Ormesi. Effetto benefico a basse dosi di sostanze tossiche
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- Giovanna Forte
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1 Studi di Tossicità I test di tossicità non sono finalizzati a dimostrare che un dato composto chimico (farmaco, cosmetico, additivo alimentare, fitoterapico, fitofarmaco) è sicuro (cioè assolutamente senza rischio): ogni sostanza può indurre effetti sfavorevoli (o nocivi o tossici, in base alla dose); è quindi importante arrivare a determinare la stima del rischio, associato all uso della sostanza, sottoponendola a test appropriati per far emergere il livello di pericolosità del contatto.
2 Ormesi Effetto benefico a basse dosi di sostanze tossiche
3 Cosa si intende per sperimentazione clinica ogni forma di esperimento pianificato su pazienti, programmato per valutare il trattamento più appropriato di futuri pazienti con una determinata condizione patologica.
4 NESSUNA UMANA INVESTIGAZIONE SI PUO' DOMANDARE VERA SCIENZA SE NON PASSA PER LE MATEMATICHE DIMOSTRAZIONI Leonardo Da Vinci
5 Modelli animali in vivo e in vitro condizioni normali stati patologici effetti farmacologici durata di azione vie di somministrazione effetti avversi
6 SPERIMENTAZIONE PRECLINICA Durata media 2 anni Consente di isolare dalle migliaia di sostanze sottoposte al primo screening di base farmacologico e biochimico composti si identificano le strutture chimiche correlate a una certa azione farmacologica ed il numero di sostanze esaminate diminuisce ulteriormente
7 Modelli animali utilizzati Topo Ratto Coniglio Cane Primati
8 Uso degli animali da esperimento Il modello animale (mammifero) rappresenta il sistema di massima complessità biologica a rappresentazione dell impatto clinico. L animale è insostituibile ad un certo livello della sperimentazione: nessun protocollo di sperimentazione di una nuova molecola prevede, per ora, solo test In vitro. Esistono comunque norme etiche che devono guidare la sperimentazione: rispetto della vita e moderazione della sofferenza degli animali durante l esperimento e al momento della soppressione (sacrificio). Locali di stabulazione e personale addetto sono soggetti ad approvazione da parte del Ministero della Sanità. Legislazione: Gazzetta Ufficiale D.L. n. 116, suppl; e successive; DIRETTIVA 2010/63/UE. Protocolli sperimentali controllati: devono seguire le norme di legge vigente o essere approvati in caso di deroghe; sono previste visite periodiche di un veterinario responsabile, specialmente durante la sperimentazione a lungo termina.
9 Sperimentazione in vivo Vantaggi/ /Svantaggi Valuta effetti sistemici; Permette di monitorare più parametri biologici contemporaneamente; Consente di studiare, anche in tempi prolungati, processi biologici complessi: cancerogenesi, teratogenesi, comportamento Tiene conto dei meccanismi di tossicocinetica Ha un costo elevato Presenta la necessità di strutture e processi di stabulazione adeguati Prevede un ampia variabilità biologica delle rilevazioni sperimentali Non permette di ottenere alcuna informazione sul fine meccanismo d azione a livello molecolare
10 Esperimenti in vivo Requisiti richiesti: Piccola taglia, docilità, maneggevolezza, robustezza, prolificità, facile stabulazione, facile alimentazione Topo, ratto, cavia, coniglio, cane, scimmia Caratteristiche omogenee negli animali: Patrimonio genetico (ceppo), età, peso, sesso, stato di salute Condizioni di stabulazione: Temperatura (22-24 C) ventilazione, umidità, ritmo circadiano Dieta: Standard di facile conservazione (pellets), composizione costante
11 Metodi alternativi all animale Simulazioni al computer (modelli matematici complessi che non sono comunque in grado di considerare tutte le variabili di una matrice biologica Saggi biochimici (che rappresentano una semplificazione di sistema Colture cellulari: Colture primarie (estemporanee da tessuto, differenziate ma labili) Linee immortalizzate (in grado di proliferare all infinito) Cellule tumorali (linee cellulari da ceppi specifici) Cellule staminali (totipotenti, capaci di dare origine a qualsiasi tipologia di differenziazione)
