Una proteina in azione: l emoglobina

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1 Capitolo supplemetare A Ua proteia i azioe: l emoglobia La catea beta dell emoglobia La trasizioe dalla vita aaerobica alla vita aerobica è stata ua delle tappe più importati dell evoluzioe, perché ha reso dispoibile ua grade riserva di eergia. L eergia che si può estrarre dal glucosio è quidici volte più elevata i preseza di ossigeo che i asseza. Gli orgaismi uicellulari e altri miuscoli orgaismi viveti assorboo l ossigeo ecessario per il metabolismo cellulare direttamete dall aria o dall ambiete acquoso circostate. I vertebrati ivece hao sviluppato due meccaismi pricipali per riforire le loro cellule di ua quatità adeguata di ossigeo. Il primo è u sistema circolatorio che distribuisce attivamete l ossigeo alle cellule dei diversi tessuti e orgai. Il secodo è l utilizzo di proteie deputate al trasporto e all immagazziameto dell ossigeo: l emoglobia e la mioglobia. L emoglobia, coteuta ei globuli rossi, trasporta l ossigeo dai polmoi ai tessuti, e ello stesso tempo cotribuisce al trasporto del biossido di carboio e degli ioi idrogeo dai tessuti ai polmoi. La mioglobia, localizzata ei muscoli, costituisce ua riserva di ossigeo, dispoibile i caso di ecessità. L aalisi comparativa dell emoglobia e della mioglobia ha permesso di otteere preziose iformazioi su molti aspetti strutturali e fuzioali delle proteie. Etrambe le proteie, evoluzioisticamete correlate, possiedoo strutture quasi idetiche per il legame co l ossigeo. Però, metre l emoglobia è u trasportatore di ossigeo assai efficiete, i grado di utilizzare fio al 90% della sua poteziale capacità di trasporto, la mioglobia è i grado di utilizzare solo il 7%. A cosa è dovuta questa differeza così etta? La mioglobia è formata da ua sigola catea polipeptidica, metre l emoglobia è u tetramero. Le quattro catee dell emoglobia legao l ossigeo cooperativamete, cioè il legame dell ossigeo a el torrete circolatorio gli eritrociti trasportao l ossigeo dai polmoi ai tessuti, dove è richiesto. L emoglobia, ua proteia tetramerica che cotiee l eme, u pigmeto resposabile del colore rosso del sague, si lega all ossigeo, che viee trasportato fio ai tessuti, dove viee rilasciato. L emoglobia è stata ua delle prime proteie di cui sia stata determiata la struttura: il disego qui i alto mostra il ripiegameto spaziale (foldig) di ua sigola subuità. [Fote: (foto a siistra) Dr. Deis Kukel/Visual Ulimited.] Sommario A1 La mioglobia e l emoglobia legao l ossigeo a livello dell atomo di ferro dell eme A2 L emoglobia lega l ossigeo co u meccaismo cooperativo A3 Gli ioi idrogeo e il biossido di carboio promuovoo il rilascio dell ossigeo: l effetto Bohr A4 Le mutazioi ei gei che codificao per le subuità dell emoglobia soo resposabili di alcue malattie

2 2 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Figura A1 Struttura della mioglobia Si oti che la mioglobia è formata da ua sigola catea polipeptidica, che possiede -eliche uite da avvolgimeti o casuali. La mioglobia cotiee u sigolo sito di legame per l ossigeo. [Fote: 1MBD.pdb.] ua catea aumeta la probabilità che le altre tre catee leghio l ossigeo. Ioltre, l affiità dell ossigeo per l emoglobia è modulata dal legame degli ioi idrogeo e del biossido di carboio, che aumeta la capacità di trasporto dell ossigeo. La cooperatività e la risposta agli effettori possoo essere spiegate sulla base delle variazioi della struttura quateraria dell emoglobia, che si verificao a seguito del legame di differeti combiazioi di molecole modulatrici. L emoglobia e la mioglobia occupao u posto importate ella storia della biochimica. Esse soo state le prime proteie di cui sia stata determiata la struttura tridimesioale per cristallografia a raggi X. Ioltre, ua malattia del sague, l aemia a cellule falciformi, causata dalla sostituzioe di u sigolo ammioacido i ua delle catee dell emoglobia, ha dimostrato per la prima volta che u cambiameto ella sequeza ammioacidica di ua proteia può risultare ell isorgeza di ua malattia. o solo per quato di per sé ci isega, ma ache come paradigma per molte altre proteie che icotreremo i seguito, l emoglobia può essere cosiderata ua fote di appredimeto e di discussioe. A1 LA MIGLBIA E L EMGLBIA LEGA L SSIGE A LIVELL DELL ATM DI FERR DELL EME Mioglobia La mioglobia di capodoglio è stata la prima proteia di cui è stata determiata la struttura tridimesioale attraverso la cristallografia a raggi X. Gli studi pioeristici di Joh Kedrew si coclusero co la risoluzioe della struttura della proteia egli ai 1950 (figura A1). La mioglobia è formata per gra parte da -eliche uite tra loro da avvolgimeti o casuali, a formare ua struttura globulare. La mioglobia può trovarsi i ua forma priva di ossigeo, deomiata deossimioglobia, o i ua forma legata all ossigeo, deomiata ossimioglobia. La capacità sia della mioglobia sia dell emoglobia di legare l ossigeo dipede dalla preseza di u gruppo prostetico, chiamato eme. Gruppo propioico Fe Il color rosso del muscolo e del sague è dovuto alla preseza dell eme. L eme è costituito da ua compoete orgaica e da u atomo di ferro i posizioe cetrale. La compoete orgaica, deomiata protoporfiria, è costituita da quattro aelli pirrolici legati da poti metiici per formare u aello tetrapirrolico. All aello soo legati quattro gruppi metilici, due gruppi viilici, e due catee laterali di propioato. L atomo di ferro è localizzato al cetro della protoporfiria, ed è legato ai quattro atomi di azoto degli aelli pirrolici. I codizioi ormali è ello stato di ossidazioe ferroso (Fe 2+ ). Ioltre, lo ioe ferro può formare altri due legami, uo su ciascua delle due facce del piao ell eme. Questi siti di legame soo chiamati quito e sesto sito di coordiazioe. ella mioglobia il quito sito di coordiazioe è occupato dall aello imidazolico di u residuo di istidia della proteia, deomiata istidia prossimale. ella deossimioglobia il sesto sito di coordiazioe o è occupato, ed è dispoibile per il legame co l ossigeo. Lo ioe ferro si trova circa 0,4 Å all estero del piao porfiriico, perché lo ioe ferro, ella forma presete ella deossimioglobia, è u po troppo volumioso per adattarsi etro la cavità dell aello porfiriico (parte siistra della figura A2). Il legame della molecola di ossigeo al sesto sito di coordiazioe dello ioe ferro provoca u otevole riordiameto degli elettroi del ferro, che diveta più piccolo, e può così spostarsi el Eme (Fe-protoporfiria IX) Aello pirrolico Gruppo metilico Gruppo viilico

3 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 3 0,4 Å Ferro Porfiria 2 Figura A2 Variazioi ella posizioe dello ioe ferro a seguito del legame dell ossigeo Lo ioe ferro è situato leggermete all estero del piao della protoporfiria dell eme ella deossiemoglobia (a siistra), ma si sposta sul piao dell eme a seguito dell ossigeazioe (a destra). His ell ossiemoglobia ella deossiemoglobia piao della porfiria (parte destra della figura A2). Il cambiameto ella struttura elettroica può essere moitorato seguedo le modificazioi delle proprietà magetiche, che soo il fodameto della risoaza magetica ucleare per immagii (fmri), ua delle teciche più avazate per lo studio delle fuzioi del cervello (par. 32.1). el 1936, quasi 25 ai prima che veisse chiarita la struttura tridimesioale della mioglobia, Lius Paulig, sulla base di misurazioi magetiche, aveva previsto che dovessero verificarsi modificazioi strutturali ella proteia, a seguito del legame co l ossigeo. La struttura della mioglobia previee il rilascio di specie reattive dell ossigeo Fe 2+ Fe 3+ Ioe superossido Figura A3 Legame ferro-ossigeo L iterazioe tra il ferro e l ossigeo ell emoglobia può essere descritta come ua combiazioe di due strutture di risoaza, ua col Fe 2+ e l ossigeo molecolare, e l altra col Fe 3+ e lo ioe superossido. Istidia distale Il legame dell ossigeo al ferro dell eme è accompagato dal parziale trasferimeto di u elettroe dallo ioe ferroso all ossigeo. La struttura che si forma può essere descritta come u complesso tra lo ioe ferrico (Fe 3+ ) e l aioe superossido ( 2 ), come illustrato ella figura A3. È importate però che l ossigeo, ua volta rilasciato dall emoglobia, rimaga ossigeo molecolare, e o diveti aioe superossido. Ifatti l aioe superossido stesso e altri composti che potrebbero derivare soo specie reattive dell ossigeo (cap. 18, p. 460) che possoo daeggiare molte macromolecole biologiche. Ioltre, dopo il rilascio del superossido, lo ioe ferro si trova allo stato ferrico. La mioglobia che cotiee il ferro ferrico, deomiata metmioglobia, o è i grado di legare l ossigeo, e perde così la possibilità di immagazziarlo. La struttura della mioglobia stabilizza il complesso co l ossigeo, i modo che risulta più difficile il rilascio del superossido. I particolare, ella sacca idrofoba, dove l ossigeo si lega al ferro dell eme, è presete u altro residuo di istidia (deomiato istidia distale) che forma u legame a idrogeo co la molecola di ossigeo (figura A4). Il parziale carattere di superossido dell ossigeo legato rafforza l iterazioe tra l istidia distale e l ossigeo. Si può quidi affermare che la compoete proteica della mioglobia cotrolla la reattività itriseca dell eme, rededolo più adatto a legare reversibilmete l ossigeo. Figura A4 Stabilizzazioe dell ossigeo legato all eme U legame a idrogeo (liea verde tratteggiata) che si forma tra l istidia distale e l ossigeo legato allo ioe ferroso cotribuisce a stabilizzare l ossimioglobia.

