Le ricerche sul metabolismo energetico nel sistema nervoso centrale nell attività scientifica del Prof. Gianni Benzi A cura di Antonio Moretti

Transcript

1 Le ricerche sul metabolismo energetico nel sistema nervoso centrale nell attività scientifica del Prof. Gianni Benzi A cura di Antonio Moretti Questo argomento di ricerca ha occupato l'attività scientifica del Prof. Benzi tra gli anni '70 e la fine degli anni '90 ed è certamente quello al cui avanzamento l'istituto da Lui diretto ha dato un contributo fondamentale dal punto di vista sia teorico che sperimentale. L attività di ricerca del Prof. Benzi in questo settore è compendiata in numerose pubblicazioni scientifiche, di cui 20 studi di rassegna e due monografie. Già nel l interesse scientifico del Prof. Benzi si era concentrato sul SNC, anticipando già le ricerche svolte nei decenni successivi. Ne sono prova alcune ricerche sperimentali allora realizzate nell Istituto di Farmacologia medica (Prof. Mascherpa) che dimostrano, con la tecnica del cervello isolato e perfuso in situ, che anche il SNC possiede un attività farmaco-metabolizzante e altre in cui la tecnica EEG era utilizzata per lo studio della funzionalità cerebrale in condizioni fisiologiche, patologiche (ipossia) o farmacologiche (trattamento con adenosina e con ATP). L attività degli anni successivi, svolta presso l Istituto di Farmacologia della Facoltà di Scienze, di cui il Prof. Benzi è stato il Direttore, ha enormemente ampliato e approfondito questa tematica. Per meglio valutare questo passaggio, è importante osservare che il concetto prevalente in quell epoca attribuiva l effetto dei farmaci nelle malattie cerebrovascolari alla loro azione sul flusso ematico cerebrale, mentre agli effetti metabolici veniva attribuito un ruolo secondario. A questo proposito, è indispensabile premettere che il metabolismo cerebrale è fondamentalmente aerobico e quindi mitocondriale: il tessuto cerebrale ha un consumo assai elevato di O 2 e glucosio e dipende dalla fosforilazione ossidativa per la trasduzione di energia che si attua mediante un complesso meccanismo a livello mitocondriale. La liberazione (variazione) di energia libera ΔG, dipende da un processo che utilizza O 2 quale accettore terminale di elettroni trasferiti nella catena respiratoria (ETC). Pertanto, un normale metabolismo energetico è indispensabile per mantenere i gradienti ionici, per la ricaptazione di neurotrasmettitori, le sintesi proteiche e per le altre funzioni tissutali. Perciò ogni alterazione di questo meccanismo prioritario determina inevitabilmente gravi conseguenze per le funzioni cerebrali. In questo contesto, l attività di ricerca è consistita nello studio sperimentale: 1