12 Esperimenti in vitro Vantaggi Svantaggi Facilità di reperibilità dei dati, minima variabilità biologica Uniformità genetica (elevata riproducibilità) Possibilità di manipolazione genetica Predittività dei meccanismi d azione a livello molecolare Possibilità di impiego di materiale umano Impossibilità di rappresentare processi biologici complessi (es. tossicocinetica) Difficoltà ad estrapolare i risultati in vivo Non perfetta rappresentatività delle cellule immortali (anche umane) rispetto a quelle differenziate
13 Prove di tossicità precliniche da 2 a 5 anni, 40 milioni di euro per farmaco commercializzato tossicità acuta dose singola (LD 50 ) tossicità subacuta tre dosi tossicità cronica 1-2 anni (durante la sperimentazione clinica) tossicità riproduttiva fertilità, teratogenicità, lattazione tossicità mutagena tumori, mutazioni batteriche
14 Test di Tossicità Generica Tossicità acuta Tossicità sub-acuta Tossicità sub-cronica Tossicità cronica Mutagenesi Particolare Cancerogenesi Teratogenesi Sensibilizzazione (effetti allergogeni)
15 Sperimentazione animale Animale = uomo mg/m 2 differenze di specie stesse vie di esposizione esami clinici, strumentali, autoptici Maggiore esposizione = maggiore incidenza alte dosi ridotto numero di animali
16 Roditori: non sono in grado di vomitare, ciò viene sfruttato per certi rodenticidi (ANTU alfa-naftiltiourea, scilla rossa) che irritanti, vengono vomitati da cane e gatto (funzione protettiva) CONIGLIO: minore sensibilità agli effetti tossici dell atropina --> dotato CONIGLIO: minore sensibilità agli effetti tossici dell atropina --> dotato di un esterasi epatica in grado di idrolizzarla rapidamente (idrolisi lenta nelle altre specie)
17 Dose/superficie
18 species weight dosage (mg/kg) dose (mg/ animal) surface area (cm 2 ) dosage (mg/cm 2 ) mouse rat dog man
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23 Tossicità acuta Obiettivi Identificazione degli organi bersaglio e di altre manifestazioni cliniche a rapida insorgenza Informazioni sul meccanismo d azione tossica Durata degli effetti Reversibilità dell effetto tossico Valutazione della letalità (DL 50 ) Stima dei livelli di dose da utilizzare negli studi successivamente
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26 Acuta Studi di tossicità sull animale Sistemica (almeno 2 vie) 2 o + specie, reversibilità, organi bersaglio osservazione per 14 giorni, esame autoptico DL 50 Locale Supertossici: < 5mg/kg Non tossici: > 15 g/kg cutanea oculare Sensibilizzazione allergica somministrazione cutanea o intradermica sostanze adiuvanti
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28 Fattori che possono far variare la DL 50 Numero degli animali considerati Specie (e in certi casi il ceppo, es. topi nude) Sesso Età Peso Dieta Temperatura ambientale (e altre variabili dell ecosistema) Periodo stagionale (cronobiologia)
29 Subacuta Studi di tossicità sull animale 3-4 somministrazioni tre dosi tossica (letale 10%) non tossica intermedia Subcronica via di esposizione umana, 90 giorni dosi come nella subacuta individuazione di NOAEL e LOAEL
30 Obiettivi degli studi di tossicità sub-cronica Definire: la relazione tra intensità degli effetti e dose assunta gli organi bersaglio degli effetti tossici la reversibilità/irreversibilità degli effetti Indicazioni (dosaggi) per gli studi a lungo termine
31 Osservazioni Dopo la somministrazione vi è un periodo osservazionale di circa 14 giorni per i seguenti rilievi: Comportamentali: aggressività, tremori, piloerezione, posizione della coda, comportamento esplorativo, emissione suoni Fisiologici: peso corporeo, consumo di cibo, temperatura corporea, riflessi, frequenza e ritmo cardiaco Al termine del test tutti gli animali sono sottoposti ad esame autoptico effettuando esami macro e microsopici su tutti gli organi