4 4 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Figura A5 Struttura quateraria della deossiemoglobia L emoglobia, che è composta da due catee e due catee, fuzioa come se fosse formata da ua coppia di dimeri. (A) Modello a astri. (B) Modello a spazi piei. [Fote: 1A3.pdb.] Figura A6 Curva di ossigeazioe della mioglobia Metà delle molecole di mioglobia soo legate all ossigeo quado la pressioe parziale dell ossigeo è di 2 Torr. L emoglobia umaa è formata da quattro subuità simili alla mioglobia Y (saturazioe frazioale) 0,5 P 50 = 2 Torr Cosideriamo ora le cietiche di ossigeazioe della mioglobia e dell emoglobia. Le caratteristiche di legame dell ossigeo vegoo descritte dalla curva di legame dell ossigeo (detta ache curva di saturazioe dell ossigeo), u grafico i cui la saturazioe frazioale viee riportata i fuzioe della cocetrazioe dell ossigeo. La saturazioe frazioale, Y, è defiita come la frazioe dei possibili siti di legame a cui è effettivamete legato l ossigeo. Il valore di Y varia da 0 (tutti i siti soo vuoti) a 1 (tutti i siti soo occupati). La cocetrazioe dell ossigeo viee coveietemete riportata sotto forma di pressioe parziale dell ossigeo, p 2. La forma della curva di ossigeazioe della mioglobia è quella di u semplice equilibrio chimico (figura A6). Si oti che il valore della saturazioe frazioale della mioglobia aumeta rapidamete all aumetare della p 2, fio a mateersi costate a valori di p 2 relativamete bassi. Il valore della pressioe parziale di ossigeo a cui la metà dei siti soo occup 2 (Torr) La struttura tridimesioale dell emoglobia di cavallo è stata risolta da Max Perutz subito dopo la determiazioe della struttura della mioglobia. I seguito soo state determiate le strutture di emoglobie isolate da altri orgaismi, icluso l uomo. Tutte posseggoo quattro catee polipeptidiche: ua coppia di catee, che hao la stessa sequeza ammioacidica, e ua coppia di catee, la cui sequeza ammioacidica è diversa da quella delle catee (figura A5). Ciascua subuità comprede ua serie di -eliche disposte i modo simile a quelle della mioglobia. La struttura ricorrete è deomiata ripiegameto globiico. I accordo co questa similarità strutturale, le sequeze ammioacidiche delle catee e dell emoglobia umaa possoo essere allieate co la sequeza ammioacidica della mioglobia di capodoglio, otteedosi rispettivamete il 25% e il 24% di omologia. I residui esseziali per la fuzioe, come l istidia prossimale e l istidia distale, soo coservati i tutte le catee. Quidi le catee e dell emoglobia soo correlate tra loro e co la miosia per evoluzioe divergete (vedi cap. 7, p. 167). Il tetramero dell emoglobia, idicato i geere come emoglobia A (HbA) è meglio descritto come ua coppia di due dimeri idetici ( 1 1 e 2 2 ) che si associao per formare u tetramero. ella deossiemoglobia i due dimeri soo giustapposti da ua vasta iterfaccia, che iclude, tra le altre regioi, l estremità carbossitermiale di ciascua catea. I gruppi eme soo be separati el tetramero: le distaze ferro-ferro soo comprese tra 24 e 40 Å. A2 L EMGLBIA LEGA L SSIGE C U MECCAISM CPERATIV

5 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 5 Y (saturazioe frazioale) Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 Mioglobia Emoglobia ,8 0,6 0,4 0,2 Tessuti 7% 66% pati dall ossigeo (P 50 corrispodete al 50% di saturazioe) è di appea 2 Torr (mm Hg). Per cotro, la curva di ossigeazioe dell emoglobia ei globuli rossi mostra alcue caratteristiche iteressati (figura A7). Essa o può essere ricodotta a ua semplice curva di legame, come è quella della mioglobia, e preseta ivece forma a «S». Curve di questo tipo vegoo deomiate sigmoidi. Si oti che l ossigeo si lega più debolmete all emoglobia che alla mioglobia. Ifatti l emoglobia ha u valore di P 50 pari a 26 Torr, cotro u valore di P 50 della mioglobia di 2 Torr. Si oti ioltre che la curva di legame è quella che si ottiee lavorado co i globuli rossi. All itero dei globuli rossi l emoglobia iteragisce co il 2,3-bisfosfoglicerato, ua molecola che dimiuisce sigificativamete l affiità dell emoglobia per l ossigeo, come si vedrà più avati. Ua curva di legame sigmoidale suggerisce che la proteia possiede caratteristiche peculiari. I particolare la sigmoidicità della curva di ossigeazioe dell emoglobia suggerisce che, ua volta che l ossigeo si lega a uo dei quattro possibili siti di legame, aumeta la probabilità che esso si leghi a uo degli altri tre siti. Aalogamete, il distacco dell ossigeo da uo dei gruppi eme facilita il distacco dell ossigeo dagli altri tre. Questo meccaismo di legame viee detto cooperativo (vedi oltre, p. 7), perché le reazioi di legame dell ossigeo a oguo dei siti dell emoglobia o soo tra loro idipedeti. Toreremo più avati sul meccaismo della cooperatività dell emoglobia. Qual è il sigificato fisiologico del legame cooperativo dell ossigeo ell emoglobia? L ossigeo deve essere trasportato el torrete circolatorio dai polmoi, dove la sua pressioe parziale è relativamete alta (circa 100 Torr), ai tessuti a elevata attività metabolica, dove la pressioe parziale dell ossigeo è molto più bassa (ormalmete, 20 Torr). Vediamo ora come la cooperatività tra i siti di legame, suggerita dalla forma sigmoidale della curva di ossigeazioe, reda più efficiete il trasporto dell ossigeo (figura A8). ei polmoi l emoglobia è pressoché totalmete saturata co l ossigeo, e il 98% dei siti di legame co l ossigeo soo occupati. Quado l emoglobia raggiuge i tessuti e rilascia l ossigeo, il livello di saturazioe scede fio al 32%. Quidi u totale di = 66% dei poteziali siti di legame cotribuisce al trasporto dell ossigeo. Il rilascio dell ossigeo avviee i modo cooperativo, e favorisce ua più completa distribuzioe ai tessuti. Se ivece dell emoglobia veisse utilizzata la mioglobia, la saturazioe sarebbe sempre del 98% ei polmoi, ma ei tessuti sarebbe del 91%. Quidi u totale di = 7% dei poteziali siti di legame cotribuirebbero al trasporto dell ossigeo; i altre parole, la mioglobia lega l ossigeo troppo saldamete, per essere u buo trasportatore di ossigeo. Si potrebbe immagiare ua situazioe diversa, cioè ipotizzare ua proteia che si sia evoluta i modo ottimale per il trasporto dell ossigeo, ma seza cooperatività. Per ua tale proteia l ossigeo che potrebbe essere trasportato da u orgao dove la p 2 è di 100 Torr a u altro dove la p 2 è di 20 Torr è di = 38%. Quidi il legame e il rilascio dell ossigeo di tipo cooperativo permettoo all emoglobia di distribuire ai tessuti 10 volte più ossigeo di quato potrebbe essere distribuito dalla mioglobia, e più di 1,7 volte di più di quato potrebbe essere distribuito da ua proteia o dotata di cooperatività. U più atteto esame delle cocetrazioi dell ossigeo a riposo e durate l esercizio fisico chiarisce meglio il ruolo dell emoglobia el trasporto dell ossigeo (figura A9). I codizioi di riposo la cocetrazioe dell ossigeo ei muscoli è di circa 40 Torr, ma scede a 20 Torr durate l esercizio fisico. La dimiuzioe della pressioe parziale dell ossigeo da 100 Torr ei polp 2 (Torr) Polmoi 38% p 2 (Torr) Mioglobia Emoglobia Cooperatività assete (situazioe ipotetica) Torr Uità di misura della pressioe, equivalete alla pressioe esercitata da ua coloa di mercurio alta 1 mm a 0 C e a gravità stadard (1 mm Hg). Dal ome di Evagelista Torricelli ( ) ivetore del barometro a mercurio. Figura A7 Curva di ossigeazioe dell emoglobia La curva, otteuta utilizzado globuli rossi iteri, ha pressappoco forma a «S». Il che idica che i ogi molecola di emoglobia soo preseti siti separati per il legame co l ossigeo, che iteragiscoo tra loro. La liea tratteggiata era mostra, per cofroto, la curva di ossigeazioe della mioglobia. Figura A8 La cooperatività facilita il rilascio dell ossigeo La cooperatività tra i siti di legame dell 2 fa sì che l emoglobia rilasci più ossigeo ai tessuti rispetto alla mioglobia e a ogi altra proteia o dotata di cooperatività, ache rispetto a ua proteia dotata di affiità ottimale per l ossigeo.

