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1 CONGRESSO NAZIONALE Legionella e Legionellosi: mito e realtà Ferrara, 28 Settembre 2012 Analisi e campionamento per il controllo ambientale della Legionella Maria Antonietta Bucci Sabattini ARPA Emilia-Romagna Sezione

2 Linee Guida recanti indicazioni ai Laboratori con attività di diagnosi microbiologica e controllo ambientale della legionellosi. (G.U. N. 29 del 05/02/2005) La ricerca di Legionella nei campioni clinici e ambientali è fondamentale per il controllo della Legionellosi. Hanno l obiettivo di organizzare e orientare le attività dei laboratori nel settore della diagnostica della legionellosi e del controllo ambientale di Legionella spp; è rivolto agli Operatori di Sanità Pubblica, ai Microbiologi laboratoristi ed a tutto il personale comunque coinvolto nel controllo della legionellosi in Italia. I laboratori con attività di diagnosi e di controllo ambientale per Legionella si organizzano in tre livelli gerarchici,, con ordine crescente di responsabilità diagnostica, attività e strutture: 1) Laboratori di base; 2) Laboratori regionali di riferimento; 3) Laboratorio nazionale di riferimento. (ISS-Roma c/o Dipartimento Malattie Infettive Parassitarie ed Immunomediate)

3 Compiti dei Laboratori Regionali di Riferimento. I Laboratori regionali di riferimento, che devono essere individuati da ciascuna Regione, costituiscono un punto di riferimento per i laboratori di base, ed operano in stretta collaborazione con il Laboratorio Nazionale di Riferimento. Intervengono sempre in caso di cluster ed inviano i ceppi di Legionelle isolati dai campioni ambientali al Laboratorio Nazionale di Riferimento. Essi utilizzano metodiche aggiornate e validate, per poter confrontare i risultati con i Laboratori degli altri Paesi membri della Comunità europea. Devono disporre di idonei locali, attrezzature e personale qualificato. Rappresentano la base della piramide funzionale della rete di sorveglianza della legionellosi. Essi sono distribuiti in tutto il territorio nazionale ed eseguono il primo, rapido intervento qualora si verifichino casi di infezione da Legionella, in ospedali, alberghi o in qualsiasi altra struttura recettiva. Sono presenti nelle Arpa regionali, o presso i Laboratori di Sanità pubblica o nelle Università.

4 Laboratori di ARPA-ER per il controllo della Legionellosi Laboratori di Riferimento Regionale: Laboratorio Integrato Laboratori Integrato di Reggio Emilia Laboratorio di base: Laboratorio Integrato di Ferrara I Laboratori ARPA-ER sono tutti accreditati ai sensi della Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 e sono inseriti in un sistema di Rete Laboratoristica integrata. Arpa-ER effettua ricerca di Legionella spp. su campioni ambientali dagli anni 90 ed il metodo per la ricerca di Legionella spp. è accreditato dal 2000.

5 Analisi La tecnica di elezione per la ricerca di Legionella in campioni ambientali è quella colturale. Si fa riferimento a: Linee guida per la prevenzione e controllo della legionellosi G.U. N.103 del 2000 (All. 2 e All.3), Norma ISO 11731:1998 Water quality- Detection and enumeration of Legionella, Norma ISO :2004 Water quality-detection and enumeration of Legionella - Parte 2: Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts. Il metodo prevede un procedimento analitico in varie fasi: 1. Preparazione 2. Arricchimento (decontaminazione) 3. Semina su idonei terreni di coltura ed incubazione 4. Lettura ed identificazione presuntiva 5. Identificazione definitiva ed espressione del risultato

6 TIPOLOGIA CAMPIONE Acqua Depositi Incrostazioni Biofilm Filtri da impianti di climatizzazione Aria (bioareosol) Terreno

7 Preparazione del campione Acqua: Concentrazione del campione con filtrazione del campione attraverso membrane filtranti in nylon o policarbonato, con porosità di 0,22 µm. Eluizione del concentrato: porre la membrana in un backer e raschiare tutta la superficie con spatole o cell scraper più volte per staccare i batteri adesi oppure risospendendere il concentrato aiutandosi con un vortex o in un bagno ad ultrasuoni.