32 Mutagenesi Mutazioni geniche o puntiformi: alterazioni in una o poche coppie di basi Mutazioni cromosomiche: alterazione della struttura dei cromosomi (accorciamento, alterazione della forma ) Mutazioni genomiche: alterazioni nel numero dei cromosomi Le mutazioni possono: insorgere in modo spontaneo mutazioni spontanee; Essere indotte da agenti chimici o fisici mutazioni indotte
33 CANCEROGENO GENOTOSSICO Attivazione di oncogèni Inattivazione di geni oncosoppressori Iniziazione CANCEROGENO EPIGENETICO inibizione apoptosi, induzione da stress ossidativo, espansione clonale, azione sulla replicazione del DNA Trasformazione neoplastica Progressione Tumore
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36 Mutazioni indotte Le lesioni premutazionali sono dovute a Reazioni di deaminazione ossidativa: da acido nitroso a nitrosamine Formazione di epossidi/radicali liberi Formazione di legami covalenti tra le basi: effetto dei raggi UV Reazioni di alchilazione, con legame di gruppi chimici alle basi azotate: effetto degli agenti alchilanti Inserimento o delezione di basi: agenti intercalanti
37 Il Test di Ames Screening per gli agenti chimici che si sospettano capaci di mutagenicità e cancerogenicità utilizzando ceppi di Salmonella typhimurium Si basa appunto sulla forte correlazione esistente tra mutagenicità e cancerogenicità Stabilisce la capacità della sostanza di indurre mutazioni in un ceppo di salmonelle (in genere istidina +) in cui è compromessa la via biosintetica dell istidina per mutazione selettiva sul gene corrispondente ad un enzima chiave della biosintesi (istidina -) Il mutageno può determinare con alta probabilità una nuova mutazione corrispondente nel gene compromesso (reversione), permettendo così al batterio di risintetizzare l aminoacido essenziale istidina
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39 La cancerogenesi È un processo più complesso di quello che deriva dalla semplice mutazione genetica È caratterizzata da due processi successivi: Fase di iniziazione le cellule bersaglio subiscono l azione dell agente cancerogeno, subiscono delle trasformazioni che non si evidenziano fenotipicamente, o si evidenziano con difficoltà Fase di promozione le cellule trasformate nella fase precedente, pur in assenza dell agente cancerogeno (che inizialmente le aveva trasformate), se sottoposte a determinati stimoli, rivelano i caratteri acquisiti nella fase precedente
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41 Esempi di promotori chimici Induttori enzimatici: pesticidi organoclorurati (DDT), Agenti ormonali: idrocarbuti aromatici policiclici (PAI, es. benzopirene), barbiturici. estrogeni (tumori ormonosensibili). Immunosoppressori: ciclosporina A, azatioprina, diossina. Solidi cancerogeni: asbesto (amianto), plastiche. Gli idrocarburi policlicici sono sia iniziatori che promotori dei tumori e si definiscono perciò cancerogeni completi.
42 INIBITORI DELLA PROMOZIONE Retinoidi: analoghi della vitamina A Vitamina A Carotenoidi: β-carotene, precursore della vitamina A Favoriscono la differenziazione dei tessuti epiteliali.
43 PROGRESSIONE Acquisizione di segnali proliferativi autonomi (benigni) Diminuzione della sensibilità agli ormoni, fattori di crescita, chemioterapici Inibizione dei segnali inibitori della crescita Immortalizzazione Evasione dal programma di morte cellulare per apoptosi Acquisizione di vasi sanguigni (angiogenesi) Capacità invasiva Capacità metastatica Perdita della differenziazione Alterazione della proliferazione
44 Atipie morfologiche Membrana plasmatica: microvillimicrovilli evaginazioni Invaginazioni complessi giunzionali cilia Recettori scompaiono Reticolo endoplasmatico: diminuito
