Tecniche di preparazione degli spermatozoi

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1 Il manuale WHO 2010 per l esame del liquido seminale:luci e ombre Bologna 29 gennaio 2011 Tecniche di preparazione degli spermatozoi Nilla Calza U.O.Ginecologia e Fisiopatologia della Riproduzione Umana. Azienda Ospedaliero Universitaria S.Orsola Malpighi di Bologna

2 Nella quinta edizione del manuale WHO la sezione dedicata alla preparazione spermatica è stata espansa rispetto alla precedente e sono state descritti: -tutti i metodi comunemente impiegati per preparare gli spermatozoi da eiaculato -le modalità per maneggiare i campioni di seme infetti da HIV -il trattamento degli spermatozoi ottenuti dal testicolo e dall epididimo -metodologie necessarie per raccogliere gli spermatozoi da pazienti con eiaculazione retrograda Le tecniche di preparazione degli spermatozoi possono essere finalizzate : a test diagnostici di funzionalità al recupero terapeutico per la tecniche di fecondazione assistita

3 Nello sperma umano si distingue: COMPONENTE CELLULARE: precursori della linea germinale, sottopopolazioni di spermatozoi vivi e apoptotici, detriti cellulari, leucociti, cellule epiteliali COMPONENTE LIQUIDA: Plasma seminale costituito da proteine,lipidi, prostaglandine, ormoni, ioni, acido citrico, fruttosio, una grande varietà di enzimi tra cui anche enzimi proteolitici,, zinco, carnitina, bicarbonati, muco

4 Le tecniche di trattamento dello sperma umano per la fecondazione assistita hanno lo scopo di: 1) Isolare il maggior numero di spermatozoi vivi, dotati di buona motilità progressiva e morfologia, minimizzando lo stess ossidativo 2) Indurre in vitro la CAPACITAZIONE. Si tratta della fase finale di maturazione dello spermatozoo che così: acquista la capacità di interagire con il complesso cumulo-ovocita, subisce la reazione acrosomiale e diventa potenzialmente in grado di fecondare gli ovociti. 3) Separare gli spermatozoi dal plasma seminale perché: - dopo l eiaculazione diviene citotossico per un rapido aumento della osmolarità (Aitken et al., 1996) - contiene fattori decapacitanti (Yanagimachi,1994) - contiene fattori la cui prolungata esposizione ha avversi effetti sulla funzionalità spermatica quali la penetrazione del muco cervicale (Kremer,1968), la reazione acrosomiale in vitro e il processo di fecondazione (Roger, 1983; Mortimer 1992 e 1998)

5 . L ideale tecnica di separazione spermatica dovrebbe : -Essere facile, veloce e con costi contenuti; -Isolare il più alto numero di spermatozoi mobili possibili; -Non causare danno o alterazione fisiologica agli spermatozoi separati; -Eliminare spermatozoi non vitali, leucociti e batteri; -Permettere di processare il più grande volume di eiaculato Nessun metodo disponibile soddisfa tutte queste esigenze, quindi la scelta della tecnica di preparazione del seme è dettata dalla qualità del campione (Canale et al.1994)

6 INDICAZIONI GENERALI AL TRATTAMENTO - La raccolta del campione e l operatività devono avvenire in condizioni sterili. - Medium di coltura impiegato deve contenere: soluzione salina addizionata con proteine (albumina altamente purificata ) e un appropriato tampone per mantenere costanti le condizioni di ph in cui gli spermatozoi sono processati Se l incubatore contiene solo aria atmosferica alla temperatura di 37 C il medium è tamponato con Hepes e il tappo del contenitore deve essere ben chiuso Se l incubatore contiene 5% (v/v) di CO2 in aria ad una temperatura di 37 C il medium deve essere tamponato con bicarbonato di sodio e il tappo del tubo mantenuto semiaperto per garantire scambio di gas - Come regola generale le tecniche di preparazione spermatica non possono essere considerate valide per una totale eliminazione degli agenti infettivi quindi è indispensabile trattare sempre il campione come potenzialmente infetto!!

7 L efficienza della tecnica di separazione spermatica (WHO 2010) è espressa come: - numero assoluto di spermatozoi - numero totale di spermatozoi mobili - recupero di spermatozoi mobili con morfologia normale.