8 Preparazione del campione Altre Matrici: Depositi o sedimenti. Effettuare diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2 ) con acqua distillata sterile o soluzione Ringer e agitare bene. Incrostazioni. Frantumare e triturare le incrostazioni in mortaio o mixer sterili. Risospendere in acqua distillata sterile o soluzione Ringer. Biofilm (su tampone). Agitare vigorosamente il tampone nella provetta, contenente alcuni ml di acqua distillata sterile o soluzione Ringer, per rimuovere il materiale raccolto. Filtri - Lavare il filtro o parte di esso in opportuna quantità di acqua distillata sterile o soluzione di Ringer, filtrare il campione di acqua di lavaggio e procedere come per i campioni di acqua. Terreno - 5 g di campione stemperato in 50 ml di acqua distillata sterile, filtrare attraverso garza sterile e predisporre aliquote diluite in acqua distillata sterile. Hindawi Publishing Corporation -International Journal of Microbiology, Volume 2012, Article ID , 4 pages doi: /2012/218791

9 Trattamento di decontaminazione Importante fase per ridurre la flora batterica concomitante Il concentrato del campione preparato precedentemente viene suddiviso in tre aliquote, di cui due da utilizzare dopo il trattamento ed una da utilizzare tal quale. Trattamento al calore: porre un aliquota in bagnomaria a 50 ± 1 C per 30 minuti. (permette di eliminare i batteri resistenti al calore e agli antibiotici presenti nei terreni selettivi) Trattamento acido: miscelare il campione, in rapporto 1:1, con una soluzione acida a ph 2,2 (HCl+ KCl ) e lasciare a temperatura ambiente per 5 minuti, centrifugare prima della semina. (permette il recupero di specie di Legionelle sensibili al calore e permette la lisi di eventuali amebe presenti con un maggior recupero) Le tre aliquote: non trattata, trattata al calore e trattata con acido, sono a pronte per la semina in terreno colturale selettivo.

10 Semina su terreni colturali e incubazione Legionella è un microrganismo esigente per crescere in vitro ha bisogno di terreni agarizzati contenenti carbone attivo (charcoal) ed estratto di lievito (CYE Agar base). Inoltre ha necessità di supplementi di crescita quali: tampone ACES/idrossido di potassio, pirofosfato ferrico, L-cisteina cloridrato, α-chetoglutarato (BCYE-α). Infine come supplemento selettivo per l isolamento si usano: MWY supplemento selettivo: glicina, vancomicina, polimixina B, anisomicina, blu di bromotimolo, porpora bromocresolo. GVPC supplemento selettivo: glicina, vancomicina, polimixina B, cicloeximide. La glicina indebolisce la parete cellulare favorendo l azione degli Antibiotici. Polimixina B inibisce i batteri Gram. Vancomicina inibisce i batteri Gram +. Anisomicina contenuta in MWY ha azione inibitoria sui lieviti. Cicloeximide contenuto nel GVPC è un antifungino.

11 Semina su terreni colturali e incubazione Acqua: semina delle tre aliquote sui terreni di coltura in: frazioni da 0,1 a 0,5 ml, inoculate su piastre di terreno di coltura selettivo MWY o GVPC distribuendo sulla superficie in maniera omogenea con una spatola sterile. Depositi o Sedimenti: effettuare la semina su terreno selettivo il campione tal quale e diluito. Incrostazioni-Biofilm-Filtri: effettuare la semina su terreno selettivo come descritto per le matrici acquose. Incubare le piastre in termostato a 37±1 C: con atmosfera arricchita al 2,5% di CO 2 e in ambiente umido o in giara in microarofilia e in ambiente umido. Tempo di incubazione: non meno di 10gg.

12 Lettura ed identificazione presuntiva Sezione Osservazione a occhio nudo o osservazione allo stereomicroscopiodopo Le colonie di Legionella in genere non crescono prima di 3 gg. di incubazione su terreno selettivo. Aspetto: si presentano di piccole dimensioni, di colore biancogrigio, leggermente convesse, con margini regolari e, quando osservate allo stereomicroscopio con luce a bassa intensità, soprattutto evidenziano il tipico aspetto a vetro smerigliato.