6 6 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Figura A9 Effetto dell esercizio fisico sul trasporto dell ossigeo La brusca dimiuzioe della cocetrazioe dell ossigeo da 40 Torr ei tessuti a riposo fio a 20 Torr ei tessuti durate l esercizio fisico corrispode alla parte più ripida della curva di ossigeazioe. I cosegueza, l emoglobia è molto efficiete el riforire di ossigeo i tessuti durate l esercizio. Y (saturazioe frazioale) Esercizio fisico 0,8 0,6 0,4 0,2 Riposo Polmoi 45% 21% p 2 (Torr) moi a 40 Torr ei tessuti corrispode a ua variazioe della saturazioe dell emoglobia dal 98% al 77%. e cosegue che la quota di ossigeo rilasciato è pari a = 21% per ua dimiuzioe della pressioe parziale dell ossigeo di 60 Torr. Durate l esercizio fisico la pressioe parziale dell ossigeo scede da 40 a 20 Torr e la saturazioe dell ossigeo dal 77% al 32%. e cosegue che la quota di ossigeo rilasciato è pari a = 45% per ua dimiuzioe della pressioe parziale dell ossigeo di soli 20 Torr. Poiché la variazioe della cocetrazioe dell ossigeo dalla codizioe di riposo all esercizio fisico corrispode alla parte più ripida della curva di ossigeazioe dell emoglobia, l ossigeo può essere trasferito ai tessuti dove è più richiesto. el paragrafo A3 verrao esamiate altre proprietà dell emoglobia, che e chiariscoo meglio il ruolo fisiologico. L ossigeazioe provoca ua sesibile variazioe ella struttura quateraria dell emoglobia La cooperatività della curva di ossigeazioe comporta che il legame a uo dei quattro siti dell emoglobia ifluezi le proprietà di legame degli altri tre. Ua diretta iterazioe tra i siti o è possibile, perché essi si trovao be separati ella molecola dell emoglobia, lotai l uo dall altro. e cosegue che l iterazioe deve essere mediata da meccaismi idiretti, correlati co la struttura quateraria dell emoglobia. L emoglobia va icotro a impoeti variazioi della sua struttura quateraria durate l ossigeazioe: i dimeri 1 1 e 2 2 ruotao di circa 15 l uo rispetto all altro (figura A10). Però, pur adado icotro a variazioi strutturali, essi mategoo sostazialmete la stessa forma. È quidi l iterfaccia tra i dimeri 1 1 e 2 2 a subire le maggiori trasizioi strutturali. Studi receti hao dimostrato che i dimeri 1 1 e 2 2 soo più liberi di muoversi l uo rispetto all altro ello stato ossigeato, rispetto allo stato deossigeato. La struttura quateraria della forma deossigeata dell emoglobia viee spesso deomiata stato T (T sta per tese, «teso») perché le quattro subuità vegoo teute saldamete uite l ua all altra da iterazioi o covaleti. La struttura quateraria dell emoglobia totalmete ossigeata viee ivece deomiata stato R (R sta per relaxed, «rilassato»). Cosiderado che la forma R dell emoglobia è meo tesa, le due desigazioi, T e R, appaioo particolarmete ap- Figura A10 Variazioi ella struttura quateraria dell emoglobia a seguito dell ossigeazioe Si oti che, a seguito dell ossigeazioe, u dimero scivola rispetto all altro, attraverso u movimeto di rotazioe di 15. [Fote: 1A3.pdb e 1LFQ.pdb.]

7 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 7 È fortemete favorito lo statot K T K R Stato T Stato R È fortemete favorito lo stato R Figura A11 Modello cocertato Tutte le molecole si trovao o ello stato T o ello stato R. A ogi livello di ossigeazioe corrispode u equilibrio tra i due stati T e R. I asseza di ossigeo l equilibrio è fortemete spostato verso la forma T. I preseza di ossigeo, quado tutti i siti soo legati all ossigeo, l equilibrio è fortemete spostato verso la forma R. Lo stato R ha ua maggiore affiità per l ossigeo rispetto allo stato T. propriate. Quado l emoglobia si trova ello stato R, i siti di legame dell ossigeo soo i grado di legare il gas co maggiore affiità rispetto ai siti dell emoglobia che si trova ello stato T. Il legame dell ossigeo a uo dei quattro siti iduce ua variazioe coformazioale dell emoglobia dallo stato T allo stato R, che a sua volta aumeta l affiità per l ossigeo degli altri siti. Per spiegare la cooperatività dell emoglobia si può far ricorso a umerosi modelli Per spiegare il meccaismo co cui i ligadi possoo legarsi i modo cooperativo a proteie multimeriche, come l emoglobia, soo stati proposti due modelli limite. el modello cocertato, oto ache come modello MWC, dai omi di Jacques Mood, Jeffries Wyma e Jea-Pierre Chageux, che per primi lo proposero, la proteia multimerica può esistere i due stati coformazioali: lo stato T e lo stato R. Il legame del ligado sposta l equilibrio tra i due stati (figura A11). Quidi, ma mao che il tetramero dell emoglobia lega ua molecola di ossigeo, aumeta la probabilità che assuma lo stato coformazioale R. ella forma deossigeata l emoglobia si trova quasi esclusivamete ello stato T. Però il legame dell ossigeo i uo dei siti sposta l equilibrio verso lo stato R. Quado ua molecola assume la struttura quateraria R, aumeta l affiità per l ossigeo dei suoi siti di legame, e quidi aumeta la probabilità che altre molecole di ossigeo si leghio ai siti liberi. Ciò spiega perché la curva di ossigeazioe dell emoglobia sale Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 Curva di legame dello stato R Curva di ossigeazioe osservata sperimetalmete 0,2 Curva di legame dello stato T p 2 (Torr) letamete all iizio, quado tutte le molecole si trovao ello stato T, diveta più ripida via via che aumeta la frazioe delle molecole che si trovao ello stato R, e di uovo si appiattisce, quado tutti i siti delle molecole allo stato R soo occupati dall ossigeo (figura A12). L isieme di questi eveti spiega la forma sigmoidale della curva di ossigeazioe dell emoglobia, così importate ai fii di u trasporto efficiete dell ossigeo. el modello cocertato ciascu tetramero può esistere solo i due stati: lo stato T e lo stato R. el modello sequeziale, alterativo al modello cocertato, il legame di u ligado a u sito di ua proteia multimerica aumeta l affiità di legame dei siti vicii, seza idurre la completa coversioe della proteia dallo stato T allo stato R (figura A13). Il legame di tipo cooperativo dell ossigeo viee descritto meglio dal modello cocertato o dal K 1 2 K 2 2 K 3 2 K Figura A12 Trasizioe dallo stato T allo stato R La curva di ossigeazioe dell emoglobia che si osserva sperimetalmete può essere cosiderata come la combiazioe delle due curve di ossigeazioe che si otterrebbero se tutte le molecole di emoglobia rimaessero o ello stato T o ello stato R. La curva sperimetale ha forma sigmoidale perché le molecole di emoglobia si covertoo dallo stato T allo stato R ma mao che l ossigeo si lega. Figura A13 Modello sequeziale Il legame di u ligado cambia la coformazioe della subuità a cui si lega. La variazioe coformazioale iduce cambiameti elle subuità vicie, e la loro affiità per il ligado aumeta.

8 8 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia modello sequeziale? essuo dei due modelli da solo è i grado di descrivere compiutamete il comportameto dell emoglobia. È ecessario ricorrere a u modello combiato. Si può affermare che il comportameto dell emoglobia segue il modello cocertato, i quato la struttura quateraria dell emoglobia co tre siti occupati dall ossigeo è ricoducibile i prevaleza allo stato R. Il rimaete sito o occupato ha u affiità per l ossigeo 20 volte superiore a quella che ha l emoglobia completamete deossigeata per la prima molecola di ossigeo. Però il comportameto dell emoglobia o segue fedelmete il modello cocertato, perché quado si lega ua sola molecola di ossigeo la struttura quateraria è ricoducibile i prevaleza allo stato T. Tuttavia l affiità per l ossigeo di questa molecola moossigeata è tre volte superiore a quella dell emoglobia deossigeata, i accordo co il modello sequeziale. Questi dati sottolieao che il modello cocertato e il modello sequeziale rappresetao casi limite ideali, ai quali i sistemi biologici possoo avviciarsi, ma che raramete raggiugoo. I cambiameti strutturali a livello dei gruppi eme vegoo trasmessi all iterfaccia 1 1 _ 2 2 Vediamo ora come il legame dell ossigeo a u sito sia i grado di spostare l equilibrio tra lo stato R e lo stato T del tetramero emoglobiico. Come si è visto per la mioglobia, il legame dell ossigeo fa sì che ciascu atomo di ferro dell emoglobia si sposti dall estero del piao el piao della porfiria. Quado l atomo di ferro si muove, isieme a esso si muove ache il residuo di istidia legato alla quita valeza di coordiazioe. Questo residuo di istidia fa parte di u elica, che quidi si muoverà a sua volta (figura A14). La sua termiazioe carbossitermiale giace ell iterfaccia tra i due dimeri. Il cambio di posizioe della termiazioe carbossitermiale dell elica favorisce la trasizioe dallo stato T allo stato R. I cosegueza, la variazioe strutturale a livello dello ioe ferro i ua subuità viee direttamete trasmessa alle altre. Il riordiameto dell iterfaccia tra i due dimeri costituisce u meccaismo molecolare di comuicazioe tra le subuità, che rede possibile la cooperatività del legame dell ossigeo. Il 2,3-bisfosfoglicerato ha u ruolo fodametale el determiare l affiità dell ossigeo per l emoglobia ei globuli rossi Perché l emoglobia possa trasferire efficietemete l ossigeo ai tessuti è importate che la forma T rimaga stabile, fio a che il legame dell ossigeo la coverte ella forma R. Però lo stato T dell emoglobia è così istabile, che l equilibrio sarebbe talmete spostato verso lo stato R, da o permettere il rilascio dell ossigeo i codizioi fisiologiche. È quidi ecessario l iterveto di u altro meccaismo, che stabilizzi lo stato T. Tale meccaismo vee scoperto cofrotado le proprietà di legame dell ossigeo dell emoglobia all itero dei globuli rossi co quelle dell emoglobia altamete purificata (figura A15). L emoglobia purificata lega l ossigeo molto più saldamete dell emoglobia itraeritrocitaria. Questa drastica differeza è dovuta alla preseza ei globuli rossi del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG; oto ache come 2,3-difosfoglicerato o 2,3-DPG). P 2 C H P 2 Figura A14 Modificazioi coformazioali ell emoglobia Il movimeto dello ioe ferro che si verifica a seguito dell ossigeazioe porta il residuo di istidia legato al ferro verso l aello porfiriico. Il movimeto dell elica a cui a sua volta è legata l istidia modifica l iterfaccia tra i dimeri, iducedo altre modificazioi strutturali. A scopo di cofroto, la struttura della deossiemoglobia è mostrata i grigio, dietro quella dell ossiemoglobia i colore. Iterfaccia Deossiemoglobia ssiemoglobia 2,3-Bisfosfoglicerato (2,3-BPG) Questo composto fortemete aioico è presete ei globuli rossi a ua cocetrazioe approssimativamete pari a quella dell emoglobia (circa 2 mm). I asseza di 2,3-BPG l emoglobia sarebbe u trasportatore di ossigeo estremamete iefficiete, perché potrebbe rilasciare ei tessuti soltato l 8% del suo carico di ossigeo. I che modo il 2,3-BPG dimiuisce i modo così rilevate l affiità dell emoglobia per l ossigeo? L esame della struttura cristallia della deossiemoglobia i preseza di 2,3-BPG ha rivelato che ua sigola molecola di 2,3-BPG si