8 FLUIDIFICAZIONE DEL CAMPIONE Il campione subito dopo la raccolta viene lasciato fluidificare in vitro per 30 minuti a temperatura ambiente o a 37 C in lenta agitazione. Se non liquefa si procede con un ulteriore incubazione di 30 minuti nelle medesime condizioni Quando la viscosità del campione è persistente si può intervenire: -miscelando il seme con ugual volume di terreno di coltura -forzare il liquido viscoso attraverso un ago dal diametro interno di 0.84mm prima e di 0.69 mm poi, collegato ad una siringa. -trattare con enzimi proteolitici. Il manuale propone di preparare una soluzione 10 IU/ml di Bromelina in tampone fosfato Dulbecco" da diluire 1:2 con il liquido seminale e di incubare per 10 minuti a 37 C. Altri enzimi descritti dalla letteratura sono: -amilasi -chimotripsima, lisozima, ialuronidasi, tripsina, (Figenschau et al., 1998). E importante rimuovere gli enzimi con lavaggi non appena ottenuta la fluidificazione per evitare danneggiamento degli spermatozoi

9 Si distinguono 4 approcci basici per la preparazione degli spermatozoi: - lavaggio e diluizione - migrazione: requisito fondamentale è il movimento autonomo degli spermatozoi (swim-up, migrazione-sedimentazione) - centrifugazione in gradiente di densità: sfrutta l alta densità degli spermatozoi da separare e l azione di filtro esercitata dagli strati di particelle silice colloidale modificata impiegata per la separazione - metodi di aderenza: si basa sull aderenza dei detriti cellulari e dei leucociti da eliminare ad una matrice di filtrazione (fibre di lana di vetro, colonne di Sephadex, membrana, biglie di vetro).

10 DILUIZIONE e LAVAGGIO Consiste nella diluizione del seme con il terreno di coltura e successiva centrifugazione; il manuale WHO ne indica l impiego per trattare campioni normospermici destinati alla inseminazioni intrauterine (IUI). Procedura: -aggiungere all intero campione un uguale volume di medium per la diluizione del plasma seminale -trasferire in tubi da centrifuga (non più di 3 ml per tubo) -centrifugare a g per 5-10 minuti -aspirare ed eliminare il surnatante -risospendere con 1 ml di medium e pipettare gentilmente -centrifugare ancora a g per 3-5 minuti -aspirare ed eliminare il surnatante -risospendere il pellet, pipettando gentilmente in un volume di medium appropriato per il finale utilizzo e determinare motilità e concentrazione

11 SWIM-UP Il manuale WHO ne consiglia l impiego per il trattamento del seme di pazienti normospermici Il campione non deve essere diluito e centrifugato. Si procede direttamente con lo swim-up diretto degli spermatozoi dal seme dopo fluidificazione in vitro Procedura: -Miscelare e suddividere il campione in tubi da centrifuga da 15 ml, ponendo circa 1 ml per tubo. -Stratificare delicatamente 1,2 ml di medium sopra il campione -Inclinare il campione con un angolo di 45 e incubare per 1 ora a 37 C -Rimuovere 1 ml di medium dalla superficie (contiene gli spermatozoi più mobili) -Diluire con 1,5-2 ml di medium -Centrifugare a g per 5 minuti ed eliminare il surnatante -Risospendere il pellet in 0.5 ml di medium per valutare concentrazione,motilità, morfologia

12 Esempio di trattamento del seme con Swim-up Produzione del campione Conta Motilità Morfologia t 60 min a 37 C a 45 gradi 5 min 300 g-500g Conta Motilità Morfologia ICSI FIVET IUI s S = seme t = terreno Aggiunta di terreno Raccolta dal sovranatante

13 SWIM-UP Vantaggi: - Facile da eseguire - Poco costoso Svantaggi: - Produce una resa in percentuale di spermatozoi mobili più bassa rispetto alla centrifugazione in gradiente di densità ( Ng et al.,1992) -Ristretto a campioni con alta conta e motilità; -I numerosi strati di cellule impediscono agli spermatozoi mobili situati più in profondità di raggiungere l interfaccia con il medium di coltura; -Significativo decremento della percentuale di spermatozoi con cromatina normalmente condensata.