13 Lettura ed identificazione presuntiva Sezione Osservazione a occhio nudo o osservazione allo stereomicroscopiodopo La lettura va eseguita ad intervalli di 2-3 gg, fino al decimo giorno di incubazione. Le colonie con queste caratteristiche sono considerate sospette e vanno trasferite (almeno 3) sia su CYE agar base, sia su BCYE-α con supplemento (L-cisteina e ferro) per la crescita differenziale, incubandole per 48 h a 37±1 C. La presenza di crescita sul terreno con L-cisteina e l assenza di crescita sul terreno colturale che ne è privo consentono di identificare il microrganismo isolato come: LEGIONELLA PRESUNTA Eccezione per Legionella oakridgensis e L. spiritensis.

14 Lettura ed identificazione presuntiva Le colonie sospette possono essere osservate sotto la lampada di WOOD a 360 nm e le Legionelle formano colonie che possono presentare: fluorescenza bluastra L. bozemanii, L. gormanii,l. dumoffii, L. anisa, L. cherrii, L. steigerwartii,l. gratiana, L. tucsoniensise, L. parisiensis, fluorescenza rossastra L. Rubrilucens e L. erytra non sono fluorescenti L. pneumophila e L. micdadei Le colonie sospette posso essere sottoposte a colorazione di Gram. Altri test biochimici possono essere eseguiti, ma sono poco utili a causa della bassa attività metabolica.

15 Identificazione definitiva La identificazione viene fatta su base antigenica. Le colonie di Legionella presunta sono testate con reagenti al latex che consentono di rilevare le specie più frequenti e di interesse clinico: Legionella pneumophila SG 1; Legionella pneumophila SG (2-14 e/o 2-15) pool di antisieri; Legionella species pool di 7 specie (L. longbeachae 1 e 2, L. bozemanii 1 e 2, L. dumoffii, L.gormanii, L. jordanis, L.micdadei, L. anisa e/o L. feeleii).

16 Identificazione definitiva La identificazione viene fatta su base antigenica. Un ulteriore identificazione viene effettuata con sieri singoli, tramite sieroagglutinazione su vetrino: Legionella pneumophila SG da 1 a 15 Legionella micdadei, Legionella gormanii, Legionella bozemani, Legionella dumoffii, Legionella anisa

17 Espressione del risultato ACQUA Il numero totale di Legionelle viene stimato sulla base del conteggio effettuato sulle piastre che presentano il maggior numero di colonie ascrivibili a Legionella spp., ottenuto dai vari trattamenti (Tr. tal quale, Tr. calore, Tr. acido). Calcolo del numero totale (Cs) di legionelle presenti: Cs = (X / V tot) Vs Secondo ISO 8199:2005 (E) X = è il conteggio delle colonie confermate come positive effettuato sulla piastra che presenta il maggior numero di colonie ascrivibili a Legionella spp. Vs = è il volume di riferimento scelto per esprimere la concentrazione dei microrganismi nel campione, pari a 10 ml. Vtot = è il volume totale del campione inoculato sulla piastra conteggiata (campione originale o sua diluizione), ovvero pari a 0,2 ml d i (*) (*) d 1, d 2,., d i = è la diluizione usata per il volume analizzato (d = 1 per il campione non diluito, d = 0,1 per una diluizione di dieci volte, ecc.) Il risultato ottenuto corrisponde al numero di Legionella spp. presenti nel volume di riferimento del campione in esame. In funzione dei litri di acqua concentrati, il valore numerico viene espresso in UFC/L.

18 Espressione del risultato ACQUA (UFC/L) Legionella spp. (con la sua concentrazione) e indicazione della specie di Legionella se identificata Legionella pneumophila (con la sua concentrazione) e con il sierogruppo individuato; Legionella spp. presunta (con la sua concentrazione) quando le colonie presunte isolate non hanno risposto positivamente alle prove sierologiche. Se in tutte le piastre non vengono riscontrate colonie o non vengono confermate le eventuali colonie sospette, il risultato, applicando l algoritmo precedente va espresso come: Legionella spp < 10 UFC./L nel caso di un volume di campione concentrato pari a 5 litri. Legionella spp < 50 UFC./L nel caso di un volume di campione concentrato pari a 1 litro.