2 (a) delle alterazioni indotte in condizioni fisiologiche (invecchiamento) e/o patologiche (ipossia, ischemia, ipoglicemia, iperammoniemia, emorragia sub-aracnoidea) sui processi di trasduzione energetica cerebrale, b) dell effetto di vari farmaci noti per agire sul SNC con meccanismo vascolare o metabolico. In questa enorme quantità di ricerche (cui i diversi Laboratori dell Istituto hanno contribuito in misura fondamentale e in base alle proprie specializzazioni) si possono evidenziare alcune tematiche che si sono evolute negli anni, e talvolta si sono sovrapposte. A. METODOLOGIE E MODELLI SPERIMENTALI Le tecniche utilizzate possono essere sinteticamente riassunte come segue: a. metodi per il dosaggio dei nucleotidi adenilici (ATP, ADP, AMP, per il calcolo del potenziale di carica energetica ECP, del c-amp, del creatin-fosfato, degli intermedi della glicolisi e del ciclo di Krebs e di amminoacidi; b. studio di modelli sperimentali di invecchiamento cerebrale; c. studio di modelli sperimentali di ipossia ottenuta in varie condizioni e in età diverse; d. studio di modelli sperimentali di ischemia cerebrale e ricupero post-ischemico; e. studio di un modello di ipoglicemia; f. studio di un modello di iperammoniemia; g. studio dello stress ossidativo e del sistema del glutatione; h. studio di un modello sperimentale di emorragia sub-aracnoidea; i. studio del trattamento farmacologico sulle ATP-asi in condizioni di fisiopatologia sperimentale. 2 B. EFFETTI DELL INVECCHIAMENTO FISIOLOGICO e/o PATOLOGICO (IPOSSIA, ISCHEMIA, IPOGLICEMIA, IPERAMMONIEMIA, EMORRAGIA SUB- ARACNOIDEA) E DEI TRATTAMENTI FARMACOLOGICI SULLA BIOENERGETICA CEREBRALE: RICERCHE SPERIMENTALI Le ricerche in questo campo sono molto complesse per il numero di variabili prese in esame: condizioni fisiopatologiche, aree cerebrali esaminate e parametri neurochimici analizzati. Pertanto, verranno qui riassunte solo le principali osservazioni effettuate traendone le conclusioni più rilevanti. Le ricerche sull invecchiamento hanno dimostrato uno sbilanciamento nel contenuto dei costituenti dell ETC, che provoca: a) il decremento della trasduzione energetica, b) l aumento della fuga di elettroni fuori della normale sequenza dell ETC, c) l incremento del rilascio di radicali dell O 2 che, a sua volta induce: d) reazioni perossidative favorite anche dalla ridotta funzionalità dei fattori anti-perossidativi (glutatione). Tra gli enzimi della glicolisi anaerobica e del ciclo di Krebs, l invecchiamento riduceva l attività di alcuni,

3 ma non di altri (es. piruvato deidrogenasi). Vari farmaci inducevano effetti diversi sul metabolismo energetico. Tra gli gli effetti più interessanti della somministrazione cronica o subcronica nei ratti vecchi, quelli con nicergolina, CDP-colina, vincamina, acetil-carnitina. La CDP-colina incrementava anche la sintesi di RNA ridotta dall invecchiamento. È` stato pure possibile aumentare con un trattamento farmacologico (fosfatidilcolina, teniloxazina, alcaloidi dell ergot) la difese anti-perossidative del sistema del glutatione. L ipossia e il recupero post-ipossico sono stati studiati in varie condizioni sperimentali. L ipossiemia di grado severo ha alterato drammaticamente il metabolismo energetico cerebrale, come dimostrato dalla marcata riduzione del potenziale redox (accumulo di lattato) e dalla diminuzione dell ECP, del creatin-fosfato, del c-amp in campioni di tessuto cerebrale in toto. L invecchiamento non ha modificato queste alterazioni, ma ha peggiorato ulteriormente l efficienza energetica studiata a livello subcellulare in sinaptosomi isolati dal tessuto cerebrale. La perfusione intra-carotidea con barbiturici e, sia pure in misura minore, con derivati dell ergot ha ridotto il danno da ipossia, mentre la bemegride lo ha peggiorato e nicergolina, suloctidil, e l alcaloide della Vinca minor (-)eburnamonina hanno influenzato positivamente solo il ricupero postipossico dell ECP. Nei sinaptosomi isolati dopo ipossia l efficienza del sistema era pure marcatamente alterata in funzione della gravità dell ipossia e dell età. E` stato possibile confermare l effetto stabilizzatore dello stato energetico da parte dei barbiturici e riscontrare una parziale azione protettiva da parte della CDP-colina e di derivati dell ergot. Il trattamento con nicergolina ha parzialmente modificato anche le alterazioni delle attività degli enzimi della trasduzione energetica nei mitocondri, soprattutto quelli non-sinaptici. Sono stati studiati anche gli effetti di vari tipi di pretrattamento sub-cronico o cronico con vari farmaci dimostrando l inefficacia del Ca-omopantotenato, della papaverina (quindi l assenza di ruolo della macrocircolazione nel controllo dell efficienza del sistema), mentre almitrina, δ-yoimbina, teniloxazina hanno ridotto l alterazione dell efficienza energetica indotta da ipossia nell invecchiamento; inoltre il naftidrofuril e la citidina erano attivi in un modello di ipossia prolungata e intermittente. L effetto dell ipossia sui diversi parametri del metabolismo glucidico e sull ECP era maggiore se ad essa si aggiungeva l ischemia e ancora più grave se l ischemia era completa. Tuttavia il recupero post-ipossico era più difficile dopo ischemia incompleta rispetto a quella completa, probabilmente a causa del forte accumulo di lattato che si verifica nella prima a causa dell apporto di glucosio in assenza di O 2. Nicergolina e medibazina hanno migliorato il recupero dell ECP dopo ipossia associata ad ischemia completa. In condizioni di ischemia completa non associata ad ipossia, si notavano: a) l attivazione della glicolisi anaerobica; b) la caduta dell ECP ed il disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa probabilmente a causa dell attivazione delle fosfolipasi di membrana e della conseguente liberazione di acidi grassi (FFA); c) alterazioni (diminuzione o aumento) del contenuto di intermedi del metabolismo glucidico, degli 3