14 CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA (CGD) Il manuale WHO propone tale tecnica per i casi di oligozoospermia, astenozoospermia o teratozoospermia, poiché si recupera un maggior numero di spermatozoi mobili destinati alla FIVET o alla ICSI Questo metodo consiste nel centrifugare il campione posto al di sopra di un gradiente di densità discontinuo o continuo preparato impiegando silice colloidale legate covalentemente a silano. Gli spermatozoi si separano in base alla loro densità e alla motilità di quella porzione che raggiunge il fondo del tubo. E importante standardizzare la metodica I risultati delle preparazioni spermatiche variano in relazione alle condizioni della separazione: - volume iniziale di seme, - velocità e tempo di centrifugazione, - numero di strati del gradiente

15 Procedura: -Preparare il gradiente di densità sovrapponendo 1 ml di medium con densità al 40% (v/v) ad 1 ml di medium al 80% (v/v). - Aggiungere 1 ml di seme miscelato sopra il gradiente di densità e centrifugare a g per minuti. Preparare più di un tubo se necessario. -Rimuovere la parte superiore del pellet che si è stratificato sul fondo -Risospendere il pellet in 5 ml di medium e centrifugare a 200g per 4-10 minuti -Ripetere la procedura di lavaggio -Risospendere il pellet finale in 1 ml di medium per determinare concentrazione e motilità

16 Esempio di trattamento del seme con gradienti Produzione del campione Conta Motilità Morfologia S min 300g 2 lavaggi Conta Motilità Morfologia ICSI FIVET IUI Gradienti Raccolta dal 80% Mantenere in incubatore

17 CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA (CGD) Vantaggi: -Isolamento di una frazione pulita e abbondante di spermatozoi mobili; -Possono essere isolati spermatozoi mobili da eiaculati con bassa densità spermatica; -Buona eliminazione dei leucociti; -Produzione di ROS significativamente ridotta. Svantaggi: -La creazione di una buona interfase tra i differenti strati richiede tempo, -Più costoso dello swim-up;

18 FILTRAZIONE CON FIBRE DI LANA DI VETRO La separazione è principalmente dovuta all adesione dei detriti cellulari e degli spermatozoi immobili alla superficie di fibre di lana di vetro. (Engel et al., 2001) Filtrazione condotta a 37 C Richiede 5-10 minuti per filtrare l di campione 6 mm (Engel et al., 2001): L efficienza di filtrazione è legata alle caratteristiche del filtro come ad esempio: - Natura chimica della lana di vetro (borati, silicati, quarzo) - Struttura superficiale e carica - Spessore delle fibre e diametro dei pori Da queste caratteristiche dipende anche il possibile rischio di danneggiare gli spermatozoi!!

19 Vantaggi: - Semplicità - Alta resa in spermatozoi mobili, analoga a quella ottenuta dalla CGD, anche applicata nei casi di oligo ed astenozoospermia (Rhemrev et al., 1989; Johnson et al., 1996) - Riduzione del danno ossidativo - Eliminazione dei leucociti al 90% (Sanchez et al., 1997) - Selezione di spermatozoi con normale condensazione della cromatina Svantaggi: - Costoso - Filtrato può contenere detriti cellulari residui - Processo abbastanza lento (favorita la resa!) e che richiede suddivisione del campione

20 Tecniche di preparazione di più recente introduzione per selezionare gli spermatozoi ad alta qualità per la fecondazione assistita -Selezione in base alla carica elettrica -Selezione degli spermatozoi con tecniche di binding: Annessina Acido ialuronico

21 METODO ELETTROFORETICO Si tratta di una filtrazione elettroforetica su membrana che rapidamente e efficacemente isola spermatozoi umani con minimo danno al DNA (Ainsworth et al., 2005). Principio: spermatozoi di migliore qualità nell eiaculato possiedono la maggiore carica netta negativa (Kirchoff and Schroter, 2001; Giuliani et al., 2004; Ainsworth et al. 2005) e possono essere separati dalle altre particelle ugualmente cariche come leucociti e gameti immaturi in virtù del loro piccole dimensioni della testa. Dimostrato che gli spermatozoi così isolati sono ugualmente in grado di fecondare ovociti senza il sostegno della ICSI quindi l esposizione al campo elettrico non altera la loro funzionalità. La % di clivaggio degli zigoti e la qualità degli embrioni sono analoghi a quelli dove gli spermatozoi sono ottenuti da CGD (Fleming et al., 2008)

22 Prototipo sviluppato per questa tecnica: CELL-SORTER 10 (CS-10). Catodo (-) Campione Tampone Camera di iniezione del campione Camera di raccolta del campione (Ainsworth et al., 2005) Anodo (+) L unità di separazione del CS-10 consiste in due camere da 400 l separate da un filtro di policarbonato di 5 m di spessore che appoggia su una membrana di poliacrilammide che permette il libero transito degli elettroliti. Spermatozoi separati dal plasma seminale a 25 C per 5 min applicando una corrente costante di 75mA e un voltaggio variabile da 18 a 21 V Buffer elettroforetico: 10mM Hepes; 30mM NaCl; 0.2M saccarosio; ph 7.4; Osmolarità 310mOsm/Kg.