19 Espressione del risultato Sezione ALTRE MATRICI Campioni di DEPOSITI, INCROSTAZIONI, BIOFILM, FILTRI: Rilevata e indicazione della Specie isolata e del Sierogruppo individuato, Non Rilevata. Campioni di ARIA: Numero di Unità Formanti Colonie per metro cubo di campione (UFC/m 3 ) e Indicazione della Specie isolata e del Sierogruppo individuato. Legionella spp < 1 UFC/m 3

20 Diagnosi molecolare mediante PCR di Legionella spp. Riconoscimento qualitativo in PCR nested Sequenza bersaglio: rdna 16S Ottima sequenza bersaglio per il riconoscimento di Legionella spp. rdna 16S Il gene 16S è un gene altamente conservato Tutti gli appartenenti al genere Legionella hanno un alta omologia sul 16S Codifica per un RNA ribosomiale E presente in più copie nel genoma di un batterio. 200 bp 150 bp PM PM

21 Indagine ambientale Obiettivo ricercare la potenziale sorgente di contaminazione sulla base dei risultati dell indagine epidemiologica o a scopo di valutazione del rischio. Finalità delle indagini ambientali sono: Risalire alla sorgente d infezione dove si siano verificati uno o più casi di malattia (a seguito di una indagine epidemiologica). Accertare l esistenza del rischio di infezione e valutarne l entità (a scopo di prevenzione).

22 Indagine ambientale Risalire alla sorgente d infezione Deve essere svolta in tutte le probabili fonti espositive individuate, (compresa la residenza abitativa). L ispezionedeve essere eseguita in presenza di chi conosce gli impianti e deve permettere di individuare le criticità e di raccogliere informazioni sugli impianti presenti ai fini del campionamento.

23 Indagine ambientale Verificare: per la rete distributiva dell acqua calda sanitaria: presenza di serbatoi di accumulo, il circuito distributivo, i terminali di distribuzione; per la rete distributiva dell acqua fredda: fonte di approvvigionamento dell acqua, presenza di impianti per il trattamento dell acqua, temperatura dell acqua e, nel caso questa sia > 20 C, le possibili cause; per l impianto di condizionamento dell aria: localizzazione delle prese d aria esterne rispetto a possibili fonti di inquinamento, periodicità operazioni di pulizia/sostituzione dei filtri, il sistema di umidificazione, presenza di acqua stagnante a livello delle batterie di raffreddamento, stato di pulizia dei silenziatori, la presenza di condensa lungo i condotti; per le torri di raffreddamento e condensatori evaporativi: l ubicazione, presenza di ristagni d acqua, periodicità delle pulizie, gli esiti degli accertamenti analitici di controllo; per le piscine e piscine idromassaggio: modalità dei trattamenti di disinfezione, frequenza dei ricambi e quantità di acqua sostituita giornalmente; per le fontane ornamentali: modalità dei trattamenti di disinfezione, in particolare nelle fontane ubicate all interno di strutture.

24 Il Campionamento Il campionamento ambientale consente la raccolta di porzioni il più rappresentative di una matrice che si vuole sottoporre ad analisi. Le modalità di campionamento e la sua corretta esecuzione condizionano in modo determinante le successive procedure del controllo analitico. Il campionamento per la ricerca ambientale di Legionella deve essere eseguito da personale esperto e formato sul rischio Legionella. Il campionamento è di tipo microbiologico e devono essere noti, agli operatori che lo eseguono, i concetti base della sterilità.

25 Dispositivi di Protezione Individuale Gli operatori, prima di accingersi ad eseguire operazioni di ispezione e/o campionamento, durante le quali sia possibile l esposizione ad aerosols, che potrebbero essere contaminati da Legionella, devono indossare i Dispositivi di Protezione Individuale (DPI), in particolare per la protezione delle vie respiratorie. Maschere filtranti con valvola di espirazione del tipo FFP2 o FFP3, Occhiali protettivi, Guanti.

26 Campionamento Quando Dove Cosa e Come

27 Documento del Linee Guida per la prevenzione e il controllo della legionellosi. Campionamento: (G.U. n. 103 del 05/05/2000) Quando 1) Presenza di un caso isolato o di 2 o più casi raggruppati e confermati In Comunità/ / in Ospedali - Case di Cura Campioni ambientali In tutte le strutture individuate come probabile fonte di infezione 2) Assenza di casi: in Comunità in Ospedali Analisi del rischio per rispondere alle domande: Può proliferare? Può diffondere? (fonti di aerosol). Sorveglianza ambientale con campionamento per controllo Reparti ad Alto Rischio

28 Provvedimento del Linee Guida recanti indicazioni sulla Legionellosi per i gestori di strutture turistico - ricettive e termali. Quando (G.U. n. 28 del 05/02/2005) Introducono elementi di giudizio per la valutazione del rischio di legionellosi e norme da applicare per ridurre al minimo tale rischio. Per assicurare una riduzione del rischio di Legionellosi, lo strumento fondamentale non e' il controllo di laboratorio routinario dell impianto idrico, ma l'adozione di misure preventive, basate su analisi del rischio costantemente aggiornata (rev. ogni 2 anni).