4 amminoacidi e dell attività di enzimi mitocondriali e sinaptosomiali, compresa l acetilcolinesterasi. Tali alterazioni tendevano a regredire durante la fase del recupero post-ischemico che in qualche caso ha potuto essere abbreviato da un pretrattamento farmacologico (diiidroergocristina, vincamina) soprattutto per quanto riguarda l ECP. Un altro argomento di grande significato clinico e sperimentale ha riguardato gli effetti dell ipoglicemia grave (<1 μmole/g di sangue, EEG isoelettrico) sul metabolismo cerebrale. Come conseguenza della deplezione delle riserve di glucosio e di glicogeno, si sono notate estese alterazioni del metabolismo glucidico, amminoacidico e lipidico e caduta dell ECP e del creatinfosfato. Il recupero postipoglicemico ha consentito un parziale ripristino dei suddetti parametri, ma nell invecchiamento si riscontrava un minore ricupero energetico (ECP) e del contenuto di metaboliti cerebrali rispetto all età adulta. In accordo con questa osservazione, era minore nell invecchiamento l effetto dell infusione i.v. di alcuni farmaci, diidroergocristina, alcaloidi della Vinca minor, raubasina, almitrina. piracetam. Quest ultimo, peraltro, era privo degli effetti peggiorativi del recupero del glucosio e del rapporto lattato/piruvato che invece erano indotti da altri farmaci rispetto ai controlli. Infine l acetilcarnitina ha diminuito ulteriormente il contenuto di fosfolipidi parallelamente all aumento degli acidi grassi liberi (FFA) probabilmente in relazione al fatto che la carnitina e/o i suoi esteri fungono da trasportatori per i movimenti di membrana degli acidi grassi a lunga catena. L iperammoniemia acuta ha alterato il sistema glutammato-ammoniaca causando aumento della glutammina (detossificazione dell ammoniaca) bilanciato dalla diminuzione dell aspartato, attivazione del metabolismo glucidico con incremento dell energia libera e variazioni del potenziale di transmembrana a riposo che è risultato meno negativo. Invece, un esperimento di iperammoniemia cronica nel ratto ha dimostrato, tra le varie attività enzimatiche del metabolismo energetico analizzate, solo la diminuzione della NADH-citocromo c reduttasi mitocondriale che non era corretta dalla somministrazione cronica di S-adenosil-metionina. Infine, un altro modello sperimentale di patologia umana è stato quello dell emorragia subaracnoidea sperimentale (SAH). Dal punto di vista bioenergetico è stata riscontrata una diminuzione della respirazione (controllo respiratorio) nei mitocondri non sinaptici, in un primo tempo probabilmente indotta dal ridotto flusso ematico cerebrale (ischemia parziale) e successivamente dall alterazione delle membrane mitocondriali. Inoltre la SAH era associata ad un calo dell attività Na +,K + -ATPasica corticale non accompagnato da processi lipoperossidativi. Con questo modello di SAH è stato anche studiato l incremento del release ex vivo di eicosanoidi (varie prostaglandine e leucotriene) ridotto dal trattamento con un calcio-antagonista, la nicardipina, mentre alte dosi di metilprednisolone riportavano l attività Na +,K + -ATPasica ai valori dei controlli. 4