45 Atipie morfologiche Ribosomi: Poco efficienti Aumentano i ribosomi liberi, monomeri e dimeri Diminuiscono i ribosomilegati, polisomi Diminuisce la sintesi delle proteine di ecrezione Mitocondri: Diminuiscono di numero e di volume Forma irregolare, matrice poco densa, creste irregolari e diminuite all interno ci sono gocciole lipidiche, cristalli di calcio e fosforo, DNA abnorme
46 Atipie biochimiche e del metabolismo Comparsa di proteine fetali: α-fetoproteina Antigene carcino-embrionale Sintesi ectopicadi ormoni ed enzimi non presenti nei tessuti che hanno dato origine alla neoplasia Diminuzione di enzimi di superficie come glicosiltransferasi, adenilatociclasi Diminuzione degli enzimi della catena enzimatica microsomale Aumento degli enzimi difensivi Aumento del metabolismo glicolitico Aumento metabolismo di proteine e grassi
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51 Alimentazione e cancro: procancerogeni Affumicati/grigliati (presenza di benzopireni): attenzione ai cibi affumicati e cotti su griglia, brace, barbecue (zone carbonizzate) Fritti: trasformazione di grassi animali e oli di semi a basso punto di cracking (rapido inscurimento) Bevande alcoliche: etanolo acetaldeide Nitrati-Nitriti/Nitrosamine: cibi proteici + nitroderivati usati come conservanti dal 1990 è obbligatorio aggiungere Ac. Ascorbico agli insaccati contenenti nitrati per impedire la trasformazione a nitriti e nitrosamine Tabacco: alcaloidi (nicotina) nitrosamine catrami- PAI (benzopirene) derivati epossidici
52 Teratogenesi Si assiste allo sviluppo di malformazioni strutturali e/o comportamentali irreversibili presenti alla nascita o rilevabili in periodo perinatale (ecografia intrauterina o primi anni di vita) Tossicità embriofetale Si assiste a ritardo di sviluppo psicofisico senza evidenza di malformazioni. Le alterazioni possono essere permanenti o reversibili (es. crisi di astinenza per tossici o farmaci)
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56 La Placenta La barriera placentare è meno selettiva della BEE Può essere considerata un filtro a setaccio di maglia larga, che può quindi essere attraversata anche da molecole idrofile con PM fino a 700 Dalton Quasi tutti i farmaci (tranne le macromolecole idrofile) possono quindi raggiungere il feto L apporto di sangue attraverso i vasi ombelicali è ampio ma il flusso è lento aumenta il tempo di scambio.
57 Agenti tossico-nocivi per lo sviluppo della specie umana Infezioni Virus della Rosolia Cytomegalovirus Herpes virus Toxoplasma Spirocheta (sifilide) Squilibri metabolici Alcolismo Diabete Carenza di folati Malattie reumatiche Fenilchetonuria Agenti fisici: Radiazioni Diagnostica/terapia o Incidenti/armamenti
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59 Valutazione dei risultati La mancata comparsa di eventi teratogeni strutturali o comportamentali al termine dei test sull animale non garantisce l innocuità di una sostanza per l uomo! Ciò perché: La durata della gravidanza nei comuni animali da esperimento è molto diversa (20 gg ratto, 30 gg coniglio, 60 gg cane, 270 gg specie umana) La struttura della placenta nella specie umana è più semplice che in altri mammiferi (barriera meno efficace) La metabolizzazione delle sostanze assunte può essere differente I primi 10 giorni di vita del ratto corrispondono al terzo trimestre di gravidanza
60 Cause di teratogenesi La teratogenesi può essere conseguenza di: Mutazioni (geniche, cromosomiche o genomiche) indotte di solito nel feto da agenti chimici o fisici. Carenze di nutrienti precursori e substrati essenziali (per lo più vitamine e minerali) prodotte di solito da diete ristrette o monotone, come pure da difetti di trasporto attraverso la placenta. Inibizione di attività enzimatiche (alterazioni metaboliche) per patologie materne e/o interazioni con sostanze assunte dalla madre. Deficit di ossigeno (ipossia) per patologie materne e/o sostanze assunte dalla madre.