29 Provvedimento del Linee Guida recanti indicazioni sulla Legionellosi per i gestori di strutture turistico - ricettive e termali. (G.U. n. 28 del 05/02/2005) Quando Valutata presenza di rischio di Legionellosi in strutture turistico-recettive. Effettuare campionamenti dalla rete di distribuzione dell acqua fredda e calda. Esito negativo Per strutture con funzionamento temporaneo sempre campionamento prima della riapertura stagionale della struttura. Ripetere campionamento secondo quanto previsto nell analisi del rischio..

30 Provvedimento del Linee Guida recanti indicazioni sulla Legionellosi per i gestori di strutture turistico - ricettive e termali. (G.U. n. 28 del 05/02/2005) Quando Valutata presenza di rischio di Legionellosi in Impianti Termali Effettuare campionamenti dalla rete di distribuzione dell acqua termale. Esito negativo Prima della ripresa della attività. Ripetere campionamento ogni sei mesi.

31 Provvedimento del Linee Guida recanti indicazioni sulla Legionellosi per i gestori di strutture turistico - ricettive e termali. (G.U. n. 28 del 05/02/2005) Quando In presenza di casi singoli o di cluster di casi di Legionellosi Effettuare campionamenti dalla rete di distribuzione dell acqua in un numero proporzionale alle dimensioni dell impianto Esito positivo Ripetere subito dopo bonifica. Esito negativo Ripetere campionamento ogni giorni Ripetere campionamento ogni tre mesi. Ripetere campionamento ogni sei mesi

32 Campionamento Quando Dove Cosa e Come

33 Campionamento Quindi Dove E necessario effettuare un campionamento dell acqua per la ricerca della Legionella soprattutto nell ambiente idrico artificiale (impianti idraulici, torri evaporative, vasche idromassaggi, apparecchiature mediche per la respirazione, apparecchiature in stabilimenti termali, ecc.) limitando i prelievi ai punti che maggiormente possono essere critici in base alla struttura dell impianto. Il campione deve essere rappresentativo Dall Indagine ambientale Sono definiti i Punti di Campionamento

34 Campionamento Sezione LINEE GUIDA REGIONALI DGR 21 luglio 2008 n 1115 Approvazione Linee guida regionali per la sorveglianza e il controllo della Legionellosi BUR n 147 del 22 agosto 2008 I punti di campionamento più rappresentativi e da cui non si può prescindere per la valutazione della contaminazione di un impianto idrico in una struttura sono: 1) collettore di uscita dell acqua calda sanitaria dal serbatoio o dal bollitore (collettore normalmente indicato con il termine mandata ). Il prelievo sulla mandata deve essere effettuato prima di ogni eventuale miscelazione 2) collettore di ritorno dell acqua calda sanitaria (collettore normalmente indicato con il termine ricircolo ); segue

35 segue Sezione 3) fondo dei serbatoi di accumulo e degli scaldacqua anche elettrici; in tali serbatoi si possono depositare masse consistenti di calcare all interno delle quali la temperatura dell acqua è relativamente più bassa e conseguentemente viene favorita la nidificazione e la proliferazione della Legionella; 4) tratti particolari delle tubazioni secondarie poco utilizzate o tratti terminali non connessi a sistemi di ricircolo (detti rami morti). In questi tratti di tubazione è possibile la formazione di un consistente strato di biofilm nel quale può nidificare e proliferare la Legionella; se questi punti di erogazione sono poco usati è consigliabile eliminarli o vietarne l accesso alla utenza; 5) punti di erogazione più vicini e più distali rispetto al sistema di produzione dell acqua calda sanitaria: soffioni delle docce e/o doccette di vasche da bagno ovvero da rubinetti di lavabo, sistemi rompigetto, tubi in gomma con doccia a telefono, aeratori, ugelli.

