava una alta positività per Ki-67. Gli altri campioni presentavano negatività o bassa positività. Del gruppo con neoplasia vescicale di basso grado nessuno è risultato positivo per Her2/neu.

56 Su 50 casi di neoplasia vescicale di alto grado e su 20 casi di neoplasia di basso grado è stato eseguito esame citofluorimetrico per determinare il contenuto di DNA. Il 58% dei casi di neoplasia di alto grado è risultato essere diploide (D.I.=1) ed il 42% è risultato essere aneuploide (D.I.>1). Il 100% dei casi di neoplasia di basso grado è risultato essere diploide. Istogramma che rappresenta popolazione aneuploide/poliploide (D.I.=1,69/2,0).

57 VALUTAZIONE DELLA PLOIDIA DEL DNA (2) Questi risultati sono stati correlati con il parametro Ki-67 e il dato significativo che ne emerge riguarda i casi con popolazione aneuploide che presentavano una alta positività per Ki-67. Dei 50 casi con neoplasia di alto grado, 19 mostrano un contenuto aneuploide/poliploide di DNA e sono i casi che presentano una positività alta (40-70% delle cellule neoplastiche) di Ki-67. Istogramma che rappresenta popolazione aneuploide/poliploide (D.I.=1,69/2,0).

58 VALUTAZIONE DELLA PLOIDIA DEL DNA (3) Grading Alto (50) Basso (9) Ki-67 Diploide Aneuploide Basso (11) 10 1 Medio (11) 10 1 Alto (28) 9 19 Basso (17) 17 0 Medio (1) 1 0 Alto 2 0 (2)

59 DISCUSSIONE (1) I nostri dati evidenziano che i carcinomi a cellule transizionali di alto grado della vescica morfologicamente caratterizzati da necrosi e angioinvasione iperesprimono all immunoistochimica Ki.67, p53 VEGF, EGFR e all analisi citofluorimetrica aneuploidia/poliploidia. Nel carcinoma vescicale invasivo, p53 è un importante fattore prognostico poiché la sua espressione è correlata con il grado e lo stadio del tumore mentre, Her2/neu, non mostra significato prognostico.

60 Ulteriori studi sono necessari per quanto riguarda non solo l iperespressione di Her2/neu ma anche l amplificazione del suo gene per chiarire il suo coinvolgimento nella differenziazione cellulare, nell adesione e nella motilità cellulare attraverso la sua attività tirosin-chinasica. L espressione di EGFR, VEGF e p53 vengono associati a prognosi sfavorevole. L elevata correlazione tra Ki-67 e ploidia del DNA ha evidenziato che neoplasie di alto grado, con spiccata angioinvasione e diffuse aree di necrosi, costituiscono il gruppo aneuploide/poliploide che potrebbe avvalersi di trattamento più aggressivo. Si configura pertanto un gruppo a prognosi ancora più sfavorevole all interno del gruppo degli alti gradi.

61 CONCLUSIONI Utilizzando i criteri istopatologici, le tecniche di immunoistochimica e citofluorimetria, il nostro lavoro dimostra una stretta correlazione tra l espressione di Ki-67, DNA ploidia e parametri prognostici morfologici infausti nel carcinoma a cellule transizionali di alto grado della vescica. L identificazione di un gruppo aneuploide/poliploide, all interno dell alto grado, potrebbe rendere più efficace l iter diagnostico-terapeutico del paziente con neoplasia vescicale.

62 GRAZIE A TUTTI PER L ATTENZIONE ED IN PARTICOLARE AGLI ORGANIZZATORI PER AVERMI DATO LA POSSIBILITA DI ESSERE QUI OGGI Antonella Marchi