9 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 9 lega al cetro del tetramero, i ua tasca che è presete solo ella forma T (figura A16). A seguito della trasizioe dallo stato T allo stato R la tasca si cotrae e il 2,3-BPG è rilasciato. Perché la trasizioe dallo stato T allo stato R possa aver luogo, è ecessario che i legami tra il 2,3- BPG e l emoglobia siao rotti. I preseza di 2,3-BPG, u maggior umero di siti di legame per l ossigeo deve essere occupato, per promuovere la trasizioe dallo stato T allo stato R; pertato l emoglobia rimae allo stato T di bassa affiità fiché o viee raggiuta ua più elevata cocetrazioe di ossigeo. La regolazioe dell emoglobia da parte del 2,3-BPG è di otevole iteresse, perché il 2,3- BPG o assomiglia i alcu modo all ossigeo, la molecola sulla quale l emoglobia esercita la sua fuzioe. Il 2,3-BPG viee deomiato effettore allosterico (dal greco allos, «altro» e stereos, «struttura»). La regolazioe da parte di molecole o correlate strutturalmete all ossigeo è possibile, perché l effettore allosterico si lega a u sito che è completamte distito da quello a cui si lega l ossigeo. Gli effettori allosterici vegoo presi i cosiderazioe ache el capitolo 10, trattado la regolazioe ezimatica. Il legame del 2,3-BPG all emoglobia ha altre importati implicazioi fisiologiche. Il gee per la globia espresso dal feto umao differisce da quello espresso dall adulto; il tetramero dell emoglobia fetale è formato da due catee e da due catee. La sequeza ammioacidica della catea, che è il prodotto di ua duplicazioe geica, è per il 72% idetica alla sequeza Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 Tessuti 8% 66% Polmoi Emoglobia (itraeritrocitaria, coteete 2,3-BPG) p 2 (Torr) Emoglobia purificata (2,3-BPG assete) ammioacidica della catea. Ua differeza importate è la preseza di u residuo di seria i posizioe 143 ella catea, che sostituisce ua istidia presete ella stessa posizioe ella catea. Poiché l istidia fa parte del sito di legame del 2,3-BPG, la rimozioe di due cariche positive (ua per ogi catea) riduce l affiità del 2,3-BPG per l emoglobia fetale. I cosegueza, l affiità per l ossigeo dell emoglobia fetale è più alta di quella matera (figura A17). Tale differeza di affiità rede possibile il trasferimeto dell ossigeo dai globuli rossi materi a quelli fetali. Si tratta di u esempio che dimostra come la duplicazioe geica e la specializzazioe molecolare abbiao permesso la rapida soluzioe di u problema biologico; el caso specifico, il trasporto dell ossigeo dalla madre al feto. Figura A15 Curve di ossigeazioe dell emoglobia purificata e dell emoglobia itraeritrocitaria a cofroto L emoglobia purificata lega l ossigeo più saldamete dell emoglobia itraeritrocitaria. La differeza è dovuta alla preseza del 2,3-bisfosfoglicerato ei globuli rossi. Figura A16 Legame del 2,3-BPG alla deossiemoglobia umaa Il 2,3-bisfosfoglicerato si posizioa ella cavità cetrale della deossiemoglobia (a siistra), dove iteragisce co tre gruppi carichi positivamete, apparteeti a ciascua delle catee (a destra). [Fote: 1B86.pdb.]

10 10 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Figura A17 Affiità per l ossigeo dei globuli rossi fetali I globuli rossi fetali hao maggiore affiità per l ossigeo rispetto ai globuli rossi materi, perché l emoglobia fetale o lega il 2,3-BPG co la stessa affiità dell emoglobia matera. Figura A18 Effetto del ph sull affiità per l ossigeo dell emoglobia Ua dimiuzioe del ph da 7,4 (curva rossa) a 7,2 (curva blu) risulta i u maggior rilascio di 2 dall ossiemoglobia. Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 Globuli rossi fetali Globuli rossi materi L 2 passa dall ossiemoglobia matera alla deossiemoglobia fetale p 2 (Torr) A3 GLI II IDRGE E IL BISSID DI CARBI PRMUV IL RILASCI DELL SSIGE: L EFFETT BHR Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 Tessuti 66% 77% p 2 (Torr) ph 7,4 ph 7,2 Polmoi Abbiamo visto come il meccaismo cooperativo di rilascio dell ossigeo dall emoglobia permetta u adeguata distribuzioe dell ossigeo ai tessuti, dove la pressioe parziale dell ossigeo è bassa. Ma l emoglobia rispode ache ad altre molecole segale, preseti el suo ambiete fisiologico, che segalao il bisogo di ossigeo. I tessuti a rapido metabolismo, come il muscolo i cotrazioe, producoo ioi idrogeo e biossido di carboio i otevole quatità. L emoglobia è i grado di rispodere protamete ai livelli elevati di questi due composti, i modo da rilasciare più ossigeo proprio dove ve e è più bisogo. Come il 2,3-BPG, lo ioe idrogeo e il biossido di carboio soo effettori allosterici, che si legao all emoglobia i siti distiti dai siti di legame dell ossigeo. La regolazioe del legame dell ossigeo da parte degli ioi idrogeo e del biossido di carboio va sotto il ome di effetto Bohr, dal ome di Christia Bohr, che per primo la descrisse el L affiità dell emoglobia per l ossigeo dimiuisce al dimiuire del ph, a partire dal valore fisiologico di 7,4 (figura A18). I cosegueza, ma mao che l emoglobia raggiuge distretti i cui il ph tede a dimiuire, la sua tedeza a rilasciare ossigeo aumeta. Per esempio, il trasporto dell ossigeo dai polmoi, dove il ph è 7,4 e la pressioe parziale dell ossigeo è di 100 Torr, al muscolo i cotrazioe, dove il ph è 7,2 e la pressioe parziale dell ossigeo è 20 Torr, risulta i u rilascio di ossigeo pari al 77% della capacità di trasporto totale. Se o vi fosse variazioe di ph, la capacità di trasporto si ridurrebbe al 66%. Studi di carattere strutturale e chimico hao permesso di chiarire molti aspetti resposabili dell effetto Bohr. Almeo due soo i gruppi chimici resposabili: i gruppi -ammiici degli ammioacidi termiali delle catee e i residui delle istidie 146 e 122. Per oguo di essi il valore del pk a è itoro a 7. Cosideriamo l istidia 146, che occupa la termiazioe carbossilica della catea. ella deossiemoglobia il gruppo carbossilico termiale dell ammioacido 146 forma u pote salio co u residuo di lisia della subuità dell altro dimero. Tale iterazioe blocca la catea laterale dell istidia 146 i ua posizioe tale da poter formare u pote salio co la carica egativa dell aspartato 94 della stessa catea, purché il gruppo imidazolico del residuo di istidia sia protoato (figura A19). Ache gli altri gruppi partecipao alla formazioe di legami salii preseti ella forma T. La formazioe dei poti salii stabilizza lo stato T, favoredo i tal modo il rilascio dell ossigeo. A ph più elevati, la catea laterale dell istidia o è protoata, e il pote salio o si forma. Ma, ma mao che il valore di ph si abbassa, la catea laterale dell istidia 146 si protoa, si forma il pote salio co l aspartato 94, e si stabilizza lo stato T. Il biossido di carboio, ua molecola eutra, attraversa la membraa del globulo rosso e peetra ella cellula. Il trasporto è facilitato da trasportatori di membraa, che icludoo le proteie del tipo Rh. Il biossido di carboio favorisce il rilascio dell ossigeo co due meccaismi. Primo, la preseza di elevate cocetrazioi di biossido di carboio provoca ua dimiuzioe del ph itraeritrocitario (figura A20). Il biossido di carboio reagisce co l acqua e forma acido carboico, H 2 C 3. La reazioe viee accelerata dall aidrasi carboica, ua proteia ezimatica abbodate ei globuli rossi, che viee trattata diffusamete el capitolo 9. L acido carboico è u acido forte, co u pk a di 3,5. Quidi, ua volta formatosi, si dissocia per formare

11 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 11 ioe bicarboato, HC 3, e H +. e deriva u abbassameto del ph, che stabilizza lo stato T dell emoglobia col meccaismo riportato sopra. Il secodo meccaismo comporta ua iterazioe diretta tra il biossido di carboio e l emoglobia, che stimola il rilascio dell ossigeo. Si può be apprezzare l effetto del biossido di carboio sull affiità dell emoglobia per l ossigeo, comparado le curve di ossigeazioe i asseza e i preseza di biossido di carboio alla pressioe parziale di 40 Torr e a ph 7,2 (figura A21). I preseza di biossido di carboio e alla pressioe parziale di 40 Torr e a ph 7,2 la quatità di ossigeo rilasciata si avvicia al 90% della massima capacità di trasporto. Il biossido di carboio stabilizza la deossiemoglobia reagedo co i gruppi ammiici termiali e formado così residui di carbammato carichi egativamete, diversamete dalle cariche eutre o positive dei gruppi ammiici liberi. 2 Lys 40 + C termiale + Protoazioe 1 His Asp 94 Figura A19 Le basi chimiche dell effetto Bohr ella deossiemoglobia tre residui ammioacidici formao due poti salii che stabilizzao la struttura quateraria ello stato T. La formazioe di uo dei poti salii dipede dalla preseza di u protoe sull aello imidazolico dell istidia 146. La viciaza della carica egativa dell aspartato 94 ella deossiemoglobia favorisce la protoazioe dell istidia. Si oti che il pote salio tra l istidia 146 e l aspartato 94 viee stabilizzato da u legame a idrogeo (liea verde tratteggiata). R H H R + C C H + H + C 2 C 2 C 2 + H 2 H 2 C 3 HC 3 + H + Carbammato I gruppi ammiici termiali giaccioo sull iterfaccia, tra i dimeri e i gruppi carichi egativamete del carbammato, e partecipao alla formazioe di legami salii, che stabilizzao lo stato T, favoredo il rilascio dell ossigeo. Questo processo costituisce ache u meccaismo per il trasporto del biossido di carboio, ma solo per il 14% del totale del biossido di carboio trasportato. La maggior parte del biossido di carboio rilasciata dagli eritrociti raggiuge i polmoi sotto forma di ioe bicarboato, HC 3, prodotto per idratazioe del biossido di carboio all itero degli eritrociti stessi (figura A22). L HC 3 viee poi trasportato all estero da uo specifico trasportatore, localizzato sulla membraa eritrocitaria, che scambia l HC 3 itracellulare co lo ioe Cl extracellulare. e cosegue u aumeto della cocetrazioe sierica dell HC 3. I tal modo ua otevole quatità di biossido di carboio viee trasportata dai tessuti ai polmoi sotto forma di HC 3. ei polmoi il processo si iverte: lo ioe HC 3 viee ricovertito i biossido di carboio, che viee elimiato attraverso l espirazioe. I sitesi, il biossido di carboio, geerato dal metabolismo tissutale, viee covertito egli eritrociti i ua forma che cotribuisce ad abbassare il ph itracellulare, favoredo il rilascio dell ossigeo, e che viee poi trasportato dal sague fio ai polmoi, per essere espirato. Tessuto Capillare saguigo Figura A20 Biossido di carboio e ph Il biossido di carboio diffode dai tessuti ai globuli rossi. All itero dei globuli rossi reagisce co l acqua, per formare acido carboico, attraverso ua reazioe catalizzata dall aidrasi carboica. L acido carboico si dissocia, formado HC 3 e H +, co coseguete abbassameto del ph itraeritrocitario. Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 Tessuti 77% 88% p 2 (Torr) Polmoi ph 7,4,C 2 assete ph 7,2, C 2 assete ph 7,2, 40 Torr C 2 Figura A21 Effetti del biossido di carboio La preseza del biossido di carboio dimiuisce l affiità per l ossigeo al di sotto dell effetto dovuto alla dimiuzioe del ph. Il trasporto dell ossigeo dai tessuti ai polmoi viee così ulteriormete facilitato.