36 I punti più lontani dalla produzione di acqua calda o in cui l acqua non arriva a temperatura elevata, per problemi impiantistici, vengono individuati mediante un monitoraggio della temperatura di distribuzione dell acqua calda su tutto l impianto. Altri punti di prelievo possibili sono: 6. acqua di umidificazione, di condensa e acqua di sifoni ed altre 7. parti degli impianti per l aria condizionata (filtri o parti di essi); 8. acqua in entrata e in uscita dagli addolcitori; 9. acqua proveniente da sgocciolamento dalle torri di raffreddamento; 10. acqua della vasca di raccolta delle torri di raffreddamento (makeup water, reintegro a galleggiante); 10. serbatoi di accumulo dell acqua fredda; 11. riuniti odontoiatrici; 12. fontane decorative.

37 Campionamento Dove Nelle strutture termali, le apparecchiature per le cure presentano possibilità di rischio di trasmissione legionellosi cure inalatorie (inalazioni, aerosol humages, nebulizzazioni, docce nasali), sia per le caratteristiche delle apparecchiature utilizzate che per la tipologia degli utenti (soggetti a rischio per patologie croniche dell apparato respiratorio), bagni con idromassaggio, docce d annettamento (se previste).

38 Campionamento Quando Dove Cosa e Come

39 TIPOLOGIA CAMPIONE Sezione Acqua del circuito dell acqua calda e/o di quello dell acqua fredda delle reti idriche. Acqua termale. Acqua delle fontane decorative. Acqua di condensa e/o acqua dei sifoni ed altre parti degli impianti per l aria condizionata e di umidificazione. Acqua proveniente da gocciolamento dalle torri di raffreddamento Acqua proveniente da apparecchiature mediche (es. per la respirazione assistita e dei circuiti del riunito in studi odontoiatrici). Depositi (cosiddetti "fanghi) da serbatoi e altri punti di raccolta dell acqua. Incrostazioni da tubature e serbatoi delle reti idriche. Biofilm e altro materiale adeso alle pareti di tubature, all'interno del bulbo delle docce, alla parte terminale di rubinetti e di filtri rompigetto. Filtri da impianti di climatizzazione e/o acqua di raccolta dopo lavaggio filtri. Aria (bioareosol) da ambienti confinati e non. Terreno in particolare terriccio umido presente in serre o giardini.

40 Strumenti da utilizzare per il campionamento Sezione Bottiglie in vetro scuro o in plastica monouso da litri 1, sterili senza o con soluzione di tiosolfato allo 0,01 % sul volume; taniche in plastica da 1 o 5 litri, sterili senza o con soluzione di tiosolfato allo 0,01% sul volume; tamponi sterili in provette con acqua distillata sterile o vuoti; pipette sterili e/o siringhe sterili; recipienti in plastica monouso sterili da ml; pinze in acciaio, spatole in acciaio, imbuti in acciaio o in materiale plastico sterilizzati; provette contenenti acqua deionizzata sterile; buste di plastica sterili di dimensioni variabili (es. tipo prestochiuso); termometro (es. digitale con sonda con sensibilità 0,1 C); disinfettante (etanolo o propnolo al 70% v/v, ipoclorito di sodio al 10%); flabatore portatile; macchina fotografica per memorizzare situazioni particolari.

41 Contenitori e Strumenti per il campionamento

42 Prelievo di ACQUA Sezione Come eseguire i campioni di acqua dalla rete idrica di distribuzione Pre-flush : un prelievo effettuato dal rubinetto appena aperto, senza scorrimento dell acqua e senza flambatura. Questo campionamento può essere indicativo della contaminazione di quel tratto terminale della rete di distribuzione. Post-flush : un prelievo dopo aver allontanato parti mobili (es. rompigetto), pulito meccanicamente il punto di sbocco, flambato esternamente e aver fatto scorrere l acqua l per almeno minuti. Questo campionamento può essere indicativo di una colonizzazione all interno della rete di distribuzione.

43 Prelievo di ACQUA Sezione Volume di acqua da prelevare e contenitori Almeno 1 litro in bottiglie/taniche in vetro o in materiale monouso sterili con presenza di tiosolfato di sodio a (0,01%); in alcuni casi, in funzione della sensibilità della risposta quantitativa, fino a 5 litri. Rilevare la temperatura dell acqua a fine prelievo

44 Come campionare Casi particolari Depositi di limo o sedimenti Prelevare dallo scarico delle eventuali vasche di raccolta, dal fondo degli accumulatori d acqua calda, oppure dal fondo di vasche di raccolta di acqua, dopo avere eliminato l'acqua dall'alto. Contenitori. Raccogliere il campione in contenitori sterili di vetro o in plastica monouso.