23 MACS (magnetic activated cell sorting) Metodo di separazione che elimina gli spermatozoi apoptotici Principio: Le cellule apoptotiche espongono dei markers specifici. Uno di questi è il fosfolipide fosfatidilserina (PS) che si ridistribuisce dal lato citosolico al lato esterno della membra plasmatica Si impiegano poi biglie magnetiche coniugate con annessina V che ha una forte affinità per la fosfatidilserina esposta dalle cellule apoptotiche con integrità della membrana compromessa. Il complesso biglia-cellula apoptotica è trattenuto grazie all ausilio di un magnete. L impiego di MACS in combinazione con centrifugazione in gradiente di densità (CGD) per preparare spermatozoi umani è risultato essere superiore in termini di motilità, vitalità e resa di spermatozoi non apoptotici rispetto ad altri metodi di preparazione (Said et al., 2005)

24 MACS Biglie magnetiche Spermatozoi apoptotici Spermatozoi non apoptotici (Said TM et al., 2008) -Incubazione delle microbiglie coniugate ad annessina V con gli spermatozoi a RT per 15 minuti - Far scorrere la miscela attraverso una colonna posta su un supporto magnetico. La frazione di spematozoi che espone PS è ritenute nella colonna mentre gli spermatozoi con membrana plasmatica intatta sono eluiti dalla colonna e raccolti come non apoptotici

25 PRESENZA DI RECETTORI PER L ACIDO IALURONICO (HA) L acido ialuronico (HA) è un polisaccaride lineare presente nella matrice extracellulare del cumulo ooforo attorno all ovocita, con un importante ruolo nella fecondazione umana normale. Principio di questo test : spermatozoo maturo ha subito un rimodellamento della membrana plasmatica, responsabile della formazione dei recettori per la zona pellucida dell ovocita e per i recettori dell HA Spermatozoi maturi che esprimono recettori HA sono vitali e privi di inclusioni citoplasmatiche,frammentazione del DNA, markers apoptotici come caspasi 3 (Cayli S. et al., 2003, Huszar et al., 2003) e presentano una normale frequenza di aneuploidie cromosomiche (Jakab et al. 2005).

26 (Petersen et al. 2010) Incubazione di 2 µl di una preparazione di 2x10 6 spermatozoi per 10 minuti a RT Per individuare gli spermatozoi maturi si sfrutta la loro selettiva capacità di legare HA che aderisce sul fondo di una piastra di coltura. Gli spermatozoi vengono poi raccolti con una pipetta da ICSI e trasferiti in una soluzione di polivinlpirrolidone per eseguire la inseminazione intracitoplasmatica.

27 PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI SEME INFETTI DA HIV I recettori virali (CD4, CCR5, CXCR4) sono espressi solo da cellule non spermatiche: il manuale WHO propone una combinazione di centrifugazione in gradiente di densità e di swim-up per prevenire l infezione nelle coppie HIV sierodiscordanti dove solo il partner maschile è HIV positivo (Gilling-Smith et al. 2006; Savasi et al 2007) Per minimizzare il rischio di cross-contaminazione con i campioni HIV-free, i semi infetti devono essere trattati separatamente nel tempo e nello spazio (Gilling-Smith et al. 2005) Indispensabile la validazione virale mediante RT-PCR del seme processato. Non ci sono ancora sufficienti evidenze di eliminazione del rischio di contagio attraverso la preparazione spermatica!!!

28 TRATTAMENTO DEL CAMPIONE PROVENIENTE DA EIACULAZIONE RETROGRADA L eiaculazione retrograda si verifica quando il liquido seminale, durante l eiaculazione, passa nella vescica invece che nell uretra. Si tenta di recuperare lo sperma da un campione di urina post-eiaculatorio. L urina però induce rapidamente effetti deleteri sugli spermatozoi, con una riduzione della motilità legata alla diminuzione di ph e ancor più, alla riduzione della osmolarità (Crich and Jequier, 1978) Per l aggiustamento dei parametri urinari e il recupero di spermatozoi mobili è raccomandato ingerire agenti alcalinizzanti come NaHCO3 (Urry, 1986) o una soluzione di NaCl e di NaHCO3 (Aust et al., 2008). Tuttavia non esiste un metodo ottimale per ottenere il controllo del ph ed dell osmolarità