61 Fattori che influenzano la teratogenesi La sostanza (farmaco/tossico) in relazione a: 1. Capacità di attraversare la barriera placentare e di penetrare nei tessuti embrionali (sost. lipofile > idrofile); 2. Via di somministrazione/esposizione (via parenterale > orale > topica 3. Durata del trattamento/esposizione (assunzione cronica > occasionale. 4. Emivita della sostanza (t 1/2 ) e/o dei suoi metaboliti
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63 Cause di teratogenesi La teratogenesi può essere conseguenza di:
64 Modello di studio sperimentale Studi in laboratorio / sperimentazione clinica Dove lo sperimentatore: determina un esposizione e ne studia gli effetti assegna le unità sperimentali ai diversi trattamenti definisce modalità e durata dei trattamenti definisce il numero di unità sperimentali per ciascun trattamento
65 Clinical Trial o Esperimento Clinico Controllato Esperimento condotto per misurare l efficacia di un trattamento terapeutico. Sinonimi: Randomized Clinical Trial Trial Clinico Randomizzato
66 Un clinical trial non è uno studio isolato ma si inserisce in una sequenza di indagini per conoscere e valutare le prestazioni di un farmaco o di un trattamento, in modo comparativo rispetto ad altri farmaci o trattamenti
67 IL PROTOCOLLO DI STUDIO Il protocollo di studio è il documento formale in cui: si descrivono rigorosamente il razionale della ricerca, gli obiettivi specifici, il disegno dello studio e la metodologia di esecuzione si fissano le linee guida di comportamento alla luce dei risvolti etici della sperimentazione
68 Obiettivo della ricerca La definizione degli obiettivi della ricerca presuppone una ipotesi di lavoro in cui siano contenuti: La definizione del trattamento (posologia e tempi) Confronto vs Placebo: misura il puro effetto farmacologico Confronto vs trattamento standard: fornisce la stima quantitativa e qualitativa dell efficacia del farmaco e la sua reale importanza terapeutica La scelta degli End Points (misurazioni fatte per rispondere ai quesiti della sperimentazione) Il gruppo di controllo e relativo trattamento La scelta dei pazienti (randomizzazione)
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71 durata 4-6 anni Sperimentazione clinica variabilità del decorso clinico concomitanza di altre malattie fattori di rischio ambientali o comportamentali interazioni con altri farmaci aderenza alla terapia pregiudizi di paziente e sperimentatore
72 Obbiettivi sperimentazione Obbiettivo Definizione della dose Evidenza di successo terapeutico Confronto con trattamento standard Vigilanza sugli effetti indesiderati Fase I II III IV
73 Sperimentazione clinica: Fase 1 Consente di definire dose massima tollerata, forma galenica, tempi di somministrazione in rapporto agli studi di farmacocinetica centri di ricerca, università ristretto numero di volontari (<20 non randomizzati) Sani Malati Senza gruppo di controllo studio in aperto risposta al farmaco farmacocinetica limiti di sicurezza
74 Sperimentazione clinica: Fase 2 Consente di definire dosaggio migliore centri clinici, università piccolo gruppo di pazienti malati (10-200) Non randomizzati Singolo dosaggio confronto con placebo e farmaco attivo già noto singolo cieco efficacia terapeutica effetti tossici
75 Sperimentazione clinica: Fase 3 Consente di definire l efficacia del farmaco molti pazienti (1.000) protocollo sperimentale modificato rispetto a fase 1 e 2 doppio cieco cross-over efficacia effetti tossici poco frequenti farmacoidiosincrasia farmacoallergia
76 Durata Fase 3 A seconda della patologia e del trattamento di confronto Farmaco Depressione: 4w 6 mesi Farmaco Ipertensione: 3 6 mesi Farmaco Diabete: 6 mesi 1 anni Farmaco Osteoporosi: 4 5 anni
77 Sperimentazione clinica: Fase 4 Fase 3 favorevole ministero sanità commercializzazione. in casi eccezionali, si può saltare la fase 3 Fase 4 controllo post-marketing effetti tossici rari (1:10.000)
78 La storia della talidomide (N-ftalimido-glutaride) Prodotta da CHEMIE GRÜNENTHAL (Contergan) 1950 nasce come sedativo ed ipnotico Prescritto nel controllo della nausea in gravidanza negli aa prima segnalazione di allarme su Lancet, della nascita di bambini focomelici (10.000) Farmaco ritirato dal commercio nel viene utilizzato per sedare di pazienti di lebbra, maschi. Il quadro clinico regredisce dopo 4-48 ore 1989 viene sperimentata la potenzialità di immunosoppressore nei trapianti 2000 inizia l uso per HIV e cancro (per ora sperimentale) Oggi in associazione nel trattamento del mieloma multiplo Programma S.T.E.P.S. per il controllo
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80 Metodi sperimentazione clinica consenso informato scelta casuale dei soggetti (randomizzazione) confronto con placebo o con farmaci noti alternanza di trattamenti (cross-over) singolo cieco doppio cieco
81 Cross-over Cross-over o disegno sperimentale incrociato, consiste nell alternare, in ciascun soggetto, periodi di somministrazione del farmaco in studio con periodi di somministrazione di placebo (controllo) o di farmaco standard (controllo positivo). Questo serve a diminuire gli errori introdotti dalle fluttuazioni della gravità della malattia in esame
82 Durata brevetto farmaco
83 Certificato di protezione supplementare
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