12 12 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Figura A22 Trasporto di C 2 dai tessuti ai polmoi La maggior parte del biossido di carboio viee trasportata ai polmoi sotto forma di ioe HC 3 prodotto ei globuli rossi e quidi trasferito el plasma. Ua mior quatità viee trasportata dall emoglobia, sotto forma di carbammato. C 2 prodotto dalle cellule dei tessuti C 2 Hb C 2 + H 2 H + + HC 3 Cl HC Edotelio 3 C 2 Hb C 2 + H 2 HC 3 + H + Cl HC 3 Edotelio C 2 Alveolo Tessuto Capillare saguigo Capillare saguigo Polmoe Figura A23 Emazie falciformi Immagie al microscopio elettroico a scasioe, che mostra ua emazia falciforme, accato ad alcue emazie ormali. A4 LE MUTAZII EI GEI CHE CDIFICA PER LE SUBUITÀ DELL EMGLBIA S RESPSABILI DI ALCUE MALATTIE ggi, dopo il sequeziameto del geoma umao, siamo abituati a pesare che variazioi ella sequeza ammioacidica delle proteie, codificata dai gei, siao la causa di specifiche malattie. L ipotesi che molte malattie possao essere causate da difetti molecolari fu avazata da Lius Paulig el 1949 (4 ai prima che Watso e Crick propoessero la doppia elica del DA) per spiegare la patogeesi di ua malattia deomiata aemia a cellule falciformi. Il ome deriva dalla forma a falce degli eritrociti privati di ossigeo, che si osserva ei soggetti affetti dalla malattia (figura A23). Paulig propose che l aemia falciforme potesse essere causata da ua specifica variazioe della sequeza ammioacidica di ua delle due catee dell emoglobia. ggi sappiamo che l ipotesi di Paulig è corretta. Ifatti circa il 7% della popolazioe umaa è affetto da forme patologiche, causate da ua variazioe della sequeza ammioacidica dell emoglobia. Cocluderemo questo capitolo trattado le due più importati emoglobiopatie: l aemia a cellule falciformi e la talassemia. L aemia a cellule falciformi risulta dall aggregazioe di molecole mutate di deossiemoglobia I soggetti affetti da aemia a cellule falciformi presetao ua serie di sitomi rilevati. L esame dei globuli rossi rivela la preseza di lughi aggregati fibrosi di emoglobia (figura A24). Le fibre si estedoo all itero dei globuli rossi, distorcedoli. I capillari vegoo ostruiti e il flusso ematico ralletato. e risulta u doloroso gofiore alle estremità e u elevato rischio di ifarto e di ifezioi batteriche (cosegueza della cattiva circolazioe). Le cellule falciformi o rimagoo i circolo tato a lugo quato gli eritrociti ormali, causado aemia. Qual è il difetto molecolare associato all aemia a cellule falciformi? el 1956 Vero Igram, utilizzado teciche cromatografiche iovative, dimostrò che ua semplice sostituzioe ammioacidica ella catea dell emoglobia è resposabile della malattia, precisamete la sostituzioe di u residuo di glutammato co u residuo di valia i posizioe 6. La forma mutata viee deomiata emoglobia S (HbS). ei soggetti affetti da aemia a cellule falciformi, ambedue gli alleli del gee per la catea dell emoglobia (HbB) soo mutati. La sostituzioe presete ell HbS dimiuisce sesibilmete la solubilità della deossiemoglobia, ache se o altera i modo evidete le proprietà dell ossiemoglobia. L esame della struttura dell emoglobia S rivela che il residuo di valia si trova sulla superficie dell emoglobia allo stato T (figura A25). Questa uova zoa idrofoba iteragisce co u al-

13 tra zoa idrofoba, formata dalla Phe 85 e dalla Val 88 della catea di ua molecola di emoglobia adiacete, iiziado u processo di aggregazioe. U aalisi più approfodita ha dimostrato che ua sigola fibra di emoglobia S è formata dall isieme di 14 filameti di molecole di emoglobia S legate l ua all altra. Come mai gli aggregati o si formao quado l emoglobia S è ossigeata? L emoglobia S ossigeata si trova ello stato S, e i residui Phe 85 e Val 88 delle catee si trovao ascosti all itero della molecola. Al residuo idrofobo di Val i posizioe 6 della catea viee quidi a macare u parter co cui iteragire, e il processo di formazioe delle fibre o può essere iescato. ell Africa occidetale circa l 1% della popolazioe è affetto da aemia a cellule falciformi. Visto che la malattia ha cosegueze talvolta devastati, come mai è così diffusa i Africa e i altre particolari zoe? Ricordiamo che ambedue le copie del gee dell HbB soo mutate ei soggetti affetti da aemia a cellule falciformi. Tuttavia i soggetti co ua copia del gee HbB e ua copia del gee HbS soo relativamete sai. Essi soo però portatori del tratto per l aemia falciforme, perché possoo trasmettere il gee dell HbS. Questi soggetti portatori soo resisteti alla malaria, ua malattia dovuta a u parassita, il Plasmodium falciparum, che è presete el globulo rosso durate uo stadio del suo ciclo vitale. L effetto devastate della malaria sulla salute e sulla possibilità riproduttiva di popolazioi che vivoo i regioi dove storicamete la malaria ha avuto ua diffusioe edemica, ha favorito i portatori del tratto dell aemia falciforme, aumetado così la prevaleza dell allele HbS (figura A26). La talassemia è causata da ua sitesi sbilaciata delle catee emoglobiiche L aemia a cellule falciformi è causata dalla sostituzioe di u sigolo ammioacido i ua delle catee dell emoglobia. Ivece la talassemia, l altra emoglobiopatia a carattere ereditario largamete diffusa, è causata dalla perdita o dalla etta dimiuzioe di ua sigola catea. I cosegueza, il livello di emoglobia ormale e la produzioe di emoglobia ei globuli rossi soo otevolmte ridotti, co coseguete isorgeza di aemia, asteia, pallore diffuso e alterazioi fuzioali a livello della milza e del fegato. La talassemia comprede diverse sidromi correlate. ella -talassemia, la catea dell emoglobia o è prodotta i sufficiete quatità. I cosegueza, si formao tetrameri emoglobiici formati solo da catee. Tali tetrameri, deomiati emoglobia H (HbH), legao l ossigeo, ma co ua affiità abormemete alta e i modo o cooperativo. e risulta u isufficiete rilascio di ossigeo ei tessuti. ella -talassemia soo le catee dell emoglobia a o essere prodotte i quatità sufficiete. I asseza di catee, le catee formao aggregati isolubili che precipitao all itero dei globuli rossi immaturi. La dimiuzioe dei globuli rossi coduce ad aemia. La forma più grave di -talassemia è chiamata talassemia maior o aemia di Cooley (morbo di Cooley). Sia la - sia la -talassemia soo associate a vari tipi di alterazioi geetiche, e si maifestao co quadri cliici molto differeziati. Le for- A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 13 Figura A24 Fibre di emoglobia preseti elle cellule falciformi Fotografia al microscopio elettroico a scasioe, che mostra u globulo rosso da cui fuoriescoo fibre di emoglobia S. [Fote: Per getile cocessioe di Robert Josephs e Thomas E. Wellems, Uiversity of Chicago.] Figura A25 Emoglobia S deossigeata L iterazioe tra la Val 6 (i blu) della catea di ua molecola emoglobiica deossigeata e la zoa idrofoba formata dalla Phe 85 e dalla Val 88 (i grigio) di ua secoda molecola di emoglobia deossigeata provoca l aggregazioe di molecole di emoglobia. Il residuo della Val 6 esposto sulla superficie della catea della secoda molecola di emoglobia partecipa a u altra idetica iterazioe, e così via. Si formao così lughe fibre di emoglobia S. [Fote: 2HBS.pdb.]

14 14 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Percetuale della popolazioe totale che possiede u solo allele dell aemia a cellule falciformi (emoglobia S) > Diffusioe edemica della malaria Figura A26 Tratto dell aemia a cellule falciformi e malaria Esiste ua sigificativa correlazioe tra le regioi ad alta frequeza dell allele HbS e le regioi co alta icideza della malaria. Figura A27 Stabilizzazioe dell -emoglobia Viee mostrata la struttura del complesso tra AHSP e -emoglobia. I questo complesso l atomo di ferro si lega all ossigeo e all istidia distale. Si oti che l AHSP iteragisce co l emoglobia sulla stessa zoa di iterazioe della - emoglobia. [Fote: 1Y01.pdb.] AHSP α-emoglobia Istidia distale me più gravi di -talassemia risultao letali prima, o subito dopo la ascita. Però soo piuttosto rare. Se si cosidera il repertorio dei gei per l emoglobia el geoma umao, se e trova la spiegazioe. ormalmete l uomo possiede quattro alleli per la catea, aziché due, disposti i modo che due gei soo localizzati uo accato all altro alla termiazioe di ciascu cromosoma 16. Pertato la completa asseza della catea richiede che siao alterati quattro alleli. La -talassemia è più comue, perché ormalmete abbiamo solo due alleli per la catea, uo su ciascua copia del cromosoma 11. ormalmete le catee dell emoglobia o si accumulao La preseza di quattro gei che esprimoo la catea, cotro i due per la catea, suggerisce che la catea vega prodotta i eccesso (assumedo semplicisticamete che l etità dell espressioe delle catee da parte di ogi gee sia la stessa). Se l ipotesi è corretta, perché l eccesso di catee o precipita? Ua recete scoperta ha messo i evideza u meccaismo che matiee le catee i soluzioe. I globuli rossi producoo ua proteia di 11 kd, deomiata proteia stabilizzate l -emoglobia (AHSP). Il complesso è solubile. La struttura cristallia del complesso tra l AHSP e l -emoglobia mostra che l AHSP iteragisce sulla stessa faccia dell emoglobia, dove iteragisce la -emoglobia (figura A27). L AHSP si lega sia alla forma deossigeata sia alla forma ossigeata della catea. el complesso co l ossigeo legato è l istidia distale, aziché l istidia prossimale, che lega l ossigeo. L AHSP ha la fuzioe di legare l -emoglobia, ma mao che questa viee sitetizzata. Ivece la -emoglobia, ma mao che viee prodotta, sposta l AHSP, perché il complesso dimerico -emoglobia -emoglobia è più stabile del complesso -emoglobia AHSP. Quidi l AHSP previee l accumulo e la precipitazioe dell -emoglobia libera. Soo i corso ricerche itese a verificare se le mutazioi del gee che codifica l AHSP giocao u ruolo el modulare la gravità della -talassemia.

15 Il geoma umao codifica ache per altre globie I aggiuta a quelli per la mioglobia, per l emoglobia e per la -emoglobia, il geoma umao aploide cotiee altri gei per le globie? Abbiamo già parlato dell emoglobia fetale, che cotiee ua catea al posto della catea. Ma durate lo sviluppo vegoo espressi gei che codificao per altri tipi di subuità emoglobiiche, ote come catea, catea e catea. Il recete sequeziameto del geoma umao ha rivelato la preseza di altre due globie. Etrambe soo proteie moomeriche, quidi più somigliati alla mioglobia che all emoglobia. La prima, deomiata euroglobia, viee espressa soprattutto el sistema ervoso cetrale, e i particolare ella retia. La euroglobia potrebbe avere u ruolo protettivo cotro l ipossia (apporto isufficiete di ossigeo). La secoda, deomiata citoglobia, ha ua distribuzioe più ampia. Studi strutturali e spettroscopici hao rivelato che ella euroglobia e ella citoglobia sia l istidia prossimale sia l istidia distale vegoo coordiate dal ferro ella forma deossigeata; ma a seguito dell ossigeazioe l istidia distale si stacca. Ulteriori studi potrao chiarire il ruolo fuzioale di questi due membri della famiglia delle globie. A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 15 SMMARI A1 La mioglobia e l emoglobia legao l ossigeo a livello dell atomo di ferro dell eme La mioglobia è ua proteia formata i gra parte da -eliche, alle quali si lega il gruppo prostetico eme. L eme è formato da ua compoete orgaica, ua protoporfiria che a sua volta è costituita da quattro aelli pirrolici co uo ioe ferro cetrale allo stato di ossidazioe Fe 2+. ella mioglobia lo ioe ferro è coordiato co u residuo di istidia, deomiato istidia prossimale. Uo degli atomi di ossigeo della molecola biatomica 2 si lega a uo dei siti di coordiazioe dello ioe ferro. A causa del parziale trasferimeto elettroico dal ferro all ossigeo, il ferro si sposta el piao della porfiria a seguito del legame dell ossigeo. L emoglobia è formata da quattro catee polipeptidiche: due catee e due catee. gua di esse possiede ua sequeza ammioacidica simile a quella della mioglobia. Ache il loro avvolgimeto spaziale, a formare ua struttura tridimesioale, è simile a quello della mioglobia. Il tetramero dell emoglobia può essere cosiderato formato da due dimeri. A2 L emoglobia lega l ossigeo co u meccaismo cooperativo La curva di ossigeazioe della mioglobia descrive u semplice processo di equilibrio. La mioglobia si satura per il 50% a ua pressioe parziale di ossigeo di circa 2 Torr. La curva di saturazioe dell ossigeo dell emoglobia ha forma a «S» (sigmoidale), idicado che l ossigeo si lega i modo cooperativo. Il legame dell ossigeo a uo dei siti di legame del tetramero emoglobiico iflueza l affiità per l ossigeo degli altri siti. La cooperatività del legame e del rilascio dell ossigeo aumeta sigificativamete l efficieza del trasporto. Ifatti l etità del trasporto dell ossigeo dai polmoi (dove la pressioe parziale dell ossigeo è di 100 Torr) ai tessuti (dove la pressioe parziale è di 20 Torr) è pari al 66% della potezialità massima (i altri termii, il 66% dell ossigeo presete ell ossiemoglobia formatasi ei polmoi viee rilasciato ei tessuti). Se la mioglobia fosse stata scelta per trasportare l ossigeo, l etità del trasporto sarebbe solo del 7%. La struttura quateraria dell emoglobia cambia a seguito del legame co l ossigeo. Quella della deossiemoglobia viee deomiata stato T. Quella dell ossiemoglobia viee deomiata stato R. I due dimeri ruotao approssimativamete di 15 l uo rispetto all altro durate la trasizioe dallo stato T allo stato R. La cooperatività della curva di ossigeazioe può essere spiegata ricorredo al modello cocertato o al modello sequeziale. el modello cocertato, ciascua molecola di emoglobia assume o lo stato T, o lo stato R; l equilibrio tra i due stati è determiato dal umero di siti di legame occupati dall ossigeo. Il modello sequeziale, ivece, ammette l esisteza di strutture ibride itermedie. I cambiameti strutturali che avvegoo a livello del ferro legato alla porfiria i risposta al legame dell ossigeo vegoo trasmessi all iterfaccia tra i due dimeri, ifluezado l equilibrio tra lo stato T e lo stato R. I globuli rossi cotegoo u trioso fosfato, il 2,3-bisfosfoglicerato, a ua cocetrazioe approssimativamete uguale a quella dell emoglobia. Il 2,3-BPG si lega saldamete allo stato T, ma o allo stato R, stabilizzadolo, e dimiuedo l affiità per l ossigeo dell emoglobia. L emoglobia fetale lega l ossigeo meglio dell emoglobia dell adulto, perché lega il 2,3-BPG più debolmete. Questa differeza tra le due emoglobie permette all ossigeo di passare dal sague matero a quello fetale. A3 Gli ioi idrogeo e il biossido di carboio promuovoo il rilascio dell ossigeo: l effetto Bohr L affiità dell emoglobia per l ossigeo è fortemete ifluezata dal ph e dalla preseza di biossido di carboio, u feomeo oto come effetto Bohr. L aumeto della cocetrazioe degli ioi idrogeo, cioè la dimiuzioe del ph, dimiuisce l affiità per l ossigeo dell emoglobia, a causa della protoazioe di alcui residui di istidia. Ua volta protoati, i residui di istidia cotribuiscoo a stabilizzare lo statot. L aumeto della cocetrazioe del biossido di carboio dimiuisce l affiità per l ossigeo dell emoglobia attraverso due meccaismi. Il biossido di carboio viee covertito i acido carboico, che a sua volta abbassa l affiità per l ossigeo dell emoglobia dimiuedo il ph itraeritrocitario. ppure si lega ai gruppi ammiotermiali dell emoglobia, formado residui di carbammato. Le cariche egative del carbammato stabilizzao la deossiemoglobia per mezzo di iterazioi ioiche. Poiché gli ioi idrogeo e il biossido di carboio si producoo attivamete ei tessuti a rapido metabolismo, l effetto Bohr favorisce il rilascio dell ossigeo ei distretti dove ce è più bisogo.

16 16 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia A4 Le mutazioi dei gei che codificao per le subuità dell emoglobia soo resposabili di alcue malattie L aemia a cellule falciformi è causata dalla sostituzioe di u residuo di glutammato co uo di valia ella catea dell emoglobia. Si geera così ua zoa idrofoba sulla superficie della deossiemoglobia (stato T), che provoca la formazioe di polimeri fibrosi. Le fibre alterao la forma dei globuli rossi, coferedo loro u aspetto a falce. L aemia a cellule falciformi è stata la prima malattia di cui è stato possibile ricodurre l isorgeza a u cambiameto ella sequeza ammioacidica di ua proteia. Le varie forme di talassemia soo causate da ua ridotta produzioe della catea o della catea dell emoglobia. Vegoo prodotti tetrametri emoglobiici coteeti u solo tipo di subuità. Tali tetrametri soo caratterizzati da ua dimiuita capacità di rilascio dell ossigeo e da ua bassa solubilità, che provocao la lisi dei globuli rossi durate il loro sviluppo. I precursori dei globuli rossi ormalmete producoo u lieve eccesso di catee rispetto alle catee. Per preveire l aggregazioe, essi producoo ua proteia stabilizzate l -emoglobia, che si lega specificamete ai moomeri, formado u complesso solubile. APPEDICE Si possoo proporre modelli di legame di tipo cooperativo i termii quatitativi: il grafico di Hill e il modello cocertato Il grafico di Hill U modo utile per descrivere quatitativamete il legame di tipo cooperativo, com è quello dell emoglobia, è stato sviluppato da Archibald Hill el Cosideriamo l ipotetico equilibrio tra ua proteia X e u ligado S: X + S X(S) (1) dove è ua variabile che può assumere valori iteri o frazioari. Il parametro è ua misura del grado di cooperatività del legame di S, ache se l equazioe 1 o si riferisce a u vero e proprio processo fisico. Per X = emoglobia e S = 2, il massimo valore che può assumere è 4. Questo valore potrebbe essere raggiuto se il legame dell ossigeo co l emoglobia fosse completamete cooperativo, cioè se la cooperatività fosse la massima possibile. Se ivece il legame dell ossigeo fosse totalmete o cooperativo, il valore di sarebbe 1. Aalizzado l equilibrio della reazioe 1, si ottiee la seguete espressioe per la saturazioe frazioale, Y: [ S] Y = [ S] + [ S 50 ] dove [S 50 ] è la cocetrazioe alla quale la saturazioe del ligado X è pari al 50% (X è saturato per metà). Per l emoglobia l espressioe diveta dove P 50 è la pressioe parziale di ossigeo alla quale l emoglobia è saturata per metà. L espressioe può essere così riordiata: pertato p 2 Y = p + P Y 1 Y Y p 2 log log log( p ) 1 Y = P = 2 log( P 50 ) p = P 2 50 Questa equazioe predice che, riportado i u grafico log(y/1 Y ) i fuzioe di log(p 50 ) (grafico di Hill ), si otterrà ua retta, la cui pedeza è. I grafici di Hill per la mioglobia e per l emoglobia soo riportati ella figura A28. Il grafico di Hill risulta lieare per la mioglobia, co ua pedeza pari a 1. Per l emoglobia, ivece, il grafico o è completamete lieare, perché la reazioe di equilibrio su cui si basa il grafico di Hill o è pieamete corretta. Il grafico è comuque approssimativamete lieare ella sua porzioe mediaa, dove la pedeza è pari a 2,8. La pedeza, spesso deomiata coefficiete di Hill, è ua misura del grado di cooperatività di 3 Mioglobia 3 Emoglobia = 1 Y log ( ) 1 Y 0 1 Y log ( ) 1 Y 0 1 = 2, Figura A28 Grafico di Hill per la mioglobia e per l emoglobia log ( p 2 ) log ( p 2 )

17 legame dell ossigeo. L utilità del grafico di Hill sta el fatto che esso forisce u idea quatitativa del grado di cooperatività di legame. Utilizzado l equazioe di Hill, e poedo il valore del coefficiete di Hill pari a 2,8, si ottiee ua curva che rassomiglia molto a quella dell emoglobia (figura A29). Il modello cocertato Il modello cocertato può essere trattato i termii quatitativi. Soo richiesti solo quattro parametri: (1) il umero dei siti di legame ella proteia (si assume che siao equivaleti), (2) il rapporto tra le cocetrazioi degli stati T e R i asseza di ligadi, (3) l affiità per i ligadi dei siti della proteia allo stato R, e (4) ua misura del rapporto tra l affiità per i ligadi della proteia allo stato R e l affiità per i ligadi della proteia allo stato T. Il umero dei siti di legame,, può essere ricavato da altre iformazioi. Per l emoglobia, = 4. Il rapporto tra le cocetrazioi degli stati T e R i asseza di ligadi è ua costate: L = [T 0 ]/[R 0 ] dove il pedice si riferisce al umero dei ligadi preseti (i questo caso, zero). L affiità per l ossigeo delle subuità ello stato R può essere valutata dal valore della costate di dissociazioe della reazioe di legame dell ossigeo a u sigolo sito dello stato R, K R. Allo stesso modo l affiità per l ossigeo delle subuità ello stato T, può essere valutata dal valore della costate di dissociazioe della reazioe di legame dell ossigeo a u sigolo sito dello stato T, K T. Defiiremo il rapporto tra queste due costati come c = K R /K T Questo rapporto è ua misura di quato più fortemete ua sigola subuità di ua proteia allo stato R (subuità R) lega il ligado rispetto a ua subuità della proteia allo stato T (subuità T). Si oti che c < 1, perché K R e K T soo costati di dissociazioe, e u legame forte corrispode a u basso valore della costate di dissociazioe. Qual è il rapporto tra la cocetrazioe di ua proteia allo stato T co u sito occupato da u ligado e la cocetrazioe della proteia allo stato R co u sito occupato da u ligado? Idichiamo la costate di dissociazioe per u sigolo sito ello stato R co K R. Per ua proteia co siti vi soo possibili siti dove il primo ligado può legarsi. Questo fattore statistico favorisce il legame del ligado a ua proteia co siti rispetto a ua proteia co u sigolo sito. Pertato [R 1 ] = [R 0 ][S]/K R. Aalogamete [T 1 ] = [T 0 ][S]/K T. Quidi [ T0 ][ S] [ T ] [ T ] 1 K T 0 = = = cl [ R ] [ R ][ S] 1 0 K R [ R 0] K K R Ua simile aalisi rivela che, per stati co i ligadi legati, [T i ]/[R i ] = c i L. I altre parole, il rapporto tra la cocetrazioe dello stato T e la cocetrazioe dello stato R viee ridotta di u fattore pari a c per ogi ligado legato. Defiiamo ora ua scala coveiete per la cocetrazioe di S: = [S]/K R Questa defiizioe è utile, perché è il rapporto tra la cocetrazioe di S e la costate di dissociazioe che determia l estesioe del legame. Utilizzado questa defiizioe si vede che T Y (saturazioe frazioale) 0,8 0,6 0,4 0,2 = 4 Aalogamete, = 2,8 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 17 = p 2 (Torr) [ R0][ S] [ R1] = = [ R 0] K [ T0 ][ S] [ T1 ] = = cl[ R 0] K Qual è la cocetrazioe delle molecole allo stato R co due ligadi legati? Di uovo dobbiamo cosiderare il fattore statistico, cioè il umero di modi i cui u secodo ligado può legarsi a ua molecola co u sito occupato. Questo umero è 1, che però va diviso per 2, perché o importa quale sia il «primo» e quale il «secodo» ligado. Quidi 1 [ R1][ S] 2 [ R 2] = K R 1 = [ R1] 2 1 = 0 2 ([ R ]) 1 = [ R ] Possiamo derivare simili equazioi el caso di i ligadi che si legao allo stato T. Possiamo ora calcolare la saturazioe frazioale, Y. Questa può essere cosiderata come la cocetrazioe dei siti co il ligado legato divisa per la cocetrazioe di tutti i poteziali siti di legame. Quidi, ([ R1] + [ T1]) + 2([ R ] + [ T ]) ([ R] + [ T]) Y = ( [ R ] + [ T ] + [ R ] + [ T ]) + + ([ R ] + [ T ]) Sostituedo i questa equazioe, troviamo ( + c + 1) [ R 0] [ T 0] 2 [ R 0 ] 2 2 ( ) c2[ T 2 0] + + [ R 0] + c[ T0] ) 2 Y = ([ R ] + [ T ] + [ R ] + c[ T ] + + [ R ] + c[ T ] Sostituedo [T 0 ] = L[R 0 ] e sommado, si ottiee T R Figura A29 Curve di ossigeazioe corrispodeti ad alcui valori del coefficiete di Hill La curva co umero di Hill pari a 2,8 ( = 2,8) è molto simile a quella dell emoglobia.

18 18 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Frazioe 0,8 0,6 0,4 T 0 Y R 4 T 0,2 1 R 3 T R p 2 (Torr) Figura A30 Curve di legame dell ossigeo basate sul modello cocertato Saturazioe frazioale (Y ) i fuzioe di p 2 : L = 9000; c = 14; e K R = 2,5 Torr. Vegoo mostrate la frazioe di molecole allo stato T, co zero, ua e due molecole di ossigeo legate (T 0, T 1 e T 2 ) e la frazioe di molecole allo stato R co due, tre e quattro molecole di ossigeo legate (R 2, R 3 e R 4 ). Il valori delle frazioi di molecole i altre forme (T 3 e T 4, R 0 e R 1 ) soo troppo bassi per poter essere mostrati. ( 1+ ) + Lc ( 1+ c ) Y = ( 1+ ) + L( 1+ c ) 1 1 Possiamo ora utilizzare questa equazioe per verificare se è i accordo co la curva di ossigeazioe dell emoglobia, utilizzado diversi valori per i parametri L, c e K R (co = 4). Ua eccellete corrispodeza si ottiee poedo L = 9000, c = 14 e K R = 2,5 Torr (figura A30). Isieme co la saturazioe frazioale, vegoo ache mostrate le cocetrazioi delle specie T 0, T 1, T 2, R 2, R 3 e R 4. Le cocetrazioi delle altre specie soo molto basse. La possibilità di otteere iformazioi sulle cocetrazioi delle sigole specie costituisce u importate differeza tra l equazioe di Hill e l aalisi del modello cocertato. L equazioe di Hill forisce soltato il valore della saturazioe frazioale, metre l aalisi del modello cocertato forisce i valori delle cocetrazioi delle sigole specie. el ostro caso l aalisi forisce il valore del rapporto tra le cocetrazioi dello stato T e dello stato R a ogi stato di legame. Il rapporto varia da 9000 a 126 a 1,76 a 25 a 0035, quado soo legate zero, ua, due, tre o quattro molecole di ossigeo. Il rapporto costituisce ua misura quatitativa della popolazioe di molecole di emoglobia che passa dalla stato T allo stato R. Ache il modello sequeziale può essere formulato i termii quatitativi. Però la formulazioe richiede più parametri, e ioltre, ache utilizzado diversi set di parametri, si ottegoo spesso curve teoriche che descrivoo bee la curva sperimetale di saturazioe dell ossigeo. TERMII CHIAVE aemia a cellule falciformi (p. 12) aidrasi carboica (p. 10) aioe superossido (p. 3) 2,3-bisfofoglicerato (p. 8) carbammato (p. 11) catea (p. 4) catea (p. 4) citoglobia (p. 15) coefficiete di Hill (p. 16) curva di legame dell ossigeo (p. 4) dimero (p. 4) effetto Bohr (p. 10) eme (p. 2) emoglobia fetale (p. 9) emoglobia H (p. 13) emoglobia S (p. 12) grafico di Hill (p. 16) istidia distale (p. 3) istidia prossimale (p. 2) malaria (p. 13) metmioglobia (p. 3) modello cocertato (modello MWC) (p. 7) modello sequeziale (p. 7) euroglobia (p. 15) pressioe parziale (p. 4) proteia stabilizzate l -emoglobia (AHSP) (p. 14) protoporfiria (p. 2) ripiegameto globiico (p. 4) risoaza magetica ucleare per immagii (fmri) (p. 3) saturazioe frazioale (p. 4) sigmoide (p. 5) stato R (p. 6) stato T (p. 6) talassemia (p. 13) talassemia maggiore (morbo di Cooley) (p. 13) LETTURE CSIGLIATE Da dove comiciare Perutz, M. F. (1978). Hemoglobi strucure ad respiratory trasport. Sci. Am. 239(6): Perutz, M. F. (1980). Stereochemical mechaism of oxyge trasport by haemoglobi. Proc. R. Soc. Lod. Biol. Sci. 208: Kilmarti, J. V. (1976). Iteractio of haemoglobi with protos, C 2, ad 2,3-diphosphoglycerate. Brit. Med. Bull. 32: Struttura Kedrew, J. C., Bodo, G., Ditzis, H. M., Parrish, R. G., Wyckoff, H., Phillips, D. C. (1958). A three-dimesioal model of the myoglobi molecule obtaied by x-ray aalysis. ature 181: Shaaa, B. (1983). Structure of huma oxyhaemoglobi at 2.1 Å resolutio. J. Mol. Biol. 171: Frier, J. A., Perutz, M. F. (1977). Structure of huma foetal deoxyhaemoglobi. J. Mol. Biol. 112: Perutz, M. F. (1969). Structure ad fuctio of haemoglobi. Harvey Lect. 63: Perutz, M. F. (1962). Relatio betwee structure ad sequece of haemoglobi. ature 194:

19 Iterazioe dell emoglobia co gli effettori allosterici Beesch, R., Beesch, R. E. (1969). Itracellular orgaic phosphates as regulators of oxyge release by haemoglobi. ature 221: Fag. T. Y., Zou, M., Simplaceau, V., Ho,. T., Ho, C. (1999). Assessmet of roles of surface histidyl residues i the molecular basis of the Bohr effect ad of 143 histidie i the bidig of 2,3-bisphosphoglycerate i huma ormal adult haemoglobi. Biochemistry 38: Aroe, A. (1992). X-ray diffractio study of bidig of 2,3-diphosphoglycerate to huma deoxyhaemoglobi. ature 237: Modelli di cooperatività Mood, J., Wyma, J., Chageux, J. P. (1965). the ature of allosteric iteractios: A plausible model. J. Mol. Biol. 12: Koshlad, D. L., Jr., emethy, G., Filmer, D. (1966). Compariso of experimetal bidig data ad theoretical models i proteis cotaiig subuits. Biochemistry 5: Ackers, G. K., Doyle, M. L., Myers, D., Daugherty, M. A. (1992). Molecular code for cooperativity i haemoglobi. Sciece 255: Aemia a cellule falciformi e talassemia Herrick, J. B. (1910). Peculiar elogated ad sickle-shaped red blood corpuscles i a case of severe aemia. Arch. Iter. Med. 6: Paulig, L., Itao, H. A., Siger, S. J., Wells, L. C. (1949). Sickle cell aemia: A molecular disease. Sciece 110: Igram, V. M. (1957). Gee mutatio i huma haemoglobi: The chemical differece betwee ormal ad sickle cell haemoglobi. ature 180: A. Ua proteia i azioe: l emoglobia 19 Eato, W. A., Hofrichter, J. (1990). Sickle cell haemoglobi polymerizatio. Adv. Prot. Chem. 40: Weatherall, D. J. (2001). Pheotype geotype relatioships i moogeic disease: Lessos from the thalassemias. at. Rev. Geet. 2: Altre globie e proteie legati le globie Kihm, A. J., Kog, Y., Hog, W., Russell, J. E., Rouda, S., Adachi, K., Simo, M. C., Blobel, G. A., Weiss, M. J. (2002). A abudat erythroid protei that stabilizes free -haemoglobi. ature 417: Feg, L., Zhou, S., Gu, L., Gell, D. A., Mackay, J. P., Weiss, M. J., Gow, A. J., Shi, Y. (2005). Structure of oxidized -haemoglobi boud to AHSP reveals a protective mechaism for haem. ature 435: Burmester, T., Haberkamp, M., Mitz, S., Roeser, A., Schmidt, M., Eber, B., Gerlach, F., Fuchs, C., Hakel, T. (2004). euroglobi ad cytoglobi: Gees, proteis ad evolutio. IUBMB Life 56: Hakel, T., Eber, B., Fuchs, C., Gerlach, F., Haberkamp, M., Laufs, T. L., Roeser, A., Schmidt, M., Weich, B., Wystub, S., Saaler-Reihardt, S., Reuss, S., Bologesi, M., De Sactis, D., Marde, M. C., Kiger, L., Moes, L., Dewilde, S., evo, E., Avivi, A., Weber, R. E., Fago, A., Burmester, T. (2005), euroglobi ad cytoglobi i search of their role i tehe vertebrate globi family. J. Iorg. Biochem. 99: Burmester, T., Eber, B., Weich, B., Hakel, T. (2002) Cytoglobi: A ovel globi type ubiquitously expressed i vertebrate tissues. Mol. Biol. Evol. 19: Zhag, C., Wag, C., Deg, M., Li, L., Wag, H., Fa, M., Xu, W., Meg, F., Qia, L., He, F. (2002). Full-legth cda cloig of huma euroglobi ad tissue expressio of a rat euroglobi. Biochem. Biophys. Res. Commu. 290: PRBLEMI 1. Esplorado la biosfera. La prima struttura proteica che è stata determiata è quella della mioglobia di capodoglio. Perché il muscolo di capodoglio è ua sorgete ricca i mioglobia? 2. Trasporto dell ossigeo ad alta quota. Immagiate di stare scalado ua motaga e che la pressioe parziale dell ossigeo sia ridotta a 75 Torr. Calcolate la percetuale della capacità di trasporto dell ossigeo, assumedo che il valore del ph, sia dei tessuti sia del sague, sia 7,4 e che la cocetrazioe dell ossigeo ei tessuti sia di 20 Torr. 3. Adattameto alle alte quote. Dopo u periodo di uo o più giori ad alta quota (dove la pressioe parziale dell ossigeo è pari a 75 Torr), la cocetrazioe del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) aumeta ei globuli rossi. Qual è l effetto dell aumeto della cocetrazioe del 2,3-BPG sulla curva di ossigeazioe dell emoglobia? E perché tale aumeto favorisce l adattameto alle alte quote? 4. U altro trasportatore di ossigeo. Gli artropodi, come le aragoste, possiedoo trasportatori di ossigeo che differiscoo ettamete dall emoglobia. Il loro fuzioameto o è basato sulla preseza dell eme, ma su quella di composti che foriscoo ua coppia di ioi rame(i). Le variazioi strutturali che accompagao il legame dell ossigeo vegoo mostrate qui sotto. Come potrebbero essere utilizzate per facilitare il legame cooperativo dell ossigeo? H H H H H Cu Cu H 2 H Cu Cu H H H H H

20 20 A. Ua proteia i azioe: l emoglobia Ua discoessioe. Usado la tecica della mutageesi mirata è stata otteuta ua emoglobia i cui i residui di istidia prossimale di ambedue le catee e soo sostituiti co u residuo di glicia. L aello imidazolico dell istidia può essere rimpiazzato, aggiugedo imidazolo libero i soluzioe. Vi aspettate che ua emoglobia così modificata mostri cooperatività per il legame co l ossigeo? Spiegate la vostra risposta. H 3 C H3 C H 3 C CH3 CH 3 H CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C H 3 C CH 3 CH 3 H 6. Sostituzioi efficaci. I globuli rossi di alcui uccelli o cotegoo 2,3-bisfosfoglicerato. Tra i composti idicati qui sotto (ad), quale pesate che potrebbe svolgere lo stesso ruolo del 2,3-bisfosfoglicerato? Spiegate brevemete perché. H lmidazolo H Fe H (a) H + CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Complesso porfiriico «a palizzata» (b) H 2 (c) 3 P 3 P 7. Curve teoriche. (a) Servedovi dell equazioe di Hill, disegate la curva di ossigeazioe di ua ipotetica emoglobia dimerica, co = 1,8 e P 50 = 10 Torr. (b) Ripetete utilizzado il modello cocertato co = 2, L = 10000, c = 1, e K R = 10 Torr. 8. Effetto dei parassiti. Il metabolismo del P. falciparum ei globuli rossi produce sostaze acide. Quale effetto potrebbe avere la preseza di acidi sulla capacità di trasportare l ossigeo dei globuli rossi? E sulla possibilità di formare cellule falciformi? 9. La porfiria «a palizzata». Se l eme libero viee esposto all ossigeo, si forma rapidamete e irreversibilmete ua specie dimerica dell eme, coteete u pote ossigeo. 2 Fe 2 Eme Colia 3 P H H Iositolo petafosfato P 3 P 3 Spermia H H 2 1/ 2 2 Fe 3 Fe 3 Dimero Idolo I chimici hao progettato e sitetizzato uo speciale derivato dell eme, costituito da ua porfiria cosiddetta «a palizzata», che lega reversibilmete l ossigeo, seza formare specie dimeriche. (d) H Su che base è stata progettata la molecola, e quale potrebbe essere ua possibile spiegazioe della reversibilità del legame co l ossigeo? Problema sull iterpretazioe dei dati 10. ssigeazioe di ua emoglobia primordiale. Le lamprede soo orgaismi primitivi, i cui ateati si differeziaroo dagli ateati dei pesci e dei mammiferi circa 400 milioi di ai fa. Il sague delle lamprede cotiee ua emoglobia correlata strutturalmete co l emoglobia dei mammiferi. Però l emoglobia delle lamprede è moomerica allo stato ossigeato. I dati di ossigeazioe per l emoglobia delle lamprede soo i segueti: p 2 Y p 2 Y p 2 Y 0, ,0 0, ,889 0, ,0 0, ,905 0, ,0 0, ,917 0, ,0 0, ,927 0, ,5 0, ,935 0, , ,941 0, ,0 0, ,960 0, , ,970 0, , ,865 (a) Riportate i dati i u grafico per ricavare la curva di ossigezioe. A che pressioe parziale di ossigeo corrispode il 50% di saturazioe? sservado la curva si può giudicare se il legame è di tipo cooperativo? (b) Costruite u grafico di Hill utilizzado i dati della tabella. Si può cocludere che il legame dell ossigeo è di tipo cooperativo? Che cos è il grafico di Hill? (c) Ulteriori studi hao rivelato che l emoglobia delle lamprede allo stato deossigeato forma oligomeri, soprattutto dimeri. Propoete u modello che spieghi la cooperatività che si osserva ell emoglobia di lampreda.

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