Selezione di nuovi lieviti enologici alto produttori idi glutatione. Francesco Mezzetti

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1 Selezione di nuovi lieviti enologici alto produttori idi glutatione ottenuti con le strategie di evoluzione adattativa Francesco Mezzetti

2 Panoramica della ricerca Ottenere nuovi ceppi enologici di S. cerevisiae tramite una strategia di evoluzione adattativa: Glutatione: perché è importante Quale strategia t applicare? Screening dei ceppi Caratterizzazione molecolare Validazione dei ceppi selezionati

3 Glutatione (GSH) Tiolo non proteico sintetizzato da L glutammato, L cisteina e glicina Presente principalmente nella forma ridotta del GSH (> 90%) e in quella ossidata come glutatione disolfuro (GSSG) GSH GSSG Importante antiossidante distribuito nelle cellule viventi Svolge ruoli essenziali in diversi processi: controllo del potenziale redox, protezione verso gli stress ossidativi, detossificazione da tossine esogene ed endogene, folding delle proteine e trasporto dei solfuri organici

4 GSH nel vino Controlla il danno ossidativo Limita l imbrunimento mediante la riduzione competitiva degli o chinoni Evita la formazione del sotolone e di altri caratteri di invecchiamento atipico Esercita un effetto protettivo sui vari composti aromatici nel vino 4

5 GSH, metabolismo Sul1,2p Gsh2p Gsh1p

6 Quale strategia? La scelta della miglior strategia per migliorare lieviti wild type dipende da: Obiettivi della manipolazione Natura genetica del tratto desiderato (monogenico o poligenico) Conoscenza dei geni coinvolti Nei ceppi enologici i tratti più importanti sono quantitativi (QTL, Quantitative Trait itloci): in questi casi è necessario un approccio Whole Genome Lieviti geneticamente modificati ottenuti tramite la tecnologia del DNA ricombinante sono soggetti a molte restrizioni legali e non sono apprezzati dai consumatori Pertanto, sono privilegiati gli approcci di tipo evolutivo

7 Approcci evolutivi Gli approcci evolutivi sono utili per la selezione di ceppi di lievito con fenotipi specifici, quali la resistenza ai diversi stress o l efficiente utilizzo dei substrati Si basano sulla continua e ripetuta coltura dei lieviti in una definita combinazione di condizioni in modo da selezionare specificatamente i ceppi adattati Evoluzione adattativa Pressione selettiva Pressione selettiva Pressione selettiva

8 Approcci evolutivi Questi approcci sono lunghi e laboriosi e richiedono numerosi screening. Inoltre sono applicabili solo quando il fenotipo desiderato è selezionabile. Ma un alta produzione di GSH è un fenotipo direttamente selezionabile? NO!

9 Evolution based strategy Come selezionare velocemente ed efficientemente ceppi alto produttori di GSH? I. Il Mo(VI), un analogo tossico del solfato, è applicabile come pressione selettiva indiretta. II. Il primo meccanismo di resistenza ai metalli pesanti in S.cerevisiae è GSH mediato. Ceppi resistenti it tial molibdato mostrano più facilmente un alta produzione di GSH.

10 Evolution based strategy

11 Evolution based strategy La nostra strategia basata sull evoluzione combina: Randomizzazione dei ceppi mediante ricombinazione i sessuale dll delle spore e/o mutazione Applicazione di una specifica pressione selettiva Utilizzo di un fenotipo selezionabile per la selezione dei ceppi evoluti Plating on acetateagar medium 21T2* Asci digestion by Zymoliase Evolved strains Monitoring i of tetrad digestion YPD + Ammonium Molybdate YNB medium + Mo [2.5mM] * 21T2 (UMCC 855), parental strain; Selected strain; Not selected

12 Evolution based strategy IlceppoparentalediSaccharomyces parentale cerevisiae UMCC855, della Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), è stato indotto a sporificare su acetate medium e incubati a 27 C. La formazione delle tetradi è stata monitorata periodicamente al microscopio. Acetate medium ( 0,5% sodium acetate, 2% agar)

13 Evolution based strategy Dopo la digestione delle tetradi con Zimoliasi, le spore sono state recuperate mediante centrifugazione e risospese in 1 ml di YPD broth (1%estrattodilievito,1%peptonee2%destrosio).La coniugazione dei gameti è stata monitorata al microscopio. Successivamente la sospensione cellulare è stata inoculata in provette contenenti YPD broth addizionato con molibdato di ammonio (10 mm). YPD + ammonio molibdato

14 Evolution based strategy Dalle provette con sviluppo della coltura, sono stati prelevati 100 µl della sospensione e seminati in piastre Petri contenenti YPD agar addizionato con molibdato di ammonio. Da ciascuna piastra una sola colonia è stata re isolata e purificata per ulteriori indagini. 21T2* Ceppi evoluti Molybdate Strains Medium + Mo (VI) * 21T2 (UMCC 855), Ceppo parentale; Ceppo selezionato; Ceppo non selezionato

15 Selezione dei ceppi evoluti ti ppi evolut Cep 11

16 Caratterizzazione, Interdelta and (GTG) 5 Amplificazione i degli elementi idl delta di dei retrotrasposoni Amplificazione i degli elementi ripetitivi i(gtg) 5

17 GSH, in mosto sintetico La capacità del ceppo parentale UMCC 855 e degli 8 ceppi evoluti di produrre GSH è stata valutata in via preliminare in mosto sintetico. Il GSH extra ed intra cellulare è stato determinato con un kit enzimatico. Extra, mg L -1 0,8# 0,7# 0,6# 0,5# 0,4# 0,3# 0,2# a Extra# bc a Intra# a b a a a a ab b c a ab a b 0,500# 0,450# 0,400# 0,350# 0,300# 0,250# 0,200# 0,150# 0,100# ntra, % GS SH DW -1 I 0,1# 0# nd UMCC# 855# UMCC# 2580# UMCC# 2581# UMCC# 2582# UMCC# 2583# UMCC# 2584# UMCC# 2585# nd UMCC# 2586# UMCC# 2587# 0,050# 0,000# Ceppi Evoluti

18 GSH, nel vino + 100% Mosto Trebbiano: ph 3.44 Acidità titolabile 8.68 g L -1 Zuccheri g L -1 Nessuna aggiunta di solfiti + 36% 13

19 GSH, mosto sintetico + aminoacidi solforati Test in presenza dei diprecursori

20 Conclusioni I. Conferma della Evolution based strategy come una tecnica veloce ed efficace per ottenere ceppi enologici con un alta produzione di glutatione II. Produzione di 2 ceppi evoluti capaci di incrementare significativamente ifi i il quantitativo i finale di GSHi in vino. In particolare il ceppo UMCC 2581 ha mostrato una costante t espressione dlf del fenotipo desiderato in quasi tutti i terreni testati.

21 Pubblicazioni scientifiche FEMS Yeast Res 14 (2014) Letters in Applied Microbiology (2011), 53:

22 Pubblicazioni scientifiche L Enologo, LEnologo, N 1/2 Gennaio/Febbraio 2015

23 UMCC, gruppo di ricerca Join us on UMCC Facebook