45 Come campionare Casi particolari Incrostazioni Prelevare in modo asettico da tubature, parte terminali degli erogatori e serbatoi staccando meccanicamente il materiale depositatosi all'interno con l aiuto di spatole metalliche sterilizzate al calore. Raccogliere in recipienti sterili di idonee dimensioni contenenti qualche ml di acqua distillata sterile, o acqua della rete; altrimenti consegnare al laboratorio le parti intere che si possono rimuovere, avendo cura di lasciare all interno l acqua d origine, trasferendo in sacchetti sterili (tipo presto-chiuso).

46 Come campionare Casi particolari Prelievo di biofilm Raccogliere con un tampone sterile il materiale depositato sulle superfici interne di tubature, rubinetti, rompigetto, interno dei soffioni delle docce, serbatoi, ecc. con movimenti rotatori e ripetuti. Il biofilm deve essere prelevato prima della matrice acquosa (se si opera sullo stesso punto di campionamento). Contenitori: Mettere il tampone in provetta contenente una piccola quantità (2 ml - 10 ml) di acqua distillata sterile o acqua dell impianto.

47 Come campionare Prelievo di filtri Casi particolari Effettuare il controllo su filtri degli impianti di di raffreddamento utilizzati da diverso tempo e non su quelli lavati o sostituiti di recente. Contenitori e modalità: Prelevare parte del filtro e metterlo in un sacchetto di materiale plastico. Effettuare un lavaggio del filtro secondo le seguenti modalità: immersione di tutto il filtro, per almeno 24 ore, in acqua distillata sterile, in quantità da garantire la completa imbibizione del filtro, accogliere l acqua di lavaggio in contenitori sterili, senza tiosolfato.

48 Come campionare aria (bioareosol) Prelievo dell aria in ambienti confinati e non Casi particolari Si effettua mediante campionamento attivo utilizzando collettori ad impatto su supporti contenenti terreni di coltura agarizzati selettivi per la ricerca di Legionella spp. Il campionatore va posizionato ad una distanza di circa 30 cm dal punto che si deve controllare (es. bocchette emissione aria) ed il volume da prelevare, in funzione delle finalità dell analisi, può arrivare fino a 1000 litri d aria (1 m 3 ). Modalità e conservazione: I supporti contenenti terreni di coltura agarizzati selettivi per la ricerca di Legionella spp. prima del campionamento vanno conservati tra 2 C e 8 C e riportati, per quanto possibile, a temperatura ambiente prima del loro utilizzo.

49 Torre di raffreddamento Struttura dove può verificarsi una successione di eventi che possono portare alla insorgenza di Legionellosi. 1. Prelevare l acqua che permanere nella torre (anche in condizioni di stagnazione) possibilemnte al centro della vasca, con una bottiglia incartata. La torre produce una dispersione di goccioline d acqua nella corrente d aria, che per diversi motivi (incompleta vaporazione, inefficienza dei separatori di gocce) potrebbe trascinarsi fuori dalla torre e ritrovarsi nel pennacchio. Casi particolari Nella circostanza in cui, a seguito di evento epidemico si ritenga utile valutare la dispersione dell aerosol prodotto dalla torre di raffreddamento: 2. Prelevare campioni di aria in punti individuati nelle vicinanze della torre evaporativa.

50 Casi particolari Condensatori evaporativi Acqua di condensa : prelevarne la massima quantità possibile con siringhe o pipette sterili; metterla in appositi contenitori sterili di vetro o plastica monouso.

51 Trasporto Sezione Una volta prelevati i campioni di acqua, biofilm, limo-depositi, incrostazioni, filtri, devono essere trasportati in: contenitori chiusi ed al riparo dalla luce a temperatura ambiente con consegna al Laboratorio entro 24 ore dal prelievo. Altrimenti conservare 6 C e poi trasportare, sempre al riparo dalla luce, a 6 C fino al momento della consegna al Laboratorio. I supporti dei prelievi di aria, una volta utilizzati vanno trasportati al Laboratorio entro le 24 ore: a temperatura ambiente ed al riparo della luce.

52 Grazie dell attenzione

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