5 Dopo aver a lungo studiato gli effetti dell ipossia, dell ischemia, dell invecchiamento e delle altre condizioni fisiopatologiche sulla sintesi di ATP, è stato logico il passo successivo dello studio del consumo di ATP. Utilizzando tecniche di subfrazionamento cellulare di particolare complessità che hanno permesso l isolamento di frazioni subcellulari definite dove in vivo sono localizzate le ATP-asi, è stato possibile analizzare la plasticità delle ATPasi sinaptiche non mitocondriali (Na +,K + -ATPasi; Ca 2+ -ATPasi ad alta e bassa affinità; Mg 2+ -ATPasi; Ca 2+,Mg 2+ ATPasi) che svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell omeostasi sinaptica. Il modello utilizzato è stato quello dell ipossia sperimentale intermittente cronica (4 settimane) di varia gravità. In condizioni di normossia l invecchiamento riduceva l attività di tutte le ATP-asi eccetto la Ca 2+ -ATPasi ad alta affinità. L adattamento all ipossia di grado lieve o marcato era caratterizzato da una ridotta attività di tutte le ATP-asi, eccetto la Mg 2+ -ATPasi, senza che l età interferisse in misura marcata. L effetto sulla Mg 2+ -ATPasi era caratterizzato dalla diminuzione dell attività della forma enzimatica localizzata nella membrana plasmatica sinaptica (interessata all idrolisi dell ATP) insieme all aumento dell attività della forma localizzata nelle vescicole sinaptiche accoppiata ad un neurotrasmettitore come il glutammato di cui è ben noto il ruolo nell ipossia/ischemia. Il trattamento cronico durante tutto il periodo dell esperimento con molecole a varia attività farmacologica (clonidina, δ-yoimbina, almitrina, nicardipina, fosfatidilcolina, teniloxazina) aumentava l attività di diverse ATPasi in funzione della attività enzimatica specifica, della localizzazione subcellulare e dell affinità del substrato. 5 C. STUDI IN PATOLOGIE UMANE Uno studio nelle demenze, molto interessante per il momento in cui era stato effettuato (1986), ha dimostrato che nel CSF di pazienti di demenza degenerativa primaria (ma non di demenza multinfartuale) l attività colina acetiltransferasica era minore che nei controlli, anche se la differenza non era significativa. Invece la concentrazione di GABA risultava significativamente maggiore nella demenza multinfartuale. In un altra ricerca, la concentrazione di glutammato risultava molto inferiore nel CSF di pazienti di demenza e di atrofia olivoponto-cerebellare rispetto ai controlli. Ancora per quanto riguarda le demenze, il Prof. Benzi è stato co-autore di due rassegne riguardanti rispettivamente il coinvolgimento dei radicali dell O 2 nella patogenesi della m. di Alzheimer e una valutazione critica dei possibili fattori neurochimici e farmacologici che influenzano l attività clinica degli inibitori delle colinesterasi in tale malattia.

6 D. CONCLUSIONI A partire dagli anni 70 l attività di ricerca del Prof. Benzi ha riguardato un argomento assolutamente originale e innovativo nel campo della Farmacologia che aveva sempre trascurato i processi di trasduzione di energia nello studio del meccanismo d azione dei farmaci attivi sul S.N.C. Tale argomento è stato affrontato con un approccio del tutto nuovo sia dal punto di vista dei fondamenti biofisici dei fenomeni studiati, sia da quello metodologico e di modellistica sperimentale. Perciò queste ricerche hanno contribuito in modo fondamentale alla conoscenza dei processi energetici che stanno alla base dell invecchiamento fisiologico e di patologie umane di grande rilevanza clinica e importanza terapeutica, come le ipossie e le ischemie cerebrali. 6