29 La procedura prevede di chiedere al paziente: - di non svuotare completamente la vescica; - tentare di produrre l eiaculato e raccogliere l eventuale prodotto in un primo contenitore sterile; - urinare nuovamente e raccogliere l urina in un secondo contenitore con terreno di coltura (per alcalinizzare ulteriormente il campione). suddividere il campione e sottoporlo a centrifugazione per 8 minuti a 500g risospendere il pellet in 3-4-ml di medium fresco Sia l eiaculato, se prodotto, che il campione di urina devono essere analizzati Entrambe i campioni vengono processati con centrifugazione in gradiente di densità (CGD) Pazienti con disturbi eiaculatori che devono essere sottoposti ad una elettro-stimolazione rettale della prostata, producono spermatozoi con scarsa motilità e quindi si trattano con la CGD

30 EFFETTI DELLE SPECIE REATTIVE ALL OSSIGENO (ROS) Produzione dei ROS Leucociti del plasma seminale(aikten and West 1999 ) Forze associate con la centrifugazione durante il trattamento del seme (Aitken and Clarkson 1988) Nelle procedure di trattamento anche finalizzato alla crioconservazione, proposto di non eliminare il plasma seminale

31 Trattamento del seme : perdita degli antiossidanti naturali presenti nel plasma seminale (vitamina C ed E, superossido dismutasi (SOD), ac,urico, glutatione) Spermatozoi vulnerabili allo stress ossidativo 1) NO citoplasma = NO meccanismi di riparo del DNA danneggiato 2) Molti acidi grassi polinsaturi = suscettibilità ai ROS Danno Integrità del DNA compromessa (Aitken and Clarkson 1988) Integrità delle membrane plasmatiche compromessa

32 Per limitare i danni ossidativi, proposto trattamento sia in vivo che in vitro con differenti antiossidanti Glutatione ( -L-glutamil-L-cistenilglicina): agente ad effetto riducente dove il ruolo nella difesa antiossidante è legato al gruppo sulfidrilico. Dimostrato il suo ruolo nel ridurre la produzione di ROS e nel proteggere gli spermatozoi dal danno indotto al DNA da H 2 O 2 (Donnelly,2000). N-acetil-L-cisteina (NAC) è un N acetil derivato dell aminoacido cisteina, che promuove la produzione endogena di glutatione. Ha un effetto dose e tempo dipendente sulla riduzione nella produzione dei ROS (Oeda 1997). E stata dimostrata è la sua azione benefica sui parametri seminali e nel migliorare la capacità totale antiossidante del siero dopo somministrazione orale in pazienti infertili (Ciftci H et al. 2009). Ascorbato (vitamina C) e Alfa Tocoferolo (vitamina E): separatamente hanno benefici effetti sulla integrità del DNA alterata dal processo di preparazione dello sperma con gradiente (Hughes 1998). Non visto miglioramento nella motilità spermatica né con ascorbato né con vitamina E ma solo una significativa riduzione nella produzione dei ROS. Rilevato invece danno al DNA indotto dal simultaneo impiego delle due vitamine durante il trattamento del campione(donnelly,1999).

33 TRATTAMENTI DEGLI SPERMATOZOI IN VITRO PER MIGLIORARE LA MOTILITA - Metilxantina caffeina : è un inibitore delle fosfodiesterasi che aumenta i livelli di camp. La motilità di spermatozoi freschi e scongelati aumenta per stimolazione del metabolismo glucidico (Homonnai et al.,1976; Rees et al.,1990). - Pentossifillina: è un metilxantina derivato, inibitore non specifico delle fosfodiesterasi con effetto stimolatorio sulla motilità attribuibile all aumento di camp. camp stimola una chinasi camp dipendente che induce la fosforilazione di proteine della coda degli spermatozoi (Nassar et al.,1999). Effetti benefici sulla motilità di spermatozoi freschi (Yovich et al.,1990;tesarik et al.,1992; Paul et al.,1995) e crioconservati (Stanic et al.,2002). Risultati contrastanti perche riportati anche effetti tossici sugli spermatozoi (Centola et al.,1995) e una possibile embriotossicità sull embrione di topo (Tournaye et al., 1993) - 2-Deossiadenosina (2-DA) - Callicreina - Bicarbonato - Metallo Chelatori -Platelet-Activating Factor